全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 2期，第 293-297页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.2, 293-297
研究报告
A Letter
猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探
唐历波 * 姬可平 王燕 陈锦永
遵义医学院珠海校区生化教研室,珠海, 519041
*通讯作者, tanglibo111@yahoo.com.cn
摘 要 为了进一步分析猪笼草瓶状体内消化液中蛋白质的性质，本研究在不同的温度和 pH条件下测定
消化液中蛋白酶的活性，并且比较了 3种不同沉淀方法对消化液蛋白进行的浓缩，通过 SDS-聚丙烯酰胺电
泳对消化液蛋白作了初步分离。结果表明，猪笼草消化液中蛋白酶的最适酶活温度为 50℃，且稳定性最高；
当 pH为 5时，该蛋白酶活性出现峰值，采用氯仿-正丁醇法(5:1)沉淀浓缩猪笼草消化液蛋白样品效果最
佳。聚丙烯酰胺电泳结果表明，消化液至少包括三种蛋白组分，分子量分别为 24.3 kD、35.1 kD和 61.4 kD，且
35.1 kD条带具有抗胰蛋白酶消化活性。本研究为综合开发利用猪笼草野生资源提供理论依据。
关键词 猪笼草,蛋白酶活性,温度, pH, SDS-PAGE
Preliminary Study on the Activities of Protease in Digestive Juice of Pitcher
Plant
Tang Libo * Ji Keping Wang Yan Chen Jingyong
Department of Biochemistry ZhuhaiCampus Zunyi Medical College, Zhuhai, 519041
* Corresponding author, tanglibo111@yahoo.com.cn
DOI: 10.3969/gab.029.000293
Abstract In order to analyze the character of the protein of the digestive juice in the ascidium of pitcher plant, we
carried out a study of effect in different temperature and pH on activity of protease in digestive juice of pitcher plant
we also compared 3 kinds of precipitation methods of protease concentrate and isolated protein sample in digestive
juice by using SDS-PAGE. The results showed that the optimum temperature of protease in digestive juice in the as-
cidium was 50℃with the maxlmum stability, and the peak value of activity of protease was found with the pH5. Ex-
perimental results indicated the best method of the protein concentrate was chloroform/butanol (5:1), and there were
at least three kinds of protein component with different MW, i.e. 24.3 kD, 35.1 kD and 61.4 kD, respectively, it was
also shown that the protein with 35.1kD has the character of antitrypsine. This research should supply some evi-
dences for the exploitation and utilization reasonable in wild resource of pitcher plant.
Keywords Pitcher plant (Nepenthes mirabilis), Activity of protease, Temperature, pH, SDS-PAGE
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.029.000293
基金项目：本研究由遵义医学院校区启动基金(KY200603)资助
猪笼草为猪笼草科(Nepenthaceae)猪笼草属(Ne－
penthes)，中国野生猪笼草(Nepenthes mitabilis (lour.)
