全 文 ：［收稿日期］ 2010-05-25
［第一作者］ 何蓉蓉，讲师，研究方向:中药及天然药物药理活性，Tel:020-85227791，E-mail:rongronghe 66@ 163. com
［通讯作者］ * 栗原博，博士生导师，研究方向:中药及天然药物药理活性，Tel:020-85221352，E-mail:hiroshi_kurihara@ 163. com
火棘果实提取物的美白作用
何蓉蓉1，李维熙1，2，李怡芳1，栗原博1*
(1. 暨南大学中药及天然药物研究所，广州 510632;2. 云南中医学院中药学院，昆明 650500)
［摘要］ 目的:研究火棘 Pyracantha fortuneana (Maxim.)Li 果实提取物的美白作用并观察其对大鼠腹腔肥大细胞释放组
胺的影响，探讨可能的作用机制。方法:采用熊果苷为抑制酪氨酸酶活性的标准对照，以酪氨酸酶法探讨火棘果实提取物对酪
氨酸酶活性及 B16 细胞黑色素合成的影响，评价火棘果实提取物的美白作用。利用高效液相库仑阵列电化学检测系统
(HPLC-ECD)测定 Compound 48 /80 刺激大鼠腹腔肥大细胞释放组胺，评价火棘果实提取物对肥大细胞释放组胺的影响。结
果:火棘果实提取物对酪氨酸酶活性具有明显抑制作用，能显著减少小鼠 B16 细胞内黑色素的含量。此外，火棘果实提取物对
Compound 48 /80 刺激大鼠腹腔肥大细胞释放组胺呈剂量依赖性抑制作用。结论:火棘果实提取物显著抑制酪氨酸酶活性和肥
大细胞释放组胺，为火棘果实作为美白添加剂提供了实验依据。
［关键词］ 火棘;酪氨酸酶;黑色素;美白作用
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)02-0184-05
Whitening Effects of Fruit Extract of Pyracantha fortuneana
HE Rong-rong1，LI Wei-xi1，2，LI Yi-fang1，KURIHARA Hiroshi1*
(1 . Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural products，Jinan University，Guangzhou 510632，China;
2 . College of Traditional Chinese Materia Medica，Yunnan University of
Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China)
［Abstract］ Objective:To study the whitening effects of the fruit extract of Pyracantha fortuneana (Maxim.)
Li and investigate its effects on the release of histamine in peritoneal mast cells as well as discuss the possible
mechanism. Method:In order to observe the whitening effects of the fruit extract of P. fortuneana，the tyrosinase
inhibitory rate of its fruit extract was determined，and the content of melanin and the activity of tyrosinase in B16
cells treated with the fruit extract were also tested. On the other hand，in order to observe the effects of the fruit
extract of P. fortuneana on histamine release，the histamine level in mast cells stimulated by Compound 48 /80 and
treated with its fruit extract was measured by high performance liquid chromatography with an electrochemical
detection (HPLC-ECD). Result:The fruit extract of P. fortuneana had significantly inhibitory effects on the activity
of tyrosinase and the content of melanin in B16 cells. Moreover，the fruit extract also reduced the histamine level in
mast cells stimulated by Compound 48 /80 in a dose dependant manner. Conclusion:The fruit extract of P.
fortuneana could obviously inhibit the activity of tyrosinase and the release of histamine in mast cells，which
provides experimental evidences for its usage as a whitening agent.
