全 文 ：佛甲草中 SOD提取条件的优化
陈　莉1 ,申小蓉1 ,赵红洋2 ,刘　括1
(1.西北名族大学 生命科学与工程学院 ,甘肃 兰州　730020;2.梦绿公司 ,甘肃 兰州　730020)
摘要:对景天科植物佛甲草超氧化物歧化酶(SOD)的抽提缓冲液 pH 值 ,抽提时间 ,热处理的温度
和时间进行正交实验 ,并对丙酮沉淀法和硫酸铵盐析法初步纯化 SOD 粗酶液进行了优化和比较 。结果
表明:抽提缓冲液的 pH 值为 7.8 ,抽提时间为 2 h ,热处理温度为 50 ℃,热处理时间为 15 min时 ,得到
佛甲草 SOD的相对最大提取酶活力;饱和度为 90%的硫酸铵盐析是初步纯化佛甲草 SOD的最优条件 ,
其纯化倍数为 4.10 ,回收率为 0.71 ,为进一步的层析以制备更纯佛甲草 SOD提供了理论的条件。
关键词:佛甲草;SOD;提取条件;纯化
中图分类号:Q 554;Q 949.751　　文献标识码:A 　　文章编号:1009-5500(2009)01-0001-06
　　佛甲草(S edum lineare)为景天科植物 ,原产我国
东北 , 生长于山坡或岩石上 , 为多年生肉质草本 , 高
10 ～ 20 cm , 是一种喜阳性又极耐阴植物 。佛甲草的
繁殖主要采用扦插法 。由于茎节着地生根 , 故繁殖很
容易[ 1] 。佛甲草属多浆植物 ,含水量极高 ,其叶 、茎表
皮的角质层具有超常的防止水分蒸发的特性 ,其耐旱
时间可长达 30 d。
超氧化物歧化酶(SOD)最初由 Mann和 keilin 于
1938年首先在牛血红细胞中发现 ,并命名为血铜蛋
白 ,由 McCo rd于 1969年将该酶定名为超氧化物歧化
酶[ 2] 。SOD是一族含金属的酶 ,广泛存在于动植物 ,
真核微生物和部分原核微生物等需氧生物细胞内[ 3] 。
正常情况下 ,机体自由基的产生 ,利用和清除三者
之间处于一种动态的生理平衡 ,即自由基不断产生又
不断被利用 ,且不断被清除 ,保持着生命活动所需要的
低浓度水平[ 4] 。
　　近年来 , 人们利用SOD在研究自由基理论 、生物
学作用 、辐射防治以及与疾病的关系等方面取得了许
多进展。目前 SOD已较多地应用于医药 、化妆品 、保
收稿日期:2008-11-03;修回日期:2008-12-25
基金项目:甘肃省自然基金项目(3zs051-A25-072)和全球
环境基金项目“野生牧草种质资源的利用”
(052456CH A-GS-Y-1)资助
作者简介:陈莉(1970-), 女 , 江苏南京人 , 在读博士 , 讲师 ,
从事牧草种质资源利用方面的研究工作。
健品及食品等的生产之中 ,而且随着研究的深入 ,它的
应用范围还不断扩大[ 5] 。SOD 研究和应用的深度和
广度已居酶类生化制剂的前列[ 6] 。
我国传统工业大多从动物血液和内脏器官中提取
SOD ,但这类原料来源有限 ,成分复杂 ,且在存储 、运输
等方面存在诸多不便 ,因此容易导致生产工艺复杂化 ,
使生产成本大幅度上升[ 7] 。目前国际市场 SOD精品
售价高达 3万美元/g ,加之“血液病”等的影响 ,消费者
对其极不放心。植物体中如种子 、果实 、菜叶等 SOD
的含量丰富 ,而且杂蛋白较少 ,有较高的开发价值。因
此 ,从植物中提取 SOD 食用安全性高 、资源丰富 、价
廉 ,具有广阔的开拓前景[ 8] 。
国内外尚未见到有关从佛甲草中提取 SOD的研
究报道 ,鉴于佛甲草有较强抗逆性 ,用其为原料 ,研究
SOD的提取纯化条件 ,得出获得佛甲草 SOD 粗品的
较好的工艺参数 ,为 SOD的进一步纯化及深入研究提
供理论依据。
1　材料和方法
1.1　材料 ,主要试剂与仪器
佛甲草;氯化硝基四氮唑蓝(NBT):国药集团化学
试剂有限公司;甲硫氨酸(Met):购自甘肃中瑞化工有
限公司;核黄素:来源于天津市光复粗细化工研究所;
考马斯亮蓝 G-250:上海源聚生物科技有限公司;磷酸
氢二钠 、磷酸二氢钠 、硫酸铵 、丙酮 、磷酸 、无水乙醇 、乙
1草原与草坪　　2009年　　第 1期　　总第 132期
二胺四乙酸二钠 ,以上药品中无水乙醇为优级纯 ,其余
均为分析纯。
FA2004N 型电子天平:上海精密科学仪器有限公
司;TDZ-WS型低速自动平衡离心机:长沙湘仪离心机
仪器有限公司;SPX-300B-G 型微电脑光照培养箱:上
海博迅实业有限公司医疗设备厂;722E 型可见分光光
度计:上海光谱仪器有限公司;HH ·S 1-Ni型电热恒
