全 文 ：第 37 卷 第 4期
2006年 8 月
解 剖 学 报
ACTA ANATOMICA SINICA
Vol.37 , No.4
Aug.2006
红景天对慢性高原心脏病大鼠心肺组织中内皮抑素和
血管内皮细胞生长因子受体表达的影响
隋岫兰1＊ 陈荣华2 杨锋3 闫慧3 郑俊1 汪林勇1 噶布1 张世馥3
(1.西藏自治区第二人民医院 ,拉萨 850002;2.西藏自治区第一人民医院,拉萨 850000;
3.中国医学科学院基础医学研究所 ,北京 100005)
[ 摘要] 目的 探讨内皮抑素和 VEGF 受体与慢性高原心脏病发病的关系以及红景天治疗高原心脏病的机
理。 方法 建立慢性高原心脏病大鼠模型 ,分为对照组 、吸烟运动刺激组 、拟高原心脏病组和治疗组。利用免疫
荧光组织化学和半定量 RT-PCR方法检测内皮抑素和VEGF 受体的表达水平。 结果 刺激组心肺组织与对照组
相比 , VEGF受体表达水平升高 , 而内皮抑素下降。治疗组与拟高原心脏病组相比 VEGF受体表达水平降低 , 而内皮
抑素升高。 结论 慢性高原心脏病发病与内皮细胞损伤密切相关 , 红景天可以减少内皮细胞损伤。
[ 关键词] 高原心脏病;血管内皮细胞生长因子;内皮抑素;红景天;免疫荧光组织化学;半定量 RT-PCR;大鼠
[ 中图分类号] R555 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 0529-1356(2006)04-436
THE INFLUENCE OF RHODILA ON THE EXPRESSION OF
ENDOSTATIN AND VEGFR IN HEARTS AND LUNGS OF RATS
WITH CHRONIC ALTIPLANO CARDIOPATHY
SUI Xiu-lan1＊, CHEN Rong-hua2 , YANG Feng3 , YAN Hui3 , ZHENG Jun1 ,WANG Lin-yong1 , GA Bu1 , ZHANG Shi-fu3
(1.the Second People Hospital of Tibet , Lhasa 850002 , China;2.the First People Hospital of Tibet , Lhasa 850000 , China;
3.Institute of Basic Medical Sciences , CAMS and PUMC , Beijing 100005 , China)
[ Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of endostatin , VEGFR and chronic altiplano
cardiopathy , and the mechanism of the curative effect of rhodiola.on treat altiplano cardiopathy.Methods The rat model with
chronic altiplano cardiopathy was created.The experimental rats were divided into four groups:control group;smoking and running
stimulated group;altiplano cardiopathy group and rhodiola treated group.The expression levels of endostatin and VEGFR were
determined by the methods of immunohistochemistry and semi-quantitative RT-PCR.Results The expression levels of VEGFR in
hearts and lungs of the stimulated groups were found higher than that of the control group , while endostatin level was contrary.The
expression level of VEGFR in hearts and lungs of the rhodiola treated group was lower than that of the altiplano cardiopathy group ,
while endostatin was higher.Conclusion The pathogenesis of chronic altiplano cardiopathy seems to be closely associated with
epithelial lesion.The curative effect of rhodila to this disease may be exerted by reducing the damage of epithelial cells.