Druce)只有一个种(陈焕镛, 1965)，分布在广东西南
部、香港及海南岛的丘陵灌丛中或酸性沼泽边缘(徐
迟默, 2003)。猪笼草是热带食虫植物的代表种(杨光
穗等, 2006)，由于生长在比较贫瘠的土壤中，而且根
系很不发达，所以很难获得足够的养料，为了适应环
境生存下去，在长期的自然选择和遗传变异中，叶子
慢慢变化演变成奇妙的“捕虫器”，即食虫囊。猪笼草
通过这种特殊的变态叶将昆虫或其他小型动物捕
获，并通过变态叶的消化腺分泌消化液将其消化从
中获得营养，特别是获得硝酸盐来补充光合作用。而
对于猪笼草变态叶的解剖特点，吴钿和叶昌辉(2000)
研究认为瓶状体是由叶卷须膨大形成，在瓶状体内
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000293
部下缘，密生燕窝状腺体，能分泌酸性消化液。
对猪笼草瓶状体内消化液的研究，还没有相关
的报道，我们前期预试验表明，猪笼草未打开瓶盖的
囊中消化液中含有蛋白质成分。本研究通过比较不
同的沉淀浓缩分离蛋白的方法，对消化液蛋白质性
质做初步鉴定，为猪笼草的开发应用提供理论依据。
1结果与分析
1.1瓶状体内消化液总蛋白含量测定
通过线性拟合得牛血清白蛋白(BSA)的量(mg)与
吸光度 A的关系式为：y=0.205x+0.043 1 (式中 y为牛
血清白蛋白的量(mg/mL)，x为吸光度)。式中的 BSA
浓度相关系数为 0.995 9，BSA蛋白含量标准曲线如
图1所示。
按 3.3测得不同老嫩程度的猪笼草囊内消化液可
溶性蛋白含量如下(其中 14为稀释倍数)：未成熟瓶状
体内消化液蛋白含量为：y=(0.205×0.018+0.043 1)×
14=0.655 2 mg/mL；成熟瓶状体内消化液蛋白含量为：
y=(0.205×0.092+0.043 1)×14=0.868 0 mg/mL；衰老瓶状
体内消化液蛋白含量为：y=(0.205×0.139+0.043 1)×14=
1.002 4 mg/mL；试验重复六次，消化液测定结果表明，
随着瓶状体发育的成熟，其内部消化液蛋白含量呈增
加趋势，至发育后期，蛋白含量达最高值。
1.2蛋白酶活性测定
按 3.4操作，蛋白酶活力测定结果如图 2，50℃
条件下，无论新鲜液还是放置 6 h的消化液均保持较
高的酶活性。
由图 2B可知新鲜消化液最适 pH为 5，离体室
温条件下，酶活性丧失较大，但在等电点(11)，粗酶液
出现红色絮状沉淀，而酶活性丧失较小，说明离体条
件下酶活性不稳定。
1.3聚丙烯凝胶电泳
由图 3可知，TCA法沉淀的蛋白样品电泳拖尾
现象严重；而 Sevag法沉淀所得的蛋白样品较为清
晰，利用 Sevag法沉淀猪笼草粗消化液蛋白效果较
好。在 37℃条件下，用胰蛋白酶处理 12 h，在分子量
为 35.1 kD处仍保留一条条带，而其它位置的条带丧
失，比对胰蛋白酶分子量为 25 kD，该条带应为消化
液本身条带，说明猪笼草消化液中具有抑制胰蛋白
酶活性成分。
由图 4及图 5可知，两种蛋白质沉淀法均可浓
缩消化蛋白混合液，而采用 Sevag法沉淀的消化液
蛋白经 SDS-PEAG电泳后显示的条带清晰，综合两
种沉淀法结果，猪笼草消化液蛋白质是一种混合消
图 1 BSA蛋白含量标准曲线
Figure 1 The standard curve of BSA protein level
图 2温度和 pH对蛋白酶活性影响
注: A:温度对蛋白酶活性影响; B: pH对蛋白酶活性影响
Figure 2 The effect on the activity of protease with temperature
and pH
Note: A: The effect on the activity of protease with different tem-
perature; B: The effect on the activity of protease with pH
294
猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探
Preliminary Study on the Activities of Protease in Digestive Juice of Pitcher Plant
化酶，至少包括三种组分：蛋白Ⅰ分子量约为 24.3 kD、
蛋白Ⅱ分子量约为 35.1 kD以及蛋白Ⅲ分子量约为
61.4 kD，其中蛋白Ⅱ具有抗胰蛋白酶消化活性。
2讨论
2.1猪笼草消化液中蛋白的定量分析
结果表明未成熟猪笼草瓶状体内蛋白含量较
少，而成熟猪笼草消化液中含有一定量可被胰蛋白
酶降解的蛋白，经测定该类蛋白具有胃蛋白酶活性。
因此可以得出猪笼草消化液中含有蛋白水解酶，并
且其消化液中蛋白类消化酶均为猪笼草变态叶成熟
到一定程度所分泌的产物，其活性在笼状体整个发
育阶段均保持稳定。
2.2 pH对消化液中蛋白酶活性影响
猪笼草瓶状体消化液中蛋白酶的最适 pH为 5。
随着 pH的升高，蛋白酶活性逐渐降低，但 pH为 11
处出现了另一峰值。说明猪笼草消化液是一种适应