温水浴锅:北京长安科学仪器厂。
2.2　实验方法
2.2.1　SOD 酶液的抽提条件及热处理条件的选择　
称取新鲜的佛甲草 1 g 于研钵中 ,加入 1 mL 磷酸缓冲
液(50 mmol/L),在冰浴条件下充分研磨后转移到离
心管 ,并用 4 mL 缓冲液分数次将研钵冲洗干净 ,洗液
转入离心管。于 4 ℃冰箱中抽提一定的时间后 ,4 000
r/min离心 20 m in ,上清液转入试管。将试管置于水
浴锅中热处理后 ,取出迅速置于碎冰块中冷却以终止
热处理。将处理后的酶液定容至 5 mL ,测定 SOD 酶
活性[ 9 , 10] 。
采用 L9(34)正交表 ,进行如表 1所示的 4因素 3
水平正交实验。
表 1　因素水平
Tab.1　Factor level
水平 磷酸缓冲液 pH 值
抽提时间
/ h
热处理温度
/ ℃
热处理时间
/ min
1 7.5 1.0 50 15
2 7.8 1.5 60 20
3 8.1 2.0 70 25
2.2.2　SOD 粗酶液的制备　采用上述实验所确定的
最优条件 ,进行 3次重复实验(其中每次重复的佛甲草
用量为 10 g ,最终酶液定容至 50 mL)。测定每次重复
的 SOD酶活性及蛋白含量 ,并计算比活力。将 3次的
酶液混合在一起 ,作为佛甲草 SOD的粗提酶液 。
2.2.3　丙酮沉淀法提纯条件的优化[ 11] 　取 7 支离心
管 ,各加 2 mL 粗酶液 ,缓慢加入预冷丙酮 ,用量为丙
酮∶酶液(L/L)分别为 0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2和
1.4。加完后冰浴 30 min ,并缓慢振摇 。4 000 r/min
离心 15 min后弃上清 ,沉淀用最适 pH 值的磷酸缓冲
液(50 mmol/L)2 mL 溶解 ,并分别测定 7个处理的酶
液的 SOD酶活性及蛋白含量 。
2.2.4　硫酸铵盐析法提纯条件的优化[ 12] 　取 8支离
心管 ,分别加入 2 mL 粗酶液 。根据溶液体积和硫酸
铵饱和度常用表[ 13] 计算所需的固体硫酸铵的量。将
硫酸铵粉末缓慢加入酶液中 ,轻轻振摇防止产生大量
气泡。硫酸铵的饱和度分别达到 30%、40%、50%、
60%、70%、80%、90%和 100%。静置 30 m in , 4 ℃离
心 15 min后弃上清 ,沉淀用 2 mL磷酸缓冲液溶解 ,并
分别测定 8个处理的酶液的 SOD酶活性及蛋白含量 。
2.2.5　NBT-光还原法测定酶活性[ 14] 　按表 2 加入
各试剂及酶液 ,试剂加入后充分混匀 ,将一支对照管置
于暗处 ,其他各管于 4 000 lx 下反应 20 min 后遮光以
终止反应。以不照光的对照管作空白 ,在 560 nm 波长
下分别测定其他各管的吸光度 。以抑制 NBT-光还原
反应 50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。
SOD总活性=(AG—AY)V/(0.5AG·W ·VT)
式中:SOD总活性以鲜重酶(g);AG—照光对照
管的吸光光度值;AY —样品管的吸光光度值;V —样液
总体积(mL);W —样品鲜重(g);VT —测定时样品用
量(mL)。
表 2　SOD活性测定的各溶液用量
Tab.2　Determined SOD activity for every solution dosages
试剂(或酶液) 用量/ mL 终浓度(比色时)
65 mmo l/ L Me t溶液 0.6 13 mmol/ L
酶液 0.1 对照管以蒸馏水代替酶液
100 μmol/ L EDTA-Na2 溶液 0.3
0.3 10 μmol/ L
750 μmol/ L NBT 溶液 0.3 75 μmol/ L
20μmo l/ L 核黄素 1.4 2.0 μmo l/ L
蒸馏水
总体积 3.0
2 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2009　　No.1　　(Sum　N o.132)
2.2.6　考马斯亮蓝 G-250染色法测定蛋白质含量[ 15]
　取样品液1 mL ,加入 5 mL 考马斯亮蓝G-250溶液 ,
充分混合 ,放置 2 min后在 595 nm 波长下比色测定吸
光度 ,通过标准曲线获得蛋白质含量。
2　结果与分析
2.1　SOD酶液的抽提条件及热处理条件的优化选择
缓冲系统的水溶液对酶稳定性好 、溶解度大 ,是提
