全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:2109-2115，2133
文章编号:1001-6880(2015)12-2109-08
收稿日期:2015-06-29 接受日期:2015-10-10
* 通讯作者 E-mail:yanyy75@ 163． com
火棘不可萃取多酚的提取工艺优化及抗氧化研究
许盈芃1，刘 顺1，李楚楚1，方天润1，邱 凡1，陈西喆2，鄢又玉1*
1武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023;2 湖北神农蜂语生物产业有限公司，十堰 442000
摘 要:采用响应面法优化了火棘不可萃取多酚(non-extractable polyphenol，NEPP)的提取工艺，分析了火棘中
可萃取多酚(extractable polyphenol，EPP)和不可萃取多酚分别占总酚(total polyphenol，TEPP)的比例，同时监测
了 NEPP萃取液的抗氧化能力。以 NEPP得率为评价指标，采用 Folin-Ciocalteu法测定 NEPP含量。考察了乙醇
浓度(%，v /v)、乙醇占乙醇-硫酸提取液的比率(%，v /v)、料液比(g /mL)、提取时间(h)及提取温度(℃)对火棘
NEPP得率的影响。进一步通过 Box-Behnken设计优化提取工艺，同时以 ABTS及 FＲAP法对 NEPP提取液的抗
氧化能力进行测定。最佳提取工艺为:提取时间 2． 68 h，乙醇浓度 94． 44%(V/V)，温度 83． 47 ℃，NEPP萃取量
可达 167． 328 mg /g，EPP 40． 4 mg /g。响应面模型优化火棘 NEPP提取工艺结果可靠，NEPP占火棘 TEPP比重较
高，为 80． 55%，ABTS及 FＲAP抗氧化能力均与 NEPP含量呈良好正相关性。
关键词:火棘;不可萃取多酚;响应面法;抗氧化
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 12． 021
Extraction and Antioxidant Activity of Non-extractable
Polyphenols from Pyracantha fortuneana
XU Ying-peng1，LIU Shun1，LI Chu-chu1，FANG Tian-run1，QIU Fan1，CHEN Xi-zhe2，YAN You-yu1*
1College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Hubei Wuhan 430023，China;
2Hubei Shennong Honey Bio-Tech． Co．，Ltd．，Hubei Shiyan 442000，China
Abstract:The extraction process of non-extractable polyphenols (NEPPs)from Pyracantha fortuneana was optimized by
response surface methodology (ＲSM)． The content and antioxidant capacity of NEPP was determined． Taking extraction
yield of NEPP as evaluation index and Folin-Ciocalteu colorimetry as assay method，on the basis of single factor experi-
ments，the effects of ethanol concentration (%，v /v)，the proportion of ethanol in sulfuric acid-ethanol (%，v /v) ，solid
to liquid ratio (g /mL) ，extraction time (h)and temperature (℃)on the NEPP yield was investigated． In addition，
Box-Behnken design was further adopted to optimize extraction process of NEPP from P． fortuneana． Moreover，the an-
tioxidant capacity of the extracted NEPP was determined by ABTS and FＲAP assays． The optimal extraction conditions