广的消化液。可在不同的 pH条件下发挥作用。在动
物体内，如鱼体内不同部位的消化道中蛋白酶的性
质不同(Kawais and Ikedas,1972)，胃中提取的蛋白酶
为酸性蛋白酶，酸性条件下酶活性较高；肠中提取的
蛋白酶为碱性蛋白酶，在碱性条件下具有较高的活性
(Esalassen, 1986)。说明猪笼草消化酶是一种有别于
图 3 Sevag与 TCA法沉淀方法比较(A)以及胰蛋白酶抗性(B)
注: T: TCA法沉淀的蛋白样品; S: Sevag法沉淀所得的蛋白样
品; M: Marker; 1:胰蛋白酶 37℃水浴 12 h; 2: 胰蛋白酶与 Se-
vag法沉淀所得蛋白混合 37℃水浴 12 h; 3: Sevag法沉淀所得
蛋白 37℃水浴 12 h
Figure 3 The comparison between Sevag and TCA (A) and the
research for antitrypsin (B)
Note: T : The protein sample with TCA precipitation method; S :
Protein sample with Sevag precipitation method; M: Marker; 1:
The trypsin solution was incubated in a water bath at 37℃ for 12 h;
2: Trypsin and mixed proteins obtained by Sevag precipitation
method were incubated in a water bath at 37℃ for 12 h; 3: Pro-
teins obtained by Sevag method were incubated in a water bath at
37℃ for 12 h
图 4 消化液中蛋白的 SDS-PEAG电泳图
注: m:预染 marker; M:非预染 marker;1~6: Sevag法 6次重复
沉淀的消化液蛋白
Figure 4 SDS-PAGE of the protein in digestive juice
Note: m: The marker with pre-staining; M: The marker with
non-staining; 1~6: The protein in digestive juice treated by sevag
method for 6 times
图 5等电点沉淀法的初纯化结果 SDS-PEAG电泳图
注: m:预染 marker; M:非预染 marker; 1~4:等电点沉淀法沉
淀的蛋白样品
Figure 5 SDS-PEAG of the protein which purified by isoelectric
precipitation method
Note: m: The marker with pre-staining; M: Non-staining marker;
1~4: The protein samples treated by by isoelectric precipitation
method
295
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
动物消化酶的新型消化酶，具有一定的开发价值。
2.3温度对消化液中蛋白酶活性的影响
一般来说，在一定温度范围内，随着温度的升高
酶催化反应的速度加快；但超过一定的温度后，酶的
催化反应的速度反而随温度的升高而减慢(肖美燕和
徐尔尼, 2007)。本实验结果表明猪笼草消化液中蛋白
酶的最适温度为 50℃，在最适温度以下，随温度的升
高酶活性逐渐增加，超过最适温度，随温度的升高酶
活性逐渐降低。猪笼草属热带植物，对环境温度要求
较高(张荣京等, 2007)。实验结果显示，猪笼草消化液
中蛋白酶的最适温度高于其环境温度，这与目前了
解的其它动物消化酶(Kawais and Ikedas,1972)活力
的最适温度均高于所处环境的温度的普遍现象是一
致的(Das and Tripathi, 1991)。
2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
猪笼草消化液的 pH约在 2~5.8范围内，而 12%
TCA对酸性蛋白的沉淀的效果不好。用 TCA沉淀消
化液中的蛋白经过 SDS-PAGE电泳后蛋白条带拖尾
严重，可能与蛋白本身所带电荷有关。 Sevag法沉
淀蛋白的效果是 TCA的 3.8倍(何志伟等, 2007)，并
且 SDS-PEAG电泳结果条带较为清晰。因此，可选用
Sevag法配合 SDS-PEAG对蛋白酶进行定性分析。
用等电点沉淀法分离蛋白酶取得了一定的效
果，但消化液中有部分蛋白等电点与该蛋白酶较接
近，给分离纯化造成了一定的阻力。人胃蛋白酶分子
量 34.5 kD (王莹和张丽萍, 2008)。从实验结果上看，
电泳分离结果中有一条蛋白条带分子量与蛋白酶相