[ Key words] Altiplano cardiopathy;VEGFR;Endostatin;Rhodila;Immunofluorescence histochemistry;Semi-quantitative
RT-PCR;Rat
[ 收稿日期] 2005-09-21 [ 修回日期] 2005-12-05
[ 基金项目] 国家自然科学基金资助项目(30160029)
[ 作者简介] 隋岫兰(1952—), 女(汉族), 辽宁省丹东市人 ,主
任医师。
＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
E-mail:sui@public.ls.xz.cn Tel:(0891)6272700-8655
高原低氧环境能诱导血管内皮细胞生长因子
(vascular endothelial growth factor ,VEGF)分泌增加[ 1] ,
血管内皮细胞生长因子受体 flt-1(fms-related tyrosine
kinase 1)和 KDR(kinase insert domain receptor)在介导
血管内皮细胞增殖 、血管形成及血管通透性等生物
活性中起非常重要的作用[ 2] 。内皮抑素是一种血管
生成抑制因子[ 3] ,能特异性抑制血管内皮细胞分裂 、
增殖 ,抑制血管的形成 。在正常组织中 ,内皮抑素与
VEGF 维持着内皮细胞生长的平衡。内皮抑素与
VEGF 受体在慢性高原心脏病发病过程中的作用目
前未见文献报道 ,我们在海拔 3 658m 及 4 500 m的
特殊地理环境中 ,建立高原心脏病大鼠的动物模型
并用红景天喂养大鼠 ,用免疫荧光组织化学和半定
量 RT-PCR方法检测各组大鼠心 、肺组织血管中内
皮抑素与VEGF 受体 flt-1和KDR的表达 ,探讨慢性
高原心脏病的发病机理并阐述红景天在高原病防治
中的作用。
DOI :10.16098/j.issn.0529-1356.2006.04.019
材料和方法
1.慢性高原心脏病大鼠模型建立
方法参见参考文献[ 4] 。Wistar大鼠(购自华西
医科大学动物实验中心)100只 ,雄雌各半 ,体重200
～ 250 g ,空运至拉萨(海拔 3 658 m),随机分为 4组:
第1组(对照组)在拉萨饲养 3个月;第 2组(吸烟 、
运动刺激组)在拉萨饲养 3个月 ,同时给予吸烟刺激
(将大鼠笼置于玻璃罩中 ,留一通气孔 ,将点燃香烟
放入笼内至慢慢燃尽为止 ,每次 10支香烟 ,每日 2
次)、运动刺激(用木棒搅动笼内大鼠或翻动鼠笼 ,使
大鼠来回跑动 ,每次 20min ,每日 2次)。第 3组(拟
高原心脏病组[ 4])在那曲(海拔4 500m)饲养3个月 。
第4组(治疗组)在那曲饲养 3个月 ,同时每天给予
红景天灌胃[红景天购自青海省三普药业公司;红景
天100 g(含红景天苷 0.4 g),水煎3次 ,收集煎出液 ,
浓缩至50ml ,即 1ml对应红景天 2 g ,按每百克体重
0.5ml灌胃] 。取各组大鼠心 、肺组织做冰冻切片 ,
厚6μm ,置 80%冷丙酮固定 15 min ,室温下干燥 ,待
用。
2.免疫荧光组织化学染色
冰冻切片用 PBS 漂洗 3次 ,分别用 1∶100 鼠抗
flt-1单克隆抗体 ,1∶100鼠抗 KDR单克隆抗体 ,及 1∶
100鼠抗内皮抑素单克隆抗体(以上抗体均购自
NEOMARKERS公司)37℃孵育 2 h ,PBS漂洗 3次 ,每
次10 min ,用 FITC 标记羊抗 IgG 抗体于 37℃孵育
1 h ,PBS漂洗 3次 ,每次 10 min ,荧光显微镜下观察 、
摄片 。同时每组随机取 1张大鼠心 、肺组织切片按
常规方法做HE染色 ,光镜下观察 、摄片。
3.半定量 RT-PCR检测mRNA水平
采用 Trizol试剂(Invitrogen 公司)提取各组大鼠
心 、肺组织总RNA 。取总RNA 2μg ,逆转录合成第一
链 cDNA。以第一链 cDNA为模板 ,PCR扩增内皮抑
素 ,KDR ,内对照为 GAPDH。引物设计如下:内皮抑
素上游引物 5′catactcaccaggactttcac3′, 下游引物 5′
cagaggccctatttggaga 3′; KDR 上 游 引 物 5′
ggcagcacgaaacattctcc3′,下游引物 5′catacaggaaacaggtgagg
3′;GAPDH 上游引物 5′ccatcaccatcttccaggag3′,下游引
物 5′cctgcttcaccaccttcttg 3′。PCR反应体系为:1μl逆
转录产物 cDNA ,2μl 10×PCR buffer ,2μl 2.5mmol/L
dNTPs ,1μl forward and reverse primer(10μmol/L),0.5
μl Taq DNA polymerase (5×106 IU L),加入无菌水至
总体积 20μl。扩增条件为:预变性 94℃5min ,变性