［Key words］ Pyracantha fortuneana;tyrosinase;melanin;whitening effect
火棘 Pyracantha fortuneana (Maxim.)Li 为蔷 薇科苹果亚科火棘属的常绿野生小灌木植物，其果
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第 17 卷第 2 期
2011 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 2
Jan.，2011
实又叫赤阳子、火把果等，主要分布在我国东南、西
南及西北等区域的山地及丘陵地带。火棘果实可食
用，性味甘酸，具有健脾消积、生津止渴等功效。火
棘果实提取物富含芦丁和金丝桃苷等黄酮类化合
物［1］，此外也含有氨基酸、多种无机盐及微量元素
等。
Shinomiya 等曾报道火棘具有显著的美白作用
并在化妆品的产品开发上取得成功［2］，但至今为止
人们对火棘美白的基础研究并不充分。由天然原料
制备的化妆品具有传统使用经验和安全性，因此受
到广大消费者的欢迎，成为国内外化妆品研发的主
要趋势。酪氨酸酶是黑色素合成反应的限速酶，在
黑色素的形成和沉积过程中起着主要作用［3］。因
此，寻找安全和高效的酪氨酸酶抑制剂成为美白化
妆品研发热点。肥大细胞分泌的炎症介质组胺能够
激活酪氨酸酶活性，诱发黑色素细胞内黑色素的产
生，而抑制组胺释放可以有效的缓解皮肤炎症及过
敏所引起的色斑和色素沉淀［4］。
本研究在对火棘果实的化学成分研究的基础
上［5-6］，采用酪氨酸酶活性、小鼠 B16 细胞内黑色素
的生成及大鼠肥大细胞的组胺释放等为评价指标，
探讨火棘果实提取物的美白效果，旨在对美白化妆
品的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 火棘果实提取物的制备 火棘果实采自陕西
秦岭地区，称取火棘果实干燥粗粉 50 g，以 60%乙醇
500 mL 浸泡过夜后加热回流提取 2 h，滤过。滤液
经浓缩冷冻干燥后回收得到火棘果实提取物 10. 8
g，收率为 21. 6%。以芦丁作为对照品，紫外分光光
度法测定火棘果实提取物中含有黄酮类成分为
10. 9%，HPLC 定量分析其中芦丁、金丝桃苷和异槲
皮素在火棘果实提取物中的质量分数分别为
0. 76%，0. 30%，0. 45% ［7］。
1. 2 试剂及仪器 胰蛋白酶、3，4-二羟基-L-苯丙氨
酸(L-DOPA)、蘑菇酪氨酸酶、熊果苷、Compound 48 /
80、组胺标准品及钙离子载体 A23187 为 Sigma 公司
产品;小鼠 B16 黑色素瘤细胞株和 DMEM 培养基购
于中 国 医 学 科 学 院;o-phthalaldehyde (OPA)及
Thiofluor (Pickering Laboratories， Mountain View，
CA)及甲醇(色谱纯)购自美国 Fisher 试剂公司;乙
二胺四乙酸(EDTA)、盐酸、无水乙醇、石油醚等均为
国产分析纯。高效液相库仑阵列电化学检测系统
(HPLC-ECD)为 美 国 ESA 公 司 产 品，Scotsman
AF100 制冰机为鑫科企业有限公司产品。3218K 型
台式高速冷冻离心机 (Sigma，Germany);德 国
Sartorius 公司 BS210S 电子天平;太仓市科教器材厂
WH2861 型漩涡混合器;上海伟业仪器厂 pH S225
型酸度计;芬兰雷博 MK3 型酶标仪;新加坡 Esco 公
司超净工作台;波兰 Shel-Lab 公司 CO2 培养箱;
Olympus 公司 IX51 倒置荧光显微镜。
1. 3 酪氨酸酶活性的测定 实验参照 Dai 等使用
的方法［8］，以 25 mmol·L － 1，pH 6. 8 的磷酸缓冲液配
制 0. 1 g·L － 1的 L-DOPA 为底物，40 μL 添加到 96 孔
板后，添加 80 μL 磷酸缓冲液及 40 μL 的 20%甲醇
水溶液制备的不同浓度火棘果实提取物。然后加入
40 μL 的 100 U·mL － 1酪氨酸酶磷酸缓冲液，混匀后
在 30 ℃水浴中作用 30 min，测定 490 nm 处的吸光
度，比较反应前后的差异。空白对照使用 40 μL 的
20%甲醇水溶液，药物对照使用熊果苷。计算酪氨
酸酶活性抑制率
抑制率 =［(A － B)－(C － D)］/(A － B)× 100%
A 为空白组水浴后的吸光度，B 为空白组水浴前的吸光
度，C 为待测样品水浴后的吸光度，D 为待测样品水浴前的
吸光度。
1. 4 B16 细胞内黑色素含量测定 实验用含 10%
胎牛血清、青霉素 100 U·mL － 1及链霉素 100 U·
mL － 1 DMEM 细胞培养液将 B16 黑色素细胞密度调
为 1 × 105 个 /mL，以每孔 3 mL 接种于 6 孔细胞培养
板中，在 37 ℃，5% CO2 条件下培养 24 h 后添加火棘
果实提取物等待测样品。作用 3 d 后，弃上清并用