was as follows:extraction time of 2． 68 h;the volume fraction of ethanol，94． 44% (v /v) ;extraction temperature of 83． 47
℃ ． Under these conditions，the extraction yield of NEPP and EPP reached 167． 328 mg /g and 40． 4 mg /g，respectively．
ＲSM was feasible to optimize extraction process of NEPP from P． fortuneana． NEPP accounted for a high proportion of
80． 55% in TEPP and the NEPP content had positive correlation with its antioxidant capacity．
Key words:Pyracantha fortuneana;non-extractable polyphenols;response surface methodology;antioxidant
火棘(Pyracantha fortuneana)是蔷薇科火棘属
植物，其果又名将军粮、救军粮、赤阳子、红果等，广
泛分布于我国湖南、湖北、陕西及西南诸省。在传统
中医中，火棘果常被用于治疗消化不良［1］，现代研
究发现火棘果提取物可抑制酪氨酸酶活性，减少黑
色素的生成，在日本已作为增白剂用于化妆品
中［2］，然而目前我国对火棘资源的开发不够深入，
每年大量的野生火棘资源被白白浪费。
多酚类化合物是指分子结构中有若干酚性羟基
的植物成分的总称，包括黄酮类、单宁类、酚酸类以
及花色苷类等［3］。植物来源的多酚类化合物具有
抗氧化［4］、抗菌抗病毒［5］、抗肿瘤癌变［6］、抗肥
胖［7］、降血糖［8］、降血脂［9］、抗心血管疾病［10］等广
泛的生理活性和药理活性。总酚(total polyphenol，
TEPP)分为可萃取多酚(EPP)和不可萃取多酚
(NEPP)两部分［11］。可萃取多酚主要是指通过简单
的有机-水相溶剂萃取就可以获得的处于游离状态
的多酚，而不可萃取多酚主要是指结合于细胞壁上
的一些水合单宁酸和原花青素类，需通过化学或与
细胞壁相关的酶处理，破坏多酚物质与细胞壁结合
的化学键，才能将其分离［12］。有研究表明，不可萃
取原花青素可用硫酸从残渣中水解而得［13］，不可萃
取多酚的含量在多种植物资源中远高于可萃取多
酚，在抗氧化方面的作用远大于可萃取多酚［14，15］，
它们在食品、保健尤其是胃肠健康方面具有广阔的
应用前景［16］。但目前国内研究主要集中在几种特
色资源的可萃取多酚提取及功效研究方面，而不可
萃取多酚的研究文献甚少。
本实验重点旨在优化火棘不可萃取多酚的提取
工艺，以提取可萃取多酚的火棘果残渣为原料，采用
Folin-ciocalteu 法测定多酚含量［17］，辅助 ABTS
法［18］和 FＲAP法［19］对不可萃取多酚进行快速抗氧
化能力测定。在单因素试验基础上进一步通过
Box-Behnken响应面设计，优化得到 NEPP提取的最
优工艺。以期为未来火棘产业化深加工提供理论依
据及开发方向。
1 材料与方法
1． 1 材料试剂与仪器
火棘果，2014 年 11 月中旬采自湖北恩施来凤
地区，经华中科技大学植物学博士杨悦鉴定为全缘
火棘 Pyracantha atalantioides 的果实;无水乙醇、浓
H2SO4、无水 Na2CO3 均为分析纯，上海国药集团化
学试剂公司;Folin-ciocalteu 试剂，Sigma 分装，上海
北诺生物科技有限公司;没食子酸标准品(中国药
品生物制品检定所，批号:110831-201403);总抗氧
化能力检测试剂盒(FＲAP 法)、总抗氧化能力试剂
盒(ABTS 法)，江苏省碧云天生物技术研究所;
Lambda 25 紫外-可见光分光光度计，美国 PE 公司;
DF-101B集热式磁力加热搅拌器，金坛市医疗仪器
厂;Centrifuge 5424Ｒ 型台式高速冷冻离心机，德国
Eppendorf公司;Molelement1018a 型摩尔超纯水机，
上海摩勒科学仪器有限公司;Anke LXJ-Π B 型低速
大容量离心机，上海安亭科学仪器厂;BS 系列电子
天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;SB5200DTS