94℃40 s ,退火 56℃40s ,延伸 72℃40s ,循环 28次 。
1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 。经凝胶分析软
件(UVIsoft UVJB and windows application v97.04)对电
泳条带进行吸光度分析 ,分别计算出各个条带的吸
光度与内对照的比值 ,即为 mRNA的相对含量 。
结 果
1.内皮抑素和 VEGF受体 flt-1 、KDR的变化
观察大鼠心 、肺组织切片血管内皮细胞层绿色
荧光强度 ,以此反映内皮抑素和 VEGF 受体 flt-1 、
KDR表达水平 。刺激组心 、肺组织 flt-1 、KDR表达
水平高于对照组 ,而刺激组内皮抑素表达水平低于
对照组 。治疗组 flt-1 、KDR表达水平低于拟高原心
脏病组 ,而治疗组内皮抑素表达水平高于拟高原心
脏病组(图 1 ～ 7 ,肺组织切片 HE染色略)。
2.内皮抑素和 VEGF受体 KDRmRNA水平的变化
利用半定量 RT-PCR检测各组心 、肺组织内皮
抑素mRNA水平 ,结果显示刺激组与拟高原心脏病
组内皮抑素mRNA水平低于对照组 ,而治疗组内皮
抑素 mRNA 水平高于对照组(图 8)。半定量 RT-
PCR 检测对照组与拟高原心脏病组心 、肺组织
KDRmRNA水平 , 结果显示 , 拟高原心脏病组 KDR
mRNA水平高于对照组(图 9)。
图 8 半定量 RT-PCR检测内皮抑素 mRNA水平( x ±s)
Fig.8 The mRNA level of endostatin determined by semi-quantitative
RT-PCR( x ±s)
图 9 半定量 RT-PCR检测KDR mRNA 水平( x±s)
Fig.9 The mRNA level of KDR determined by semi-quantitative RT-
PCR.( x±s)
·437·Vol.37 , No.4 隋岫兰等.红景天对慢性高原心脏病大鼠心肺组织中内皮抑素和血管内皮细胞生长……
图 1a 对照组大鼠心脏组织内皮抑素阳性表达。 ×200(下同) 图 1b 刺激组大鼠心脏组织内皮抑素阳性表达 ,表达量低于对
照组。 图 1c 拟高原心脏病组心脏组织内皮抑素阳性表达。 图 1d 治疗组大鼠心脏组织内皮抑素阳性表达 ,表达量
高于拟高原心脏病组。
图 2a 对照组大鼠心脏组织 flt-1阳性表达。 图 2b 刺激组大鼠心脏组织 flt-1阳性表达 ,表达量高于对照组。 图 2c 拟高原
心脏病组心脏组织 f lt-1阳性表达。 图 2d 治疗组大鼠心脏组织 f lt-1阳性表达 ,表达量低于拟高原心脏病组。
图 3a 对照组大鼠心脏组织KDR阳性表达。 图 3b 刺激组大鼠心脏组织KDR阳性表达 ,表达量高于对照组。 图 3c 拟高原
心脏病组心脏组织KDR阳性表达。 图 3d 治疗组大鼠心脏组织KDR阳性表达 ,表达量低于拟高原心脏病组。
图 4a 对照组大鼠心脏组织。HE染色 图 4b 刺激组大鼠心脏组织。HE染色 图 4c 拟高原心脏病组大鼠心脏组织。HE染
色 图 4d 治疗组心脏组织。HE染色
图 5a 对照组大鼠肺组织内皮抑素阳性表达。 图 5b 刺激组大鼠肺组织内皮抑素阳性表达 ,表达量低于对照组。 图 5c 拟
高原心脏病组大鼠肺组织内皮抑素阳性表达。 图 5d 治疗组大鼠肺组织内皮抑素阳性表达 ,表达量高于拟高原心脏病
组。
图 6a 对照组大鼠肺组织 flt-1阳性表达。 图 6b 刺激组大鼠肺组织 flt-1阳性表达 ,表达量高于对照组。 图 6c 拟高原心脏
病组肺组织 flt-1阳性表达。 图 6d 治疗组大鼠肺组织 flt-1阳性表达 ,表达量低于拟高原心脏病组。
图 7a 对照组大鼠肺组织KDR阳性表达。 图 7b 刺激组大鼠肺组织KDR阳性表达 ,表达量高于对照组。 图 7c 拟高原心脏
病组肺组织KDR阳性表达。 图 7d 治疗组大鼠肺组织 KDR阳性表达 ,表达量低于拟高原心脏病组
·438· 解 剖 学 报 37卷 , 4 期
Fig.1a Expression of endostatin in heart of control rat group. ×200(The same below) Fig.1b Expression of endostatin in heart of
stimulated rat group , less than control group. Fig.1c Expression of endostatin in heart of alt iplano cardiopathy rat group. Fig.1d
Expression of endostatin in heart of treated group ,more than altiplano cardiopathy group.