PBS 洗涤，然后每孔加入 0. 5 mL 胰酶消化细胞 3
min，添加 2 mL 细胞培养液终止消化反应，计数每组
细胞。弃除细胞悬液后，添加 1 mol·L － 1 NaOH 溶液
0. 5 mL，震动 1 h 后 1 500 r·min － 1离心 5 min，分别
取 200 μL 移到 96 孔细胞培养板，酶标仪检测 450
nm 的吸光度。计算黑色素合成抑制率:
抑制率 =［1 －(A /B)/(C /D)］× 100%
A 为药物孔吸光度，B 为药物孔细胞数，C 对照孔吸光
度，D 为对照孔细胞数。
1. 5 B16 细胞内酪氨酸酶活性的测定 细胞培养
方法同 1. 4，药物作用 3 d 后，弃除上清液，用 PBS 冲
洗 2 遍。每孔添加 180 μL 含 1% Triton X-100 的
PBS 溶液后，冰浴中超声破碎，每孔加人 20 μL 10
mmol·L － 1的 L-DOPA，37 ℃ 孵育 60 min，1 500 r·
min － 1离心 5 min，分别取 100 μL 移到 96 孔细胞培
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何蓉蓉，等:火棘果实提取物的美白作用
养板，酶标仪检测 492 nm 吸光度值，计算细胞内酪
氨酸酶活性抑制率。
抑制率 =(1 － A /B)× 100%
A 为药物组平均吸光度，B 为对照组平均吸光度。
1. 6 Compound 48 /80 刺激大鼠腹腔肥大细胞释放
组胺 7 周龄 180 ～ 220 g 雄性 SPF 级 SD 大鼠，均购
自广东省医学实验动物中心，许可证号 SCXK(粤)
200320002。试验动物在清洁级层流架中饲养，饲养
温度(23 ± 2)℃。小鼠适应性饲养 1 周后进行试
验。试验参照 Sullivan 等［9］方法，将 SD 大鼠处死
后，ip Ca2 + free mast cellmedium MCM(+ )基质液
100 mL，按摩腹部 2 min 后吸出全部腹腔液，4 ℃条
件下 680 r·min － 1离心 7 min。弃上清液后，用 35 mL
MCM (+)基质液洗沉淀，4 ℃ 680 r·min － 1离心 7
min，回收肥大细胞。再加入 MCM(－ )基质液 5
mL，台盼蓝染色后显微镜下细胞计数，调整肥大细
胞密度为 1 × 105 /mL 后用于试验。
试验分为 HCl 处理完全释放组胺组、Compound
48 /80 刺激释放组胺组、自然释放组胺组及各给药
组，每组 6 个平行管。每管加入肥大细胞悬液 500
μL 后在 37 ℃条件下振荡水浴 5 min，添加 4 μL 250
mmol·L － 1 CaCl2 5 min 后加入 5 μL 待测样品。药物
作用 10 min 后 添 加 5 μL 的 0. 05 mmol·L － 1
Compound 48 /80 (自然释放组添加等量生理盐水)，
刺激 10 min 后冰浴冷却，4 ℃条件下 6 000 r·min － 1
离心 15 min，取上清液 400 μL 并添加 20 μL 60%
PCA，室温放置 20 min 沉淀。向各组试管内添加
400 μL 生理盐水，4 ℃条件下 13 000 r·min － 1离心 5
min。上清液经 0. 2 μm 微孔滤膜过滤后用于 HPLC
分析。
组胺测定使用 HPLC-ECD 系统，采用 OPA /
Thiofluor 柱前衍生法测定。色谱柱为美国惠泽公司
Capcell Pak C18(3 μm，310 mm × 50 mm)，流动相 10
mmol·L － 1的 Na2HPO4、22%甲醇、13%乙腈混合并用
磷酸调 pH 至 6. 8。柱温 38 ℃，流速 0. 75 mL·
min － 1，电压 550 mV，进样体积为 15 μL。试验样品
中组胺含量是将其峰面积代入标准曲线中计算得
出。Compound 48 /80 刺激大鼠腹腔肥大细胞释放
组胺抑制率按以下公式计算:
抑制率 =［1 －(A － B)/(C － B)］× 100%
其中，A 为药物处理组释放组胺，B 为大鼠腹腔肥大细胞
自然释放组胺，C 为 Compound 48 /80 刺激大鼠腹腔肥大细胞
释放组胺。
1. 7 统计学处理 实验数据以 SPSS 软件计算，结
果以 珋x ± s 表示，统计学处理采用 Student t-test 检验，
P < 0. 05 为有统计学意义。
2 结果
2. 1 火棘果实提取物对酪氨酸酶活性的影响
6. 25 μg·mL － 1火棘果实提取物对酪氨酸酶活性的抑
制率为(25. 4 ± 2. 4)%，随着火棘果实提取物剂量的
增加酪氨酸酶活性呈现下降趋势，当火棘果实提取
物作用剂量达 100 μg·mL － 1时对酪氨酸酶活性的抑
制率为(73. 8 ± 4. 2)%。以上试验结果表明，火棘果
实提取物对酪氨酸酶活性有较强的抑制作用，并呈
一定的量效依赖关系。此外，相同浓度下熊果苷对
酪氨酸酶活性也显示较强的量效依赖性抑制作用。
火棘果实提取物对酪氨酸酶活性的 IC50为 32. 28