取酶常用的溶剂 ,缓冲液的 pH 值及抽提时间对提取
率有一定的影响[ 16] 。由于 SOD 是金属酶 , 金属离子
对热有稳定的影响 ,所以 SOD对热较稳定。当温度低
于 80 ℃时 ,短时间的热处理酶活力损失不大 ,而大多
数杂蛋白却在 50 ℃就容易变性沉淀 ,所以热处理可以
除去部分杂蛋白[ 17] 。实验通过正交法寻找在除去部
分杂蛋白的同时 ,获得较高 SOD 活性的条件 ,同时考
察不同因素对 SOD活性的影响程度。
表 3　正交实验结果
Tab.3　Orthogonality test result
实验号 磷酸缓冲液
pH 值(A) 抽提时间(B) 热处理温度(C) 热处理时间(D) D(560 nm)
SOD活性
/ U · g-1鲜重
1 1 1 1 1 0.233 49.4
2 1 2 2 2 0.228 50.5
3 1 3 3 3 0.374 18.8
4 2 1 2 3 0.234 49.2
5 2 2 3 1 0.311 32.5
6 2 6 1 2 0.082 82.2
7 3 1 3 2 0.410 11.0
8 3 2 1 3 0.124 73.1
9 3 3 2 1 0.153 66.8
K1 39.6 36.5 69.2 49.6
K2 54.6 52.0 55.5 49.9
K3 50.3 55.9 20.8 47.0
R 15.0 19.4 47.4 2.6
　　由表 3可知 ,对SOD活性的影响程度C>B>A>
D ,由于 D因素的极差为 2.6 ,相对于其他 3个因素较
小 ,可把 D因素项作为误差项进行方差分析。用方差
分析可知 ,热处理温度对 SOD 活性影响达到了极显
著 ,缓冲液的 pH 值及抽提时间对 SOD活性的影响均
达到了显著水平 。最优条件确定为 A 2B3C1D1 ,即缓
冲液 pH 值7.8 ,抽提时间 2 h ,热处理温度50 ℃,热处
理时间为 15 min 为最优条件。实验中获得的最大
SOD活性为 82.2 U/g 鲜重 ,说明了佛甲草中 SOD的
含量还是很高的(表 4)。
表 4　方差分析
Tab.4　Variance analytical table
方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F 值 显著性
磷酸缓冲液 pH 值 361.0 2 180.5 36.5 ＊
抽提时间 631.8 2 315.9 63.8 ＊
热处理温度 3 621.6 2 1 810.8 365.8 ＊＊
热处理时间 9.9 2 5.0 1.0
误差 9.9 2 5.0
　　注:F0.05(2 , 2)=19 , F0.01(2 , 2)=99
2.2　粗酶液的制备及蛋白质标准曲线的绘制
2.2.1　标准曲线的绘制　按表 2加入各试剂后 ,分别
向各试管中加入 5 mL 考马斯亮蓝 G-250溶液摇匀 ,
放置 5 min ,在 595 nm 波长下比色测定吸光度 。以蛋
白质浓度为横坐标 ,吸光度为纵坐标绘制标准曲线(表
5 ,图 1)。
3草原与草坪　　2009年　　第 1期　　总第 132期
表 5　绘制标准曲线的各试剂加入量及测定结果
Tab.5　Reagent adding amount and determining result for standard curve
管号 1 2 3 4 5 6
标准蛋白 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
质溶液/ mL
蒸馏水量/ mL 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000
蛋白质含量/μg 0 20 40 60 80 100
实验 1 0.000 0.050 0.102 0.207 0.234 0.304
实验 2 0.000 0.058 0.112 0.186 0.241 0.298
实验 3 0.000 0.056 0.114 0.191 0.228 0.302
平均 0.000 0.055 0.109 0.195 0.234 0.301
　　
图 1　蛋白质标准曲线
Fig.1　Standard curve for protein
测定酶活性时 2支光照对照管的 D(560 nm)分别
为 0.477和 0.454 ,平均值为 0.466。通过计算可得粗
酶液的 SOD活性为 82.5 U/g ,鲜重(16.5 U/mL),蛋