双频超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公
司。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 没食子酸标准曲线的建立
准确称取 0． 05 g没食子酸标准品，加蒸馏水溶
解后转移到 100 mL 容量瓶中定容，分别取 0． 5 g /L
没食子酸标准溶液 2、4、6、8、10、12、14 mL 加入到 7
个 100 mL容量瓶中，加水定容。各吸取 1 mL 置于
10 mL试管中，分别加入 Folin-ciocalteu 试剂 5 mL，
漩涡混匀后静置 3 min，再分别加入 170 g /L Na2CO3
溶液 1． 0 mL，混匀后置于 34 ℃恒温水浴中反应 40
min;同时做空白对照，于 765 nm 波长处测定吸光
度。
1． 2． 2 火棘 EPP的去除及 NEPP的提取
称取一定量干燥粉碎过 20 目筛的火棘果粉，按
料液比 1∶ 10 g /mL 加入 90%(V /V)乙醇，90 ℃下回
流提取 1 h，过滤，滤渣重复提取 2 次，合并 3 次滤
液，4 ℃条件下 10000 rpm 离心 20 min 以待后续
EPP含量测定(因 3 次提取后滤液中 EPP 含量甚
微，可忽略，故前 3 次提取合并滤液中 EPP 可近似
看做原料中总的 EPP)。提取后的滤渣置 80 ℃烘箱
干燥，粉碎，过 20 目筛。
去除 EPP 的火棘果粉→加入乙醇-硫酸提取溶
剂→水浴回流提取→冷水冷却→10000 rpm离心 15
min→上清液中 NEPP含量的测定。
1． 2． 3 不可萃取多酚得率的测定
采用 Folin-Ciocalteu 法测定 NEPP 含量:将 5 g
去 EPP火棘干粉处理得到的各 NEPP提取液统一稀
释至 180 mL，然后取 1 mL 再次稀释 80 倍备用，参
照 1． 2． 1 同法操作测定 NEPP 溶液吸光度，并带入
2． 1 没食子酸标准曲线关系式中进行相关换算，火
棘提取物中 NEPP 含量(%)表示为去 EPP 火棘干
粉中以没食子酸当量的 NEPP 的质量百分数。
M(%)=(y － 0． 048)× 80 × 1800． 01 × 5 × 1000 × 10 %
其中 y为 NEPP样品溶液的吸光度。
1． 2． 4 单因素试验设计
取 5． 0 g原料，以乙醇-硫酸为提取溶剂。考察
不同乙醇浓度(100%、95%、90%、85%、80%)，乙
醇-硫酸中乙醇所占比例(100%、95%、90%、85%、
80%)，料液比(1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30 g /
mL)，提取时间(1、3、5、7、9 h)，水浴温度(30、45、
60、75、90 ℃)对 NEPP 提取率的影响，结果参见图
1。
1． 2． 5 响应面实验设计
在单因素试验的基础上，固定乙醇-硫酸中乙醇
0112 天然产物研究与开发 Vol. 27
所占比例为 95%及料液比 1∶ 20 g /mL，运用 Design-
Expert 8． 0． 6 软件，根据 Box-Behnken 设计，以乙醇
浓度(X1)、提取时间(X2)、提取温度(X3)为主要考
察因素，以 NEPP得率为响应值，设计实验如下表 1。
表 1 Box-Behnken设计因素水平及编码值
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
因素
Factors
水平 Levels
-1 0 + 1
X1 提取时间
extraction time(h)
1 3 5
X2乙醇浓度
Ethanol concentration(%)
86 92 98
X3 提取温度
extraction temperature(℃)
75 85 95
1． 2． 6 抗氧化(ABTS 法及 FＲAP 法)检测方法的
建立
以实验制备的不同浓度的 NEPP 溶液为待检样
品，分别以 Trolox 和 FeSO4·7H2O 为标准物，绘制
标准曲线。具体操作参见碧云天生物技术研究所提
供的总抗氧化能力测定试剂盒(ABTS 快速法及
FＲAP法)说明书。取 10 mmol /L Trolox标准溶液用
蒸馏水稀释成 0． 15、0． 3、0． 6、0． 9、1． 2 和 1． 5 mmol /
L。在 96 孔板每个检测孔中加入 20 μL过氧化物酶
工作液。以蒸馏水为空白对照，标准曲线检测孔内
加入 10 μL 各浓度 Trolox 标准溶液，样品检测孔内
加入 10 μL 各种样品，分别混匀。每个孔内加入
170 μL ABTS 工作液，混匀，室温孵育 6 min 后在