μg·mL － 1(图 1)。
图 1 火棘果实提取物对酪氨酸酶活性的影响(珋x ± s)
2. 2 火棘果实提取物对 B16 细胞内黑色素含量的
影响 6. 25 μg·mL － 1火棘果实提取物对 B16 细胞内
黑色素的含量无明显影响，当火棘果实提取物剂量
为 100 μg·mL － 1时，对细胞内黑色素的含量抑制率
为(52. 2 ± 5. 8)%。以上试验结果表明，火棘果实提
取物呈一定量效依赖性减少 B16 细胞内的黑色素含
量。此外，相同剂量熊果苷也显示减少细胞内黑色
素含量的作用。火棘果实提取物对 B16 细胞内黑色
素含量的 IC50为82. 47 μg·mL
－ 1(图 2)。
2. 3 火棘果实提取物对 B16 细胞内酪氨酸酶活性
的影响 6. 25 μg·mL － 1剂量的火棘果实提取物对
B16 细胞内酪氨酸酶活性抑制率为(12. 2 ± 1. 7)%，
随着剂量的增大，抑制作用增强。以上结果表明，火
棘果实提取物对 B16 细胞内酪氨酸酶活性均有明显
的抑制作用，且呈一定的量效依赖关系。此外，相同
浓度熊果苷对 B16 细胞内酪氨酸酶活性也显示较强
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Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
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图 2 火棘果实提取物对 B16 细胞内黑色素含量的影响(珋x ± s)
的量效依赖性抑制作用。火棘果实提取物对 B16 细
胞内酪氨酸酶活性的 IC50为 53. 48 μg·mL
－ 1。
图 3 火棘果实提取物对 B16 细胞内酪氨酸酶活性的影响(珋x ± s)
2. 4 火棘果实提取物对大鼠腹腔肥大细胞释放组
胺的影响 体外给予火棘果实提取物 100，50，25，
12. 5 mg·L － 1浓度时能显著抑制 Compound 48 /80 刺
激大鼠腹腔肥大细胞释放组胺的增加，其抑制率分
别是 49. 7%，43. 4%，34. 4%，14. 4%，并显示一定的
剂量依赖关系(表 1)。
表 1 火棘果实提取物对大鼠腹腔肥大细胞释放组胺的影响
组别
剂量
/μg·mL － 1
组胺释放
/μmol·L － 1
抑制率
/%
自然释放 － 0. 09 ± 0. 01 －
Compound 48 /80 对照 － 6. 08 ± 0. 29 0. 0
火棘果实提取物 100 3. 10 ± 0. 222) 49. 7
50 3. 48 ± 0. 212) 43. 4
25 4. 02 ± 0. 152) 34. 4
12. 5 5. 22 ± 0. 261) 14. 4
6. 25 5. 78 ± 0. 23 5. 0
注:与 Compound 48 /80 对照组比较1)P < 0. 01，2)P < 0. 001。
3 讨论
已有研究确认火棘果实对皮肤的色素沉着具有
显著的改善作用，显示一定的美白作用［10］。本研究
结果表明，火棘果实提取物对酪氨酸酶活性具有明
显的抑制作用，且呈一定的量效关系。酪氨酸酶是
黑色素生成的关键酶，通过催化酪氨酸或多巴酸转
化为多巴醌，再经过酶促和非酶促等反应，最终生成
黑色素。因此，酪氨酸酶活性直接影响黑色素合成
的速率，对皮肤黑色素的沉着起主要的作用［11］。本
研究以目前广泛应用的美白添加剂熊果苷为对照，
该化合物通过竞争性抑制酪氨酸酶的活性产生作
用［12］。研究结果显示，火棘果实提取物对酪氨酸酶
的抑制活性略强于熊果苷。我们的前期研究已经证
明火棘果实中富含芦丁和金丝桃苷等黄酮类化合
物［13］，且这些成分均能明显延缓荧光物质被活性氧
自由基淬灭的速度，显示出较强的抗氧化效果和抗
应激作用［7］。此外，我们进一步发现火棘果实提取
物能够显著减少 B16 细胞内黑色素的含量，这可能
与抑制 B16 细胞内酪氨酸酶活性有关。
身心疲劳引起的应激负荷及炎症与过敏反应会
促进肥大细胞分泌组胺等化学介质。一般认为，组
胺酸在脱羧酶作用下形成的组胺主要贮存在肥大细
胞等的细胞质颗粒中，当肥大细胞受到过敏原作用
时会诱发组胺释放［14］。组胺能够激活酪氨酸酶活
性，诱发黑色素细胞内黑色素的产生，引起皮肤色斑
及色素沉淀［15］。本研究结果表明火棘果实提取物
可以明显抑制肥大细胞释放组胺，且具有剂量依赖
关系。因此，推测火棘美白作用可能与抑制组胺释
放相关。其作用机制还有待今后深入研究。
综上所述，火棘果实提取物中的某些活性化学
成分能减少肥大细胞的组胺释放，抑制酪氨酸酶活
性以减少细胞内黑色素的生成，显示较好的美白效
果，研究结果有望对火棘果实在美白化妆品的开发
利用提供一定的科学依据。
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［责任编辑 何伟］
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