全 文 ：子醇提物 >油茶叶醇提物 >油茶叶水提物 >油茶子
水提物 >山茶子水提物。
参 考 文 献
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(2007-12-24收稿)
基金项目:国家自然科学基金(20376015, 20672023)作者简介:徐学涛(1979-),男,山东泰安人 ,硕士研究生 ,研究方向为天然药物化学;Tel:13763384694, E-mail:xuetaoxu@yahoo.com.cn。＊通讯作者:张焜 ,男 ,广东罗定人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向为天然药物化学;Tel:13602890906, E-mail:Kzhang@gdut.edu.cn。
西藏红缨合耳菊提取物对酪氨酸酶的抑制作用
徐学涛 1 ,张　焜 1＊ ,杜志云1 ,郑　劼 1 ,方岩雄 1 ,卫星船1 ,赵肃清 1 ,俞新华 2
(1.广东工业大学轻工化工学院 ,广东广州 510006;2.华南农业大学生命科学学院 ,广东广州 510642)
　　摘要　目的:研究西藏红缨合耳菊提取物对酪氨酸酶的抑制作用。方法:将红缨合耳菊的 70%乙醇提取物依
次用石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取 , 然后测定各部分对酪氨酸酶的抑制作用 ,并进行酶抑制动力学研究。结果:乙
酸乙酯 、正丁醇的萃取部分对酪氨酸酶的活性抑制较强;对单酚酶抑制作用明显并有延迟作用 , 半数抑制浓度
(IC50)分别为 57.8、140 μg/ml;对双酚酶的抑制作用显示浓度依赖关系 , IC50分别为 41.2、 59.6 μg/ml, 相比熊果苷
抑制双酚酶活性的 IC50值 1.44mg/ml,抑制效果分别是熊果苷的 35、 24倍;抑制类型:乙酸乙酯部分为竞争性抑制 ,
Ki为 19.7μg/ml,正丁醇部分为非竞争性抑制 , Ki为 60.7μg/ml。结论:西藏红缨合耳菊乙醇提取物的乙酸乙酯 、正
丁醇萃取部分对酪氨酸酶活性抑制较强。
关键词　红缨合耳菊;酪氨酸酶;化妆品
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)10-1544-04
InhibitionofExtractsfromSynotiserythropappaonTyrosinase
XUXue-tao1 , ZHANGKun1 , DUZhi-yun1 , ZHENGJie1 , FANGYan-xiong1 , WEIXing-chuan1 , ZHAOSu-qing1 , YUXin-hua2
(1.FacultyofChemicalEngineeringandLightIndustry, GuangdongUniversityofTechnology, Guangzhou510006, China;2.Colege
ofLifeScience, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou510642, China)
Abstract　Objective:TostudytheinhibitionofextractsfromSynotiserythropappaontyrosinase.Methods:The70% ethanolex-
·1544· 中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　第 31卷第 10期 2008年 10月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.10.034
tractswereextractedbypetroleumbenzine, ethylacetateandn-butanol, andtheinhibitoryactivitiesagainsttyrosinaseofeveryfraction
weredeterminedinvitroandtheinhibitorykineticsofethylacetateandn-butanolfractionswereinvestigated.Results:Thefourfrac-
tionsextractedalhadinhibitoryactivitiesontyrosinase, inhibitoryactivitiesofethylacetateandn-butanolfractionwerehigher.Their
IC50 were57.8、140μg/mlformonophenoloxidaseactivityand41.2、 59.6μg/mlfordiphenoloxidaseactivity, respectively.Theinhi-
bitionkineticsanalyzedbyHnewaver-Burkplotsshowedthatethylacetatefractionwasacompetitivetypeinhibitor, anditsKiwasde-
terminedtobe19.7μg/ml.n-butanolfractionwasanuncompetitivetypeinhibitor, anditsKiwasdeterminedtobe60.7μg/ml.Con-
clusion:Ethylacetateandn-butanolfractionsofextractsfromSynotiserythropappashowpotentialinhibitoryactivityontyrosinase.