Fig.2a Expression of f lt-1 in heart of rat control group. Fig.2b Expression of f lt-1 in heart of stimulated rat group , more than control rat
group. Fig.2c Expression of flt-1 in heart of altiplano cardiopathy rat group. Fig.2d Expression of flt-1 in heart of treated rat
group, less than altiplano cardiopathy rat group.
Fig.3a Expression of KDR in heart of cont rol rat group. Fig.3b Expression of KDR in heart of stimulated group ,more than control group.
Fig.3c Expression of KDR in heart of altiplano cardiopathy rat group. Fig.3d Expression of KDR in heart of treated group, less
than altiplano cardiopathy rat group.
Fig.4a Heart of control rat group.HE staining Fig.4b Heart of stimulated group.HE staining Fig.4c Heart of altiplano cardiopathy rat
group.HE staining Fig.4d Heart of treated rat group.HE staining
Fig.5a Expression of endostatin in lung of control rat group. Fig.5b Expression of endostatin in lung of stimulated group , less than rat control
group. Fig.5c Expression of endostatin in lung of altiplano cardiopathy rat group. Fig.5d Expression of endostat in in lung of
treated group ,more than altiplano cardiopathy rat group.
Fig.6a Expression of flt-1 in lung of control rat group. Fig.6b Expression of flt-1 in lung of stimulated rat group , more than control rat group.
Fig.6c Expression of flt-1 in lung of altiplano cardiopathy rat group. Fig.6d Expression of flt-1 in lung of treated rat group , less
than altiplano cardiopathy rat group.
Fig.7a Expression of KDR in lung of control rat group. Fig.7b Expression of KDR in lung of stimulated group , more than control rat group.
Fig.7c Expression of KDR in lung of altiplano cardiopathy rat group. Fig.7d Expression of KDR in lung of treated rat group , less
than altiplano cardiopathy rat group.
讨 论
高原心脏病是低氧性疾病 ,低氧能引起血管内
皮细胞损伤 ,血管内皮细胞生长因子分泌增加[ 5] 。
我们将Wistar大鼠移居高原 ,分为 4组 ,检测 VEGF
受体 flt-1 、KDR和内皮抑素的表达水平。研究结果
表明 ,在低氧高寒地区经运动 、吸烟刺激的大鼠 ,
VEGF 受体 flt-1 、KDR表达增加 ,而内皮抑素表达减
少 ,说明在低氧环境超负荷运动 ,可增加血流速度 ,
加速血管内皮细胞的损伤 ,长期大量的吸烟 ,可以损
伤气管 、支气管黏膜 ,影响气体中的氧与血液中二氧
化碳的交换 ,加重组织缺氧。VEGF 是一种高度特
异的血管内皮细胞有丝分裂素 ,具有双重功能 ,增加
微血管的通透性 ,为血管形成过程中多种细胞迁移
提供一个纤维网络;它通过与内皮细胞上两个特异
受体 flt-1和 KDR作用 ,直接刺激内皮细胞增殖[ 5] 。
拟高原心脏病大鼠心 、肺组织 flt-1和 KDR表达增
强 ,进一步证实慢性高原心脏病发病与内皮细胞损
伤密切相关 。高原地区氧分压明显低于平原 ,随着
氧分压的下降 ,慢性高原病患病率增加 。
内皮抑素是一种内生性蛋白质 ,能抑制血管内
皮细胞增殖和迁移。其在拟高原心脏病大鼠心肺组
织血管内膜表达减少 ,可能是血管内皮细胞生长因
子分泌增加抑制内皮抑素的分泌。治疗组大鼠经红
景天治疗后内皮抑素表达增加 。这说明在高原低氧
环境中 ,血管内皮细胞保持完整光滑时 ,内皮抑素分
泌增加 ,而血管内皮细胞生长因子分泌减少 ,可防止
血管腔狭窄。
红景天生长于高海拔地区 ,在治疗头晕 、心悸 、
胸闷方面取得了良好效果 。已有研究证实 ,红景天
具有活血 、化淤 、抗衰老 、抗疲劳的药理作用[ 6] ,红景
天是否对血管内皮细胞有保护作用未见报道 ,我们
的实验结果显示 ,治疗组大鼠与拟高原心脏病组大
鼠相比VEGF受体 flt-1和 KDR表达降低 ,而内皮抑
素表达增强。说明红景天能抑制大鼠心 、肺组织血
管内皮细胞增殖和迁移 ,保护血管内膜完整 ,使血流
畅通 ,从而降低肺循环阻力 ,提高氧含量 ,起到保护
心 、肺组织的作用 。
参 考 文 献
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(编辑 郭崇洁)
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