白含量为 0.116 mg/mL ,比活力为 142.2 U/mg 。经
热处理后离心得到了较多的沉淀 ,说明很多杂蛋白已
经变性沉淀被除去。SOD活性达到了 82.5 U/g 与正
交实验中的最大值 82.2 U/g 相差不大 ,说明试验的重
现性比较好 ,该工艺稳定可行。
2.3　丙酮沉淀法提纯条件的优化
有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层 ,并降低介电
常数而增加带电质点间的相互作用 ,致使蛋白颗粒凝
集而沉淀[ 18] 。利用 SOD与其他杂质在有机溶剂中的
溶解度不同 ,通过添加一定量的有机溶剂 ,可使 SOD
与杂蛋白相互分离 。不过有机溶剂都带有毒性 ,易使
蛋白质发生构象变化而导致变性 ,所以一般采用毒性
较小的丙酮以尽量消除这种毒副作用[ 19] 。
由表 6可知 ,随着丙酮用量的增加 ,蛋白质含量和
SOD活性均呈现由小到大的趋势 。当丙酮∶酶液
(v/v)=1.2时 ,比活力达到最高值 274.4 U/mg 。再
增加丙酮用量比活力呈下降趋势 ,即此时达到最佳纯
化效果 ,而此时回收率 0.65 与丙酮∶酶液(v/v)=1.4
时的 0.68相差不大 ,所以确定丙酮∶酶液(v/v)=1.2
为丙酮沉淀法提纯佛甲草 SOD的最优条件(表 6)。
表 6　丙酮不同用量处理结果
Tab.6　Results under different acetone dosages
丙酮∶酶液(v/ v) 蛋白含量/ mg ·mL-1 SOD活性/ U·mL-1 比活力/ U·mg-1 纯化倍数 回收率
0 0.116 16.5 142.2
0.2 0.008 0.3 37.5 0.3 0.02
0.4 0.012 0.8 106.7 0.5 0.05
0.6 0.019 2.9 152.6 1.1 0.18
0.8 0.025 5.5 220.0 1.5 0.33
1.0 0.032 7.9 246.9 1.7 0.48
1.2 0.039 10.7 274.4 1.9 0.65
1.4 0.049 10.9 222.4 1.6 0.68
　　注:比活力=SOD活性/蛋白含量;纯化倍数=处理后的 SOD比活力/处理前粗提酶液的 SOD 比活力;回收率=处理后的 SOD
活性/处理前粗提酶液的 SOD活性 , 下表同
2.4　硫酸铵盐析法提纯条件的优化
盐析法是工业上一种常用的纯化蛋白质的方法 ,
其原理是在高浓度的电解质盐溶液内蛋白质分子表面
的水化层被破坏 ,使蛋白质分子中的憎水区域裸露而
导致蛋白质分子聚集沉淀[ 15] 。该方法条件温和 ,操作
简便且不引起蛋白质变性。硫酸铵价廉 、溶解度大且
能使蛋白质性质保持稳定而成为最常用的盐析剂。不
同蛋白质在不同硫酸铵饱和度下析出 ,实验利用这一
4 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2009　　No.1　　(Sum　N o.132)
原理来选择纯化 SOD的最优条件。
由表 7可知 ,当硫酸铵饱和度达到 60%时 ,蛋白质
含量开始呈现出下降趋势 ,而 SOD活性却有了显著的
提高 ,所以比活力也有了明显的升高 。继续增加硫酸
铵的用量 ,当硫酸铵的饱和度达到 90%时 ,蛋白质含
量达最低值 0.20 mg/mL , 而 SOD 活性达到最高值
11.70 U/mL ,所以比活力在此时也达到了最大值
585.0 U/mg 。从表 7可以明显的看出 ,当硫酸铵的饱
和度达到 90%时 ,纯化倍数 4.10和回收率 0.67均为
最大值。再增加硫酸铵用量 ,当饱和度达到 100%时 ,
纯化倍数和回收率均减小 ,而且 100%饱和度很难控
制 ,所以确定 90%硫酸铵饱和度为使用该法纯化佛甲
草 SOD的最优条件。
与丙酮沉淀法相比 ,硫酸铵盐析法操作条件温和 ,
不易使 SOD失活 ,且具有较高纯化倍数和回收率。所
以 ,采用饱和度为 90%硫酸铵盐析为最优纯化条件 。
表 7　不同饱和度硫酸铵处理结果
Tab.7　Results under dif ferent ammonium sulphate concentrations
硫酸铵饱和度
/ %
蛋白质含量
/mg ·mL -1
SOD 活性
/ U·m L-1
比活力
/ U ·mg -1 纯化倍数 回收率
0 0.12 16.50 142.2
30 0.03 0.60 18.20 0.10 0.04
40 0.04 0.90 21.40 0.20 0.05
