全 文 ：2007年第20卷第3期 GansuJournalofTCM,2007Vol.20No.3甘肃中医
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·实验研究·
甘南野生狭叶红景天与四裂红景天的rRNA基因
间隔区PCR产物电泳图谱的初步研究
刘丽莎 1，王 昕 1，杜 平 2，顾秀琰 