415 nm 进行测定。另外称取 27． 8 mg FeSO4 ·
7H2O，溶解并用蒸馏水稀释至 0． 15、0． 3、0． 6、0． 9、
1． 2 和 1． 5 mmol /L 。96 孔板的每个检测孔中加入
180 μL FＲAP工作液。蒸馏水为空白对照，标准曲
线检测孔内加入 5 μL各种浓度的 FeSO4 标准溶液，
样品检测孔内加入 5 μL各种样品，混匀，37 ℃孵育
3 ～ 5 min后在 595 nm进行测定。
2 结果与分析
2． 1 没食子酸标准曲线的建立
参照 1． 2． 1 设计测定结果，以没食子酸浓度
(X，μg /mL)对吸光度(Y)进行线性回归，得回归方
程 Y =0． 010X + 0． 048(Ｒ2 = 0． 9996)，吸光度在质
量浓度为 10 ～ 80 μg /mL间线性关系良好。
2． 2 火棘不可萃取多酚提取单因素试验
由图 1(A)可知，提高乙醇浓度有利于 NEPP的
提取，当乙醇浓度≥95%后，提取量上升趋势渐缓，
另外，出于成本经济考虑，故选择乙醇浓度 95%。
由图 1(B)可知，乙醇-硫酸中乙醇所占比例≥95%
之后，NEPP提取率开始下降，乙醇浓度低于 90%后
NEPP得率急剧下降，故乙醇-硫酸中乙醇所占比例
选为 95%比较合适。由图 1 (C)可知，料液比在 1
∶ 20 g /mL时 NEPP的提取率达到极值，继续增大料
24
23
22
21
20
19
18
17
16
80% 85% 90% 95 100
乙醇浓度
Concentration%of%ethanol(%)
25
20
15
10
24.3
24.2
24.1
24.0
23.9
23.8
23.7
23.6
10% 15% 20% 25% 3080% 85% 90% 95 100
硫酸鄄乙醇提取液中乙醇比率
Percentage%of%ethanol%in%
ethanol鄄sulfuric%acid(%)
液固比
Liquid%to%soild%ratio(mL/g)
0% 2% 4% 6% 8 10
提取时间
Time%of%extraction(h)
50% 60% 70% 80% 90
提取温度
Temperature%of%extraction(℃)
25
20
15
10
5
24
24
23
22
21
20
19
18
17
A B C
D E
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
图 1 乙醇浓度(A)、乙醇-硫酸中乙醇所占比率(B)、液料比(C)、提取时间(D)及提取温度(E)对火棘不可萃取多酚得率
的影响
Fig. 1 Effect of ethanol concentration (A)，proportion of ethanol in ethanol-sulfuric acid (B) ，liquid to solid ratio (C) ，extraction
time (D)and temperature (E)on NEPP yield of P． fortuneana
1112Vol. 27 许盈芃等:火棘不可萃取多酚的提取工艺优化及抗氧化研究
液比，NEPP得率略有下降，考虑到不增加后续浓缩
工序负担，料液比选为 1∶ 20 g /mL 比较合适。由图
1(D)可知，随着提取时间的增加，NEPP提取率先升
后降，提取时间为 3 h 时，提取率达到极值，进一步
增加提取时间，NEPP 提取率反而下降，这可能与高
温强酸条件下，提取出的 NEPP被降解破坏有关，故
选择提取时间为 3 h。由图 1(E)可知，总体上随着
温度的升高 NEPP 提取率增大，提取温度 90 ℃时，
提取率最高，温度高于 90 ℃之后，提取率反而略有
下降，这可能与 NEPP 的高温降解有关。故选择提
取温度 90 ℃左右比较合适。
2． 3 火棘不可萃取多酚提取响应面优化实验
2． 3． 1 响应面实验结果
参照 1． 2． 5 设计，得到实验结果见表 2。
表 2 Box-Behnken实验设计及结果
Table 2 Box-Benhnken experimental design and the results
序号
No．
因素与水平 Factors and levels
X1提取时间
Extraction time (h)
X2乙醇浓度
Ethanol concentration (%)
X3提取温度
Extraction temperature (℃)
不可萃取多酚得率
Yield of NEPP (%)
1 1 86 85 17． 2224
2 5 86 85 12． 9600
3 1 98 85 18． 9792
4 5 98 85 18． 5472