Keywords　Synotiserythropappa(Bur.etFranch.)C.JefreyetY.L.Chen;Tyrosinase;Cosmetic
　　酪氨酸酶(EC1.14.18.1)又称多酚氧化酶 ,其
活性中心含有金属铜离子 ,广泛存在于动植物体和
人体内 ,是生物体合成黑色素等色素的关键酶 。酪
氨酸酶主要参与两个反应过程:催化 L-酪氨酸羟基
化转变为 L-多巴(单酚氧化酶活性)和氧化 L-多巴
形成多巴醌(多酚氧化酶活性),多巴醌经一系列中
间体反应后形成黑色素〔1, 2〕。酪氨酸酶抑制剂就是
通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成的 ,因
而可用于预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等。将酪
氨酸酶抑制剂作为化妆品添加剂用于美白 、保护皮
肤等 ,具有广阔的应用前景 ,随着化妆品工业 “组份
天然化 ”及 “回归大自然 ”的潮流 ,植物源酪氨酸酶
抑制剂的研究开发倍受重视〔3〕。
西藏红缨合耳菊(Synotiserythropappa(Bur.et
Franch.)C.JefreyetY.L.Chen)为西藏特有的菊科
(Compositae)植物 ,产于西藏东南部 ,当地女性将其
捣碎 、烧成灰等后 ,敷在皮肤表面用于皮肤保养及紫
外线防护。本实验通过研究西藏红缨合耳菊 70%
乙醇提取物及其石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取部分
及水溶部分对酪氨酸酶的抑制作用 ,来探讨西藏红
缨合耳菊美白皮肤的依据 。
1 　材料与仪器
西藏红缨合耳菊采自西藏波密县(经华南农业
大学俞新华教授鉴定为西藏红缨合耳菊);蘑菇酪
氨酸酶 、L-3, 4-二羟基苯氨酸(L-DOPA)、L-酪氨酸
为 Sigma化学公司产品;熊果苷为上海奥利实业有
限公司产品;电子天平(日本岛津 ,精密度 0.0001
g);旋转蒸发仪(上海亚荣仪器有限公司);PHS-25
数显 pH计(上海精密科学仪器有限公司);UV-2450
双光束紫外可见分光光度计(日本岛津);其余试剂
均为分析纯 。
2 　方法
2.1 　西藏红缨合耳菊的提取分离　称取干燥的西
藏红缨合耳菊 100 g,常温下以 70%乙醇浸泡 14 d,
每天震荡数次。过滤 ,滤渣用少量 70%乙醇浸泡洗
涤 3次 ,合并滤液 ,减压浓缩后依次用石油醚 、乙酸
乙酯 、正丁醇萃取得到极性不同的四部分 ,减压浓缩
并真空干燥后得到各部分的浸膏 ,各浸膏用 DMSO
配成各浓度溶液备用。
2.2　酪氨酸酶活性抑制实验 　参考 Y.B.Ryu
等〔4〕及邓湘庆等 〔5〕的方法并略做修改 ,先加入 0.1
ml含不同浓度的抑制剂于比色杯中 ,再加进 2.8 ml
预先在 30℃恒温水浴保温的底物溶液 ,然后加入
0.1 ml酪氨酸酶水溶液 ,即刻充分混匀 ,在 30℃恒
温条件下 ,测定波长 475 nm处的光密度值 ,由其随
时间的增长直线的斜率计算出酶的活力 ,酶抑制实
验平行做三次 。测定单酚酶活力所用的底物为 2
mmol/LTyr,酶的终浓度为 40 μg/ml;双酚酶所用底
物为 0.5mmol/LL-DOPA,酶的终浓度为 8 μg/ml。
效应物对酶的抑制作用的机理是通过 Lineweaver-
Burk双倒数作图 ,比较酶催化反应的动力学参数 ,
包括表观米氏常数(Km)和最大反应速度 (Vm)的
变化来判断的 。
2.3　统计学处理　采用 Excel均数标准差进行统
计学处理 。
3　结果
3.1　各萃取部分对酪氨酸酶单酚酶活力的影响　
以 L-Tyr为底物 ,测试各部分对酪氨酸酶单酚酶活
力的影响 ,结果见表 1。实验中醇提取物及其石油
醚 、水溶部分 IC50均超过 150 μg/ml,而乙酸乙酯 、正
丁醇部分 IC50分别为 57.8、140 μg/ml,提示乙酸乙
酯 、正丁醇部分富集了西藏红缨合耳菊抑制酪氨酸
酶单酚酶的主要有效组分。酪氨酸酶催化酪氨酸羟
基化过程见图 1、2。酪氨酸酶单酚酶的催化特征是
有迟滞过程 ,随着抑制剂浓度的增大酪氨酸酶的稳
态活力(直线部分的斜率)逐渐下降 ,并使迟滞时间
延长 。 82.8μg/ml乙酸乙酯部分使得酶的稳态活
力下降了 82.1%(图 3线 1)、使迟滞时间从 78 s延
长到 223 s(图 3线 2);170.8 μg/ml正丁醇部分使
得酶的稳态活力下降了 69.4%(图 4线 1)、使迟滞
时间从 78 s延长到 173s(图 4线 2)。
3.2　各萃取部分对酪氨酸酶双酚酶活力的影响　
以 L-DOPA为底物 ,测试各部分对酪氨酸酶双酚酶
