全 文 ：李庆伟，梁明勤，樊亚敏，等． 不同取材时期和处理方法对瓦松无菌体系建立的影响［J］． 江苏农业科学，2014，42(1) :55 － 58．
不同取材时期和处理方法对瓦松无菌体系建立的影响
李庆伟，梁明勤，樊亚敏，刘荣宁，贺爱利
(河南农业职业学院现代农业工程系，河南郑州 451450)
摘要:以瓦松植株为外植体进行组织培养，探索不同取材时期、处理方法、消毒时间、激素配比等对其无菌体系建
立的影响，结果表明，无菌体系建立的材料以 5 月上旬取材、取材后对材料进行假植处理、剪去新萌生的茎段作为外植
体为宜;材料用 0． 1%的HgCl2 溶液消毒10 min后接种，污染率在5%以下，存活率在92%以上;在MS + NAA 0． 1 mg /L +
6 － BA 0． 5 mg /L的启动培养基中，芽启动率为 99． 78%，外植体并没有出现愈伤组织、玻璃化等现象。
关键词:瓦松;取材时期;处理方法;无菌体系
中图分类号:Q945． 52 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)01 － 0055 － 03
收稿日期:2013 － 05 － 09
基金项目:河南农业职业学院重点项目(编号:HNAC2011KY002)。
作者简介:李庆伟(1979—) ，男，河南封丘人，硕士，讲师，研究方向为
种苗繁育与大蒜生产。E － mail:liqingwei2003@ 163． com。
瓦松(Orostachys fimbriatus)别称瓦花、瓦塔、瓦玉等，为景
天科瓦松属 2 年生草本肉质植物，在河南、江苏等省及朝鲜、
日本等国家和地区有分布［1］。瓦松植株中含有多种酸类、景
天庚酮糖苷及异丙叉基景天庚酮糖苷等物质［2 － 5］，主要用于
药物合成，目前，利用瓦松参与合成的药品不下 27 种。在临
床上，主要用于治疗宫颈糜烂、肾性皮肤瘙痒、痔疮、口腔溃疡
等症状［6 － 9］。随着研究深入，以瓦松为原材料加工而成的药
品，将更多地应用在临床上。自然条件下，瓦松生存完全依靠
自生自灭。近年来，由于受气候异常变化、花期采药、生境发
生变化等影响，瓦松资源受到严重破坏，保护瓦松资源刻不容
缓。目前，国内外并没有发现关于瓦松繁殖，尤其是快速繁殖
的研究报道。探索并利用生物技术手段，对瓦松进行种苗繁
育技术研究，对深度挖掘瓦松的潜在药用价值，进一步加快瓦
松的开发利用具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试材料采于当地农村 15 年以上的瓦房上，分别在 2 月
上旬、5 月上旬、7 月上旬、10 月上旬拔取全株瓦松，用带叶茎
段作为接种材料。
1． 2 外植体消毒
采用 2 种外植体选择方法进行消毒。方法 1 为直接消毒
接种:在自来水下清洗表面泥土与灰尘，后剪成 3 ～ 5 cm长茎
段，用自来水冲洗 30 min，对 2 月上旬采集的材料，去根、留莲
座状叶和芽，直接用水冲洗;置于超净工作台上用 0． 1%
HgCl2 分别浸泡 2、4、6、8、10、12、14 min，无菌水冲洗 4 次，沥
干水于无菌纸上。方法 2 为假植后消毒接种:材料假植于花
盆中，套塑料袋，于室内 25 ℃下培养 5 ～ 7 d;剪新萌生嫩茎直
接用 0． 1% HgCl2 消毒，消毒时间同上。
消毒后茎段，剪成带叶的茎段接种于初代培养基中，每瓶
接种 1 个茎段，每个处理均接种 15 瓶。
1． 3 材料培养
初代培养基，以 MS培养基为基本培养基，采用 2 因素完
全随机设计(表 1)。培养基采用高压蒸汽灭菌，在 121 ℃、
1． 1 kg /cm2 压力下灭菌 15 min。接种材料置于温度 24 ～
26 ℃、光照时间 14 h /d、光照强度 30 μmol /(m2·s)的条件
下进行培养。
表 1 瓦松初代培养基的组合设计
水平 A:NAA(mg /L) B:6 － BA(mg /L)
1 0 0
2 0． 1 0． 1
3 0． 3 0． 5
4 0． 5 1． 0
1． 4 数据统计与分析
接种后 2 d开始调查，后每隔 3 d 调查 1 次，记载污染发