5 1 92 75 18． 2880
6 5 92 75 16． 8768
7 1 92 95 16． 7040
8 5 92 95 12． 9888
9 3 86 75 14． 6592
10 3 98 75 19． 2672
11 3 86 95 13． 9680
12 3 98 95 16． 9344
13 3 92 85 22． 4928
14 3 92 85 22． 0896
15 3 92 85 21． 5712
16 3 92 85 21． 5424
17 3 92 85 22． 2912
以 NEPP得率为主要响应值，将表 2 中实验数
据经过 Design-Expert 8． 0． 6 软件进行多元回归拟
合，得到回归方程:Y = 4． 40-0． 25X1 + 0． 37X2-
0. 21X3 + 0． 19X1X2-0． 12X1X3-0． 082X2X3-0． 51X
2
1-
0. 51X22-0． 65X
2
3，并对模型进行方差分析，结果见表 3。
表 3 回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis for each item of regression equation
方差来源
Source
平方和
Sum of
squares
自由度
Degree of
freedom
均方
Mean square
F值
F value
P值
P value
模型 Model 6． 598 9 0． 733 83． 348 ＜ 0． 0001＊＊＊
X1 0． 482 1 0． 482 54． 824 0． 0001＊＊＊
X2 1． 113 1 1． 113 126． 508 ＜ 0． 0001＊＊＊
X3 0． 361 1 0． 361 41． 030 0． 0004＊＊＊
X1X2 0． 147 1 0． 147 16． 6780 0． 0047＊＊
2112 天然产物研究与开发 Vol. 27
X1X3 0． 0537 1 0． 053 6． 0349 0． 0437*
X2X3 0． 027 1 0． 027 3． 064 0． 1235
X21 1． 084 1 1． 084 123． 190 ＜ 0． 0001＊＊＊
X22 1． 090 1 1． 090 123． 891 ＜ 0． 0001＊＊＊
X23 1． 7860 1 1． 786 203． 052 ＜ 0． 0001＊＊＊
残差 Ｒesidual 0． 062 7 0． 009
失拟项 Lack of Fit 0． 0312 3 0． 010387354 1． 36623955 0． 3732
纯误差 Pure Error 0． 03042 4 0． 007602879
总和 Cor Total 6． 659901042 16
Ｒ2 = 0． 9908 Ｒ2Adj = 0． 9789 Ｒ2pred = 0． 9180 Adeq Precisior = 25． 386
注:* P ＜ 0． 05 显著作用;＊＊P ＜ 0． 01 高度显著作用;＊＊＊P ＜ 0． 001 极显著作用。
Note:* P ＜ 0． 05 significant effect;＊＊P ＜ 0． 01 very significant effect;＊＊＊P ＜ 0． 001 extremely significant effect．
由表 3 可知，除了 X2X3 项表明乙醇浓度和温度
的交互作用不显著、X1X3 项表明时间和温度的交互
作用显著外，其他项均为极显著。实验选用的模型
(P ＜ 0． 001)极显著，失拟项(P ＞ 0． 05)不显著，表
明该响应面模型用于优化 NEPP 工艺是可行的。信
噪比 Adeq Precisior = 25． 386 比较高，说明该模型可
以用于预测，而模型校正判定系数 Ｒ2Adj = 0． 978 9，说
明该模型能解释 97． 89%的响应值变化。判定系数
Ｒ2 = 0． 990 8，说明模型拟合程度良好，可以使用该
模型分析和预测火棘 NEPP 的提取率，Ｒ2Pred = 0． 918
0 与 Ｒ2 = 0． 990 8 的值相差不大说明该响应面方程
无需做进一步优化。
2． 3． 2 NEPP提取工艺响应面图分析与对比
根据 2． 3． 1 所得回归方程，考察拟合响应面的
形状，绘制响应面立体分析图及相应的等高线图，结
果见图 2。各影响因素及交互作用对响应值的影响
可通过图 2 中响应面图曲面陡峭程度和等高线图中
等高线密集程度直观地反映出来。由图 2(A)可
知，乙醇浓度效应面相对更陡，等高线相对更密集。
因此乙醇浓度的影响更为显著，随着乙醇浓度增加，
NEPP得率先增后减;提取时间的影响次之;由图 2