近，但 SDS-PAGE得出的结果只是目的蛋白的表观
分子量，猪笼草消化液中可能同时存在多种蛋白酶。
因此，需要通过双向电泳进一步分离消化液，并通过
氨基酸序列分析，确定消化液的蛋白质成分。
3材料与方法
3.1供试材料和处理
野生猪笼草 (Nepenthes mirabilis (Lour.) Druce)
(中国植物图像数据库鉴定)，来源于遵义医学院珠海
校区后山。原始标本保留于本教研室标本室，标本编
号 ZYSH-1018。取猪笼草酶液经滤纸过滤，滤液 4℃
12 000 r/min离心 20 min，取上清即为酶粗提液。
3.2实验仪器和试剂
超速冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R)；
UV-2500紫外分光光度计(日本岛津)；DYY-7c型电
泳仪(北京市六一仪器厂)。
考马斯亮兰 R-250，牛血清白蛋白，丙烯酰胺，
甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，TEMED，冰醋酸，氯仿，
正丁醇，胰蛋白酶等试剂来源于本院生物工程重点
实验室，胃蛋白酶测定试剂盒购自于南京建成生物
工程研究所。
3.3标准曲线的制作及酶粗提液蛋白含量的测定
用牛血清白蛋白制备标准蛋白曲线，分别取不
同老嫩程度(根据瓶状体瓶盖开放时间及消化液颜色
判断,标准为:瓶状体瓶盖开放前 7 d内为未成熟瓶
状体;瓶状体瓶盖开放后 14 d内为成熟瓶状体；成
熟期过后直至枯萎期间为衰老瓶状体)的猪笼草叶瓶
状体内酶粗提液 1 mL，在 595 nm波长下测其吸光
度，与标准曲线比对求酶粗提液蛋白含量。
3.4酶活力测定
3.4.1蛋白酶活力测定
根据胃蛋白酶测定试剂盒(南京建成生物工程
研究所)操作步骤进行。蛋白酶活性定义为：每毫升酶
液在一定的 pH和温度下，每 1min分解蛋白生成 1 μg
氨基酸相当于一个酶活力单位(即 1个酶活力单位=
1 μg酪氨酸 /min/mL酶液)。
3.4.2反应温度和 pH的设定
在 pH=3.4 条件下设定 4℃、18℃、25℃、37℃、
50℃、60℃、70℃以及 80℃为酶反应温度，分别测其
酶活力。各组酶液分别在其相应的温度 6 h后重复测
定一次。
在温度为 37℃条件下设定 pH 2、pH 3.4、pH 5、
pH 7、pH 9和 pH 11为酶反应 pH，分别测其酶活力。
过夜重复测定一次。
3.5聚丙烯凝胶电泳
消化液酶蛋白的浓缩：为有效分离猪笼草消化液
中的蛋白酶，分别采用三种沉淀方法，即等电点沉淀
法(周先碗和胡晓倩, 2003)，TCA沉淀法(余兰和于香
安, 2004)和 Sevag法(氯仿-正丁醇法)沉淀法(余华,
2005)，并比较了三种浓缩方法的优劣。SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳：电泳条件：SDS-PAGE，胶联度：12%；
缓冲体系：甘氨酸缓冲液；恒压 100 mv；电泳时间 2 h。
参考文献
Chen H.Y., ed., 1965, Flora hainanica, Vol.2, Science Press, Bei-
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000293296
猪笼草消化液中蛋白酶的活性初探
Preliminary Study on the Activities of Protease in Digestive Juice of Pitcher Plant
jing, China, pp.384 (陈焕镛,主编, 1965,海南植物志,第 2卷,
科学出版社,中国,北京, pp.384)
Das k.M., and Tripathi S.D., 1991, Studies on the digestive en-
zymes of grass carp, Ctenopharyngodon idella (Val.), Aqua-
culture, 92: 21-30
Esalassen M., 1986, Purification and some properties of two
N-acetylhextacean decapods, Comp. Biochem. Physiol., 85
(6): 235-239
He Z.W., Liu Z.D., Shao B., Wei G.H., and Xu X.D., 2007, Study
on the removed protein of Vaccinium bractum Thunb leave
extract, Zhongguo Shipin Tianjiaji (China food Additives),
10(G00): 286-289 (何志伟,刘钟栋,邵斌,魏国华,许新德,
2007,乌饭树叶提取液的脱蛋白方法研究,中国食品添加
剂, 10(G00): 286-289)
Kawais S., and Ikeda S., 1972, Studies on digestive enzymes of