活力的影响 ,结果如表 2所示 ,实验中 138 μg/ml醇
·1545·中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　第 31卷第 10期 2008年 10月
提取物 、乙酸乙酯 、正丁醇部分对酪氨酸酶抑制率分
别为 72.38%、80.95%、79.48%,均超过 8.0 mg/ml
熊果苷的 70.21%,而石油醚及水溶部分对酶的抑
制活性较弱 ,说明西藏红缨合耳菊抑制酪氨酸酶双
酚酶的主要有效组分集中在乙酸乙酯 、正丁醇部分 。
乙酸乙酯 、正丁醇部分对酪氨酸酶双酚酶活力测试
结果如图 5、图 6所示 ,抑制率随着效应物浓度的增
大而增大 , IC50分别为 41.2、59.6 μg/ml。相比熊果
苷抑制双酚酶活性的 IC50值 1.44 mg/ml,抑制效果
分别是熊果苷的 35、24倍。
　表 1　　　　　　红缨合耳菊各提取物对酪
氨酸酶单酚酶的抑制作用
组别 终浓度(μg/ml) 酪氨酸酶抑制率(%)
醇提物全组分(EF) 150 47.13
石油醚部分(PF) 220 6.05
乙酸乙酯部分(EAF) 69 58.61
正丁醇部分(nBF) 136 49.61
水溶部分(WF) 300 37.20
图 1　EAF为效应物酪氨酸酶催化
L-Tyr反应的进程曲线
注:曲线从上至下 EAF的浓度分别为:0、 27.6、 41.4、 55.2、 69
和 82.8 μg/ml
图 2　nBF为效应物酪氨酸酶催化
L-Tyr反应的进程曲线
注:曲线从上至下 nBF的浓度分别为:0、 34.1、 51.2、 85.4、
102.5、136.6和 170.8 μg/ml
图 3　EAF对酪氨酸酶单酚酶的稳态活
力(1)和迟滞时间(2)的影响
图 4　nBF对酪氨酸酶单酚酶的稳态活
力(1)和迟滞时间(2)的影响
　表 2　红缨合耳菊各提取物对酪氨酸酶双酚酶的抑制作用
组别 终浓度(μg/ml) 酪氨酸酶抑制率(%)
醇提物全组分(EF) 138 72.38
石油醚部分(PF) 138 45.71
乙酸乙酯部分(EAF) 138 80.95
正丁醇部分(nBF) 138 79.48
水溶部分(WF) 138 43.81
熊果苷 8000 70.21
图 5　EAF对酪氨酸酶双酚酶的抑制
3.3　乙酸乙酯 、正丁醇部分对酪氨酸酶抑制类型
　进一步研究乙酸乙酯 、正丁醇部分对酪氨酸酶双
酚酶抑制作用类型 ,在测活体系中 ,固定酶的浓度 ,
改变底物 L-DOPA的浓度 ,测定不同浓度效应物对
·1546· 中药材　JournalofChineseMedicinalMaterials　第 31卷第 10期 2008年 10月
酶活力的影响 ,以 Lineweaver-Burk双倒数作图判断
抑制类型。乙酸乙酯部分双倒数图(见图 7)得到一
组纵轴截距不变的直线 ,表明其抑制类型为竞争性
类型。以不同浓度乙酸乙酯部分测定的 Km对抑制
剂浓度作图(图 7内插图)为一条直线 ,从直线的斜
率求得抑制常数(Ki)为 19.7μg/ml。正丁醇部分
双倒数图(见图 8)得到一组横轴截距不变的直线 ,
表明其抑制类型为非竞争性类型。以不同浓度正丁
醇部分测定的 1/Vmax对抑制剂浓度作图(图 8内插
图)为一条直线 ,从直线的斜率求得抑制常数(Ki)
为 60.7μg/ml。
图 6　nBF对酪氨酸酶双酚酶的抑制
图 7　EAF对酪氨酸酶抑制类型和抑制常数的测定
4 　讨论
红缨合耳菊是西藏特有的植物 ,具有美白皮肤
的功效 ,通过对其醇提物的研究发现其乙酸乙酯及
正丁醇萃取部分对酪氨酸酶的活性有较强的抑制
图 8　nBF对酪氨酸酶抑制类型和抑制常数的测定
作用 ,乙酸乙酯萃取部分对单酚酶和双酚酶的抑制
率达到 50%的浓度(IC50)分别为 57.8、41.2μg/ml,
对双酚酶的抑制作用表现为可逆竞争性抑制类型 ,
抑制常数 Ki为 19.7μg/ml;正丁醇部分单酚酶和双
酚酶的 IC50分别为 140、59.6 μg/ml,抑制作用为可
逆非竞争性抑制类型 , Ki为 60.7 μg/ml。这两部分
对酪氨酸酶的抑制效果远优于熊果苷 ,抑制效果分
别是熊果苷的 35、24倍 ,是一种有市场潜力的酪氨
酸酶抑制剂 ,为红缨合耳菊的综合开发利用提供了
一个新的方向及一定的实验依据 ,提示其在化妆品
行业和临床医学应用方面具有新的开发价值 。
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(2007-12-26收稿)
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