(B)可知，提取时间效应面相对更陡，等高线相对更
密集。因此提取时间的影响更为显著，随着提取时
间增加，NEPP 得率先增后减;提取温度的影响次
之;由图 2(C)可知，乙醇浓度效应面相对更陡，等高
线相对更密集。因此乙醇浓度的影响更为显著，随
着乙醇浓度增加，NEPP 提取率先增后减;提取时间
的影响次之;NEPP 提取率随乙醇浓度的增大而增
大;提取温度的影响对比前 2 个因素相对较弱但仍
十分显著，NEPP 提取率随提取温度的升高先升后
降。从图 6(a-c)可以看出，响应面的最高点和等高
线在所选的范围内存在极值，响应面的最高点同时
也是等高线中的最小椭圆的中心点［20］。等高线均
成椭圆形说明各因素的交互作用强，也即 3 个因素
取不同的编码值对 Y的影响表现出不同的规律，对
火棘 NEPP提取率的影响显著［21］，这一结论也与表
3 方差分析结果一致。
2． 3． 3 最优提取工艺验证
在节约成本同时使 NEPP提取率尽可能高的前
提下，通过响应面模型及其软件优化得到的最佳工
艺条件为:提取时间 2． 68 h，乙醇浓度 94． 44%，水
浴温度 83． 47 ℃，此时 NEPP 提取率最大理论值为
4． 49989%。为检验该模型的可靠性，按照上述最优
方案进行 3 组平行实验。实际提取条件:提取时间
2． 7 h，乙醇浓度 95%，水浴温度 83 ℃，对 3 组结果
取平均值，所得 NEPP提取率为 4． 4294%，实际值与
预测值接近。可见此模型可靠，可用于优化火棘不
可萃取多酚提取工艺。
2． 4 NEPP抗氧化量效关系分析
参照 1． 2． 6 实验设计测定相关结果后，以
Trolox标准溶液浓度(X，mmol /L)对吸光度(Y)进
行线性回归，得回归方程 Y = -0． 000 4X + 0． 587 1
(Ｒ2 = 0． 9998)，吸光度在质量浓度为 100 ～ 1300
μg /mL 间线性关系良好。以 FeSO4 标准溶液浓度
(X，mmol /L)对吸光度(Y)进行线性回归，得回归方
程 Y =0． 1006 X + 0． 002 4(Ｒ2 = 0． 9994)。吸光度
在质量浓度为 150 ～ 1500 μg /mL间线性关系良好。
本实验主要研究任务是对火棘中不可萃取多酚
的提取工艺进行优化，在优化的同时兼测提取液总
抗氧化能力的变化。由表 2 中 17 组实验设计，我们
3112Vol. 27 许盈芃等:火棘不可萃取多酚的提取工艺优化及抗氧化研究
乙醇浓度
Concentration%
of%ethanol(%)
提取时间
Time%of%extraction(h)
提取温度
Temperature%of%
extraction(℃)
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
22
20
18
16
14
1.0
1.52.02.53.03.53.0
4.55.0 86
88 90
92 94
96
98
22
21
20
19
18
17
16
15
14
不
可
萃
取
多
酚
得
率
Yi
el
d%
of
%N
EP
P(
%
)
不
可
萃
取
多
酚
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率
Yi
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%N
EP
P(
%
) 2221
20
19
18
17
16
15
14
1.0
1.52.02.53.03.53.0
4.55.0
提取时间
Time%of%extraction(h)
75
80
85
90
95
86
88 90 92
94
96 98乙醇浓度Concentration%
of%ethanol(%)
提取温度
Temperature%of%
extraction(℃)75
80
85
90
95
98
96
94
92
90
88
86
乙
醇
浓
度
Co
nc
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tra
tio
n%
of
%et
ha
no
l(%
)
95
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提
取
温
度
Te
m
pe
ra
tu
re
%of
%ex
tra
ct
io
n(
℃
)
95
90
85
80
75
提
取
温
度
Te
m
pe
ra
tu
re
%of
%ex
tra
ct
io
n(
℃
)