fishⅡ, effects of dietary change on activity of digestive en-
zymes in carp, Bull. Jap. Soc. Sci. Fish, 38(2): 265-270
Wang Y., and Zhang L.P., 2008, Progress in separation and pu-
rification technology of pepsin, China Food Additives, (1):
110-113 (王莹, 张丽萍, 2008, 胃蛋白酶分离纯化技术研
究进展,中国食品添加剂, (1): 110-113
Wu T., and Ye C.H., 2000, Studies on the anatomical structures of
the leaf ofNepenthes mirabilis (Lour.) Druce, Guangxi Zhiwu
(Guihaia), 20(2): 153-155 (吴钿,叶昌辉, 2000,猪笼草的形
态解剖结构研究,广西植物, 20(2): 153-155 )
Xiao M.Y., and Xu E.N., 2007, The research on the separation of
nattokinase, Shipin Gongye keji (Science and Technology of
Food Industry), 28(1): 167-168 (肖美燕, 徐尔尼, 2007, 纳
豆激酶的提取研究,食品工业科技, 28(1): 167-168)
Xu C.M., 2003, A review in research of nepenthes, Redai Nongye
Kexue (Chinese Journal of tropical agriculture), 23(5): 53-59
(徐迟默, 2003,猪笼草,热带农业科学, 23(5): 53-59)
Yang G.S., Huang S.H., Xu S.S., and Gao Y.M., 2006, The investi-
gation and study on the germplasm resources and growth of
the wild nepenthes in Hainan, Zhongguo Nongxue Tongxun
(Chinese Agicultural Science Bulletin), 22(11): 440-442 (杨
光穗,黄少华,徐世松,高艳梅, 2006,海南岛野生猪笼草资
源调查及其营养成分分析,中国农学通讯, 22(11): 440-442)
Yu L., Yu X.A., 2004, Trichloroacetic acid precipitation plus bi-
uret colorimetry to determine total protein in hirudo extract,
Zhongguo Yaowu Yu Linchuang (Chinese Remedies &Clin-
ics), 4(9): 685-686 (余兰,于香安, 2004,三氯乙酸沉淀法
结合双缩脲比色法测定水蛭提取液中总蛋白含量,中国
药物与临床, 4 (9): 685-686)
Yu H., 2005, Study on in four method in comparison removing of
protein from polysaccharide of Laminaria Japonica Aresh,
Chengdu Daxue Xuebao (Journal of Chengdu University
(Natural Science)), 24(4): 265-268, (余华, 2005,海带多糖中
蛋白质去除方法的对比研究,成都大学学报:自然科学版,
24 (4): 265-268)
Zhang R.J., Xing F.W., Xiao L.P., Liu Y., Ye Y.S., Wu S.J., Chen H.
F., and Wang G.F., 2007, Spermatophyte flora of Yinggeling
Moutain, Hainan, Biodiversity Science, 15(4): 382-392 (张荣
京,邢福武,萧丽萍,刘演,叶育石,吴世捷,陈红锋,王国发,
2007,海南鹦哥岭的种子植物区系 ,生物多样性 , 15(4):
382-392)
Zhou X.W., and Hu X.Q., eds., 2003, The analytical technology of
biochemistry instrument, Chemical Industrial Press, Beijing,
China, pp.139-207 (周先碗,胡晓倩,主编, 2003,生物化学仪
器分析与实验技术 , 化学工业出版社 , 中国 , 北京 , pp.
139-07)
297