生的时间、类型、部位，外植体受伤害情况，腋芽初始萌动时
间、腋芽萌动程度、材料的生理状态等，接种后 22 d统计污染
情况，接种后 30 d统计材料存活、伤害情况、腋芽萌动等。根
据统计结果计算污染率、存活率、启动率等，公式如下:污染
率 =污染外植体数 /接种总数 × 100%;存活率 =存活个体数 /
接种总数 × 100%;启动率 =萌芽个体数 /接种总数 × 100%。
数据用 SPSS 13． 0 软件进行方差分析，采用邓肯氏新复
极差测验进行多重比较。试验中全部处理小于 1 的百分数，
经反正弦转换后，进行分析和比较。
2 结果与分析
2． 1 取材时期和方法对无菌体系建立的影响
由图 1 可见，瓦松取材时期和方法不同，组培苗污染率存
在很大差异;2 月上旬取材后直接消毒接种(方法 1)污染率
最高，达 100%，10 月上旬、7 月上旬取材次之;5 月上旬取材
污染率最低，2 种方法平均污染率 22． 2%。这可能是由于 5
月瓦松种子萌动后刚开始大量生长，生命力较旺盛，且外植体
在空气中暴露时间较短，随着在空气中暴露时间的增加，外植
体表面汇集大量微生物，组织培养时直接进行消毒，并不能将
表面的微生物全部杀死;进入冬季，瓦松植株为适应环境条件
变化，进入休眠，整个植株生长停止，叶片紧紧闭合，体内积累
大量微生物，消毒时，消毒剂只能将裸露在表面的微生物杀
—55—江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 1 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2014.01.066
死，并不能杀死植株内的微生物，从而造成 2 月份污染率居高
不下。从选用不同的外植体进行消毒接种看，在同一时期，直
接消毒接种的组培苗污染率均高于假植后消毒接种的(方法
2)。5 月份是瓦松最佳的取材时期，外植体假植后，选取植株
上萌生的新茎段作为外植体，可使组培苗污染率最低。
2． 2 消毒时间对无菌体系建立的影响
由表 1 可见，随着 HgCl2 消毒时间的增加，外植体的污染
率明显降低;对于选用不同外植体进行消毒接种，方法 1 组培
苗的污染率和 HgCl2 消毒时间成负相关性，消毒时间越长，污
染率越低，2、4 min处理的污染率最高(100%) ，12、14 min 处
理的污染率最低(0) ，且外植体的存活情况不受影响，这说明
外植体表面存在大量保护组织，能避免受伤害，方法 2 组培苗
的污染率和 HgCl2 消毒时间也表现为负相关性，其外植体的
存活情况(存活率)和消毒时间也成负相关关系，消毒时间越
长，受伤害的外植体材料越多，存活率越低，这说明假植处理
后，新萌生的茎段表面缺乏保护性组织;对于在相同的消毒时
间条件下，方法 2 组培苗的污染率要明显低于方法 1，这可能
与二者的生长环境有关，方法 1 的植株长期暴露在自然环境
下，其体表携带大量的微生物，而方法 2 新萌生的茎段，可能
携带微生物含量少，但对于存活率，消毒时间较短时表现不明
显，随着消毒时间的增长，方法 2 组培苗的存活率明显低于方
法 1，这可能与二者的生理状态有关，经过假植的瓦松苗组织
相对更幼嫩一些。
表 1 0． 1%HgCl2 不同消毒时间对瓦松无菌体系建立的影响
消毒时间
(min)
选用外
植体方法
接种数
(个)
污染数
(个)
污染率
(%)
杀死数
(个)
存活率
(%)
2 方法 1 55 55 100 0 100
方法 2 55 50 90． 9 0 100
4 方法 1 55 55 100 0 100
方法 2 55 46 83． 6 0 100
6 方法 1 55 51 92． 7 0 100
方法 2 55 20 36． 4 1 98
8 方法 1 55 40 72． 7 0 100
方法 2 55 6 10． 9 3 95
10 方法 1 55 26 47． 3 0 100
方法 2 55 2 3． 6 6 89
12 方法 1 55 16 29． 1 0 100
方法 2 55 0 0 40 17
14 方法 1 55 13 23． 6 0 100
方法 2 55 0 0 51 7
综合瓦松外植体的污染率、存活率及其处理方法等指标，
认为采用假植后剪取新生茎段，0． 1% HgCl2 浸泡 10 min 作
为瓦松无菌体系建立外植体消毒的最佳时间。
为检验 0． 1 HgCl2 消毒 10 min 对假植后新生茎段的效
果，通过消毒较长茎段或消毒后每瓶接种多个材料进行验证
(图 2) ，发现材料的存活率在 92%以上，污染率在 5%以下。
2． 3 激素组成对瓦松外植体启动培养的影响
初代培养中以 MS 培养基为基本培养基，培养基中添加
不同的浓度 NAA和 6 － BA，瓦松外植体的启动培养结果如表
2 和图 3 所示。
从表 2 可以看出，瓦松的腋芽最早在接种 1 周后才开始
萌动。腋芽的萌动时间受培养基中激素配比的影响而不同:
培养基仅含有 NAA时，芽的初始萌动时间随 NAA 浓度的增
加而延长，在 NAA 浓度为 0． 5 mg /L 时，接种后 30 d，没有观
察到腋芽萌动;仅含有 6 － BA 的培养基，随 6 － BA 浓度的增
加，腋芽萌生时间也明显延迟，6 － BA浓度为 1． 0 mg /L时，接
种后 30 d同样也没有发现腋芽萌动;当 NAA 和 6 － BA 同时
存在于培养基中，在培养基中 6 － BA 浓度为 0． 1 mg /L，NAA
浓度为 0． 1、0． 3 mg /L 时，瓦松腋芽萌动的时间都明显提早;
培养基中 6 － BA 浓度提高为 0． 5 mg /L，无论培养基中 NAA
浓度是高是低，瓦松腋芽萌动的初始时间都明显提前，最早接
种后 8 d腋芽开始萌动;当培养基中 NAA 浓度为 0． 5 mg /L，
6 － BA 浓度为 0． 1、1． 0 mg /L 时，接种后 30 d 均没有观察到
瓦松腋芽的萌发;培养基中不添加任何激素，腋芽初始萌生时
间为接种后 20 d。瓦松外植体在不同的培养基中，其腋芽的
初始萌生时间呈现不同，这可能与所添加生长调节剂的特性
有关:NAA是生长素类物质，能明显促进材料体内细胞的生
长，它在低浓度时，可以促进材料不定根产生;浓度较高时，则
会产生愈伤组织，抑制芽的发生。6 － BA 为细胞分裂素类物
质，能促进细胞分裂，促进不定芽和丛生芽的形成;过高浓度
时，会出现玻璃化等不良现象，抑制芽的发生。
另外，瓦松腋芽的启动率在添加一种激素的培养基中随
添加激素浓度的增加而降低;在同时添加 2 种激素的培养基
中，在 6 － BA浓度为 0． 1、0． 5 mg /L时，随 NAA 浓度的提高，
芽启动率降低;当 6 － BA浓度为 1． 0 mg /L时，NAA浓度过低
(0． 1 mg /L)或过高(0． 5 mg /L)出现腋芽启动率反而没有
0． 5 mg /L 的芽启动率高;培养基中不添加任何激素，瓦松的
腋芽也全部萌发，芽萌发后生长缓慢，没有根系发生(表 2)。
对各处理进行显著性分析发现，不同处理间达到显著水
平，处理组合 7(A2B3)和处理组合 5(A2B1)极显著高于其他
组合，处理组合 16(A4B4)、13(A4B1)、4(A1B4)最差，处理组
合 8(A2B4)、14(A4B2)效果也比较差。
综合外植体接种后的萌生速度、启动率、生理状态等基本
表现，瓦松初代培养的培养基以MS + NAA 0． 1 mg /L + 6 － BA
—65— 江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 1 期
表 2 不同激素配比对瓦松外植体启动培养的影响
处理
激素(mg /L)
NAA 6 － BA
芽始萌生
时间(d)
启动率(%)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均值
试管苗生理状态
差异
显著性
1 0 0 20 98 100 97 98． 33 芽生长缓慢，无根产生 ab
2 0 0． 1 16 97 96 95 96． 00 无根发生 bc
3 0 0． 5 22 72 70 74 72． 00 初在伤口处生少量愈伤，后芽萌动 e
4 0 1． 0 — 0 12 10 7． 33 切口生淡黄松散愈伤，材料玻璃化 i