1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 3.5% 4.0% 4.5% 5.0
提取时间
Time%of%extraction(h)
1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 3.5% 4.0% 4.5% 5.0
提取时间
Time%of%extraction(h)
86% 88% 90% 92% 94% 96% 98
乙醇浓度
Concentration%of%ethanol(%)
图 2 乙醇浓度和提取时间(A)、提取温度和提取时间(B)及提取温度和乙醇浓度(C)对火棘不可萃取多酚得率影响的响
应面及等高线图
Fig. 2 Ｒesponse surface plots and contour plots showing the mutual effects of ethanol concentration and extraction time (A)，extrac-
tion temperature and extraction time (B)as well as extraction temperature and ethanol concentration (C)on the extraction
yield of NEPP from P． fortuneana
分别测得 NEPP溶液吸光度并推算出其相应质量浓
度，ABTS及 FAＲP总抗氧化吸光度响应值，以 NEPP
浓度(x，mg /mL)分别对 ABTS 及 FAＲP 响应值(y)
进行线性拟合，结果参见图 3，分别得回归方程 y1 =
5． 10196x + 0． 44512(Ｒ2 = 0． 8907)，y2 = 2． 31721x +
0． 24157(Ｒ2 = 0． 8505)。分析可知 NEPP 浓度与
ABTS及 FＲAP总抗氧化能力呈现正相关，相关性良
好。
2． 5 火棘 EPP及 NEPP含量的测定
按 1． 2． 2 设计提取火棘 EPP，重复 3 组，每组重
复提取 3 次合并，按 Folin-Ciocalteu 法测定吸光度，
并带入 2． 1 没食子酸标准曲线计算出提取液中 EPP
质量浓度(μg /mL)，根据提取液体积及提取物料质
量，3 次结果取平均值，可得火棘中 EPP 含量为 40．
4 mg /g;按 2． 3． 3 响应面最优提取方案提取 3 组，同
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
0.040% 0.045% 0.050% 0.055% 0.060% 0.065% 0.070% 0.075% 0.080
不可萃取多酚的浓度
Concentration%of%NEPP(mg/mL)
图 3 不可萃取多酚浓度与抗氧化能力相关性分析
Fig. 3 Correlation analysis of NEPP and its antioxidant ca-
pacity
法算出火棘中 NEPP含量 167． 328 mg /g，因为 NEPP
提取时溶剂中加入强酸，一次提取时强酸对植物细
4112 天然产物研究与开发 Vol. 27
胞壁的破坏就相当彻底，因此一次提取的 NEPP 量
可近似看做火棘果皮肉粉中 NEPP 总量。显然，通
过计算可知，NEPP 占 TPP 总量的 80． 55%，占火棘
总酚的绝大部分，从而进一步证明优化 NEPP 的提
取工艺相当重要。
3 结论
通过单因素试验确定提取工艺中最适乙醇浓度
为 95%，提取时间 3 h，乙醇-硫酸中乙醇所占比例为
95%，料液比为 1 ∶ 20(质量浓度，g /mL)，提取温度
95 ℃。进一步应用响应面软件建立优化方案，模型
显著，最佳提取工艺条件为:提取时间 2． 68 h，乙醇
浓度 94． 44%，温度 83． 47 ℃。此时，NEPP 提取量
可达 167． 328 mg /g，EPP提取量仅为 40． 4 mg /g，NEPP
占 TEPP含量的 80． 55%，约为 EPP含量的四倍。
同时对 NEPP 与抗氧化能力进行了相关性分
析，结果表明 NEPP浓度与 ABTS及 FＲAP抗氧化能
力之间均存在良好的正相关关系，但相关性并非特
别显著，这可能是由于火棘中还含有其它具有抗氧
化能力的成分，或是不同种类的不可萃取多酚的抗
氧化能力不一而造成的，而且同一种多酚类物质对
超氧自由基和羟自由基的清除率也是不同的，这可
能与它们的结构有关［22］。因此未来我们应该进一
步深入研究火棘总酚的分类、结构及其与抗氧化功效
或其他功效之间的关系，以期推动火棘资源产业化。
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