50 0.05 1.20 22.60 0.20 0.07
60 0.05 9.20 191.70 1.30 0.56
70 0.05 9.80 213.00 1.50 0.59
80 0.03 10.80 317.60 2.20 0.65
90 0.02 11.70 585.00 4.10 0.71
100 0.02 11.10 482.60 3.40 0.67
　　在实际工业中要得到高纯度 SOD精制品 ,一般都
需借助层析法 ,但层析法处理量小 、运作成本高 ,因此
在使用层析法制备纯品之前 ,进行一些操作简便 、成本
低廉的纯化方法对初步的纯化处理是有必要的[ 20] 。
4　结论
通过对磷酸缓冲液 pH 值 、抽提时间 、热处理温度
及时间的正交考察得出 ,用 pH 值为 7.8的磷酸缓冲
液抽提 2 h ,然后 50 ℃处理 15 min 得到佛甲草 SOD
的相对最大酶活力 ,并除去了部分杂蛋白 。通过验证
实验知该工艺条件是稳定可行的。
通过对丙酮沉淀法和硫酸铵盐析法进行提纯条件
的优化得出:饱和度为 90%的硫酸铵盐析达最佳纯化
效果 ,其纯化倍数为 4.10 ,回收率为 0.71 ,为进一步的
层析以制备纯品 SOD提供了很好的条件 。
近年来 ,利用 SOD能清除 O -2 的功能 ,人们相继开
发了一系列富含 SOD 的制品 ,如 SOD 系列化妆品 ,
SOD啤酒 、饮料和其他 SOD 食品。SOD已成为众多
制药厂 、日化厂和食品加工厂的重要原料[ 21] 。实验所
采用的缓冲液抽提 ,热处理 ,硫酸铵盐析过程所采用的
仪器简单 、试剂价廉 、简便易操作 ,是制备 SOD粗品的
很好路径 。实验所用的原料佛甲草具有强的抗逆性 ,
很容易种植形成规模。
利用廉价易得的原料 ,通过简单的加工过程而制
备具有重要应用价值的 SOD ,其前景是十分广阔的。
相信会有越来越多的 SOD产品走进人们的生活 。
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Optimization of treatment conditions for
extracting SOD in Sedum lineare
CHEN Li1 , SHEN Xiao-rong1 , ZHAO H ong-yang2 , LIU Kuo1
(1.Collegeo f L i f e Science and Eng ineering , Northwest Universi ty for Nationali ties ,
Lanzhou 730020 , China;2.Gansu Menglu E nv ironment Eng ineering Ltd ., Lanz hou 730020 , China)
Abstract:The factors af fecting SOD ex traction , including pH value of buf fer , ex t raction time , temperature
and time of heating t reatment , were studied by using Sedum lineare with orthogonal test.The resul ts showed
that the activi ty o f SOD was the highe st under the follow ing t reatment conditions:buf fer pH 7.8 , ex t ract ing fo r
120 min , heat t reatment fo r 15 min at 50 ℃.Meanwhile , the best condition for SOD purification w as 90% of
ammonium sulfate , and its purification multiplier and recovery rate were 4.10 and 0.71 respectively.
Key words:Sedum lineare;supero xide dismutase(SOD);ext raction condition;purifica tion
6 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2009　　No.1　　(Sum　N o.132)