5 0． 1 0 15 100 99 99 99． 33 萌芽后，切口处产生较粗 1 ～ 3 条根 ab
6 0． 1 0． 1 13 100 98 97 98． 33 芽生长健壮 ab
7 0． 1 0． 5 10 100 100 99 99． 67 芽健壮，无根产生 a
8 0． 1 1． 0 21 56 54 54 54． 67 从外植体切口处萌生愈伤 f
9 0． 3 0 25 96 98 98 97． 33 萌生大量绒状短根 abc
10 0． 3 0． 1 12 98 99 98 98． 33 产生大量绒毛状根，个别根粗壮 ab
11 0． 3 0． 5 8 91 92 90 91． 00 有少量较粗根产生 cd
12 0． 3 1． 0 17 81 83 80 81． 33 无根产生，有少量愈伤产生 de
13 0． 5 0 — 0 6 9 5． 00 外植体产生愈伤组织块 i
14 0． 5 0． 1 — 35 36 36 35． 67 切口产生绿色愈伤，掩盖材料腋芽 h
15 0． 5 0． 5 15 76 73 79 76． 00 有愈伤组织出现 e
16 0． 5 1． 0 — 0 7 4 3． 67 伤口处产生淡绿色愈伤，无芽产生 i
注:“—”为接种后 30 d观察，未发现腋芽萌发。
0． 5 mg /L 为最佳。此时，芽萌生速度快，芽平均启动率为
99. 67%，外植体并没有出现愈伤组织、玻璃化等现象，萌生芽
生长健壮。
3 小结与讨论
材料消毒是建立植物组织培养无菌再生体系的第一步，
它直接关系到无菌体系能否建立，因此格外关键。许多研究
指出，不同的植物种类、外植体类型、不同的生理状态及取材
季节，所采用的外植体处理和消毒方式均不相同［10 － 14］。朱淑
颖等在研究野生草珊瑚快繁体系建立时，发现直接使用消毒
剂对外植体材料进行消毒，初代培养的污染率几乎为 100%，
其指出，选取的外植体材料源自野外的植株，叶表面孳生着大
量微生物，并附着大量的霉菌孢子和细菌芽孢，甚至一些菌丝
体进入表皮薄壁细胞，直接消毒难以奏效［10］。王丽萍等在进
行番木瓜组织培养时，指出以大田番木瓜作外植体，很难控制
污染，如果在番木瓜外植体使用消毒剂前用热水进行浸泡处
理 10 min，污染率同比降低了 28． 62%［11］。德庆措姆以西藏
林芝地区野生银白杨萌蘖苗为材料，研究银白杨的消毒技术
时发现，其体表密被白绒毛，直接影响消毒剂的渗入和减低消
毒效果［12］。宋会访研究桂花的植物组织培养时，发现桂花茎
段腋芽表面吸附大量杂菌，且枝条内部有内生菌存在，消毒难
以控制，而新生的枝条和叶片中杂菌较少，容易消毒处理［13］。
王延玲等在仙客来花药培养中，同样也指出材料表面的微生
物难以消除彻底，不利于消毒处理［14］。本试验以野生瓦松茎
段为外植体材料，比较了直接消毒接种和经过假植后剪新萌
茎段接种 2 种处理方式对污染、存活率等的影响，发现假植后
消毒虽能降低污染率，但材料的存活率大幅度下降，这和前人
研究基本一致。主要原因是材料表面存在大量微生物，消毒
剂难以将有些芽孢孢子杀死，通过假植后选取茎段，则能明显
降低污染率，说明材料暴露空气中的时间越短，其携带微生物
含量越少，也验证了前人的研究［12 － 15］。
瓦松为 2 年生植物，野生状态下，其生长状态受自然环境
制约很大，华北地区春季 3—4 月多缺乏雨水，继而瓦松种子
不能很好进行发芽产生新植株，1 年生植株同时也因缺乏水
分而生长受限，因此，应结合瓦松的生物学特性和环境条件来
合理取材。马翠萍在 1 年中 1 月、3 月、6 月、9 月、11 月等 5
个时期分别对冬枣、一品红、杨树、樱桃、草莓进行取材研究，
指出取材时应注意避免高温季节和材料的休眠期，尽量根据
材料生物学特性和季节结合进行选择［15］，这和本试验结果基
本相同。郭晓东以桃树 1 年生萌蘖和当年生上部枝条为试
材，研究了 3 月、8 月和 11 月取材对污染的影响，发现 11 月
污染率最低、8月最高，但材料的启动率却以8月最高、11月
—75—江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 1 期
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
最低，综合分析以 3 月外植体作为材料最好［16］，这也说明瓦
松的取材在考虑季节因素和生物学特性时，应结合试管苗的
生理状态来判定最佳的取材时期。
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李媛媛，王冰林，韩 佳，等． 萝卜下胚轴高效再生体系的建立［J］． 江苏农业科学，2014，42(1) :58 － 60．
萝卜下胚轴高效再生体系的建立
李媛媛1，王冰林2，韩 佳1，郑慧敏1，何 珊1，胡玉荣1，张 军1
(1．山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室 /潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊 261061;
2．山东省潍坊市农业科学院，山东潍坊 261071)
摘要:以 7 个萝卜品种为试材，开展下胚轴离体培养研究，通过基因型筛选确定具有较高再生频率的萝卜品种进
行后续试验，探讨 AgNO3 浓度、激素配比、琼脂浓度等因素对萝卜下胚轴再生的影响。结果表明:萝卜下胚轴再生的
最适培养基为改良 MS + 1． 8 mg /L 6 － BA + 0． 8 mg /L NAA + 5 mg /L AgNO3 + 0． 9%琼脂 + 30 g /L 蔗糖，不定芽再生率
高达 78． 3%，玻璃化率仅为 2． 8%。
关键词:萝卜;下胚轴;离体再生;AgNO3;激素配比
中图分类号:S631． 104． 3 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)01 － 0058 － 03
收稿日期:2013 － 05 － 16
基金项目:山东省优秀中青年科学家科研奖励基金 (编号:
2007BS06024) ;山东省农业良种工程重大课题。
作者简介:李媛媛(1979—) ，女，山东桓台人，博士，讲师，从事蔬菜遗
传育种研究。Tel:(0536)8785690;E － mail:yylilove@ 126． com。
通信作者:王冰林，博士，副研究员，从事蔬菜遗传育种与栽培生理研
究。Tel:(0536)2118661;E － mail:binglinwang@ 126． com。
萝卜是一种重要的营养保健蔬菜，在我国蔬菜栽培和供
应中占有重要地位，近几年种植面积不断扩大，产量也在逐步
提高，目前全国萝卜栽培面积约为 120 万 hm2 /年，总产量达
2 683 万 t /年［1］。萝卜生产以应用杂交种为主，自交不亲和
系和雄性不育系利用是萝卜杂交育种的重要途径，而其传统
的保存方法局限性较大。随着生物技术的快速发展，组织培
养成为保存和快繁自交不亲和系和雄性不育系的有效途径，
同时也是利用基因工程技术选育优良品种的重要前提。萝卜
为再生顽拗型植物，再生频率普遍较低［2］，所以建立高效、实
用的离体再生体系和组培快繁体系成为萝卜生物技术育种的
关键限制因素。因此，笔者选用 7 个萝卜品种，从基因型、激
素配比、AgNO3 浓度、琼脂浓度等方面对萝卜下胚轴再生的
影响进行了研究，旨在建立高效的萝卜离体再生体系，为利用
生物技术与常规育种方法相结合开展萝卜遗传育种和良种繁
育提供技术支撑。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试 7 个萝卜品种由山东省潍坊市农业科学院提供，分
别为杂交种红光 102、白玉冠军、潍萝卜 1 号、潍萝卜 2 号、潍
萝卜 3 号，常规种潍县萝卜、改良潍县萝卜。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 无菌苗培养 挑选颗粒饱满的萝卜种子，用蒸馏水清
洗干净后用滤纸吸干。在超净工作台上用 70% 乙醇处理
—85— 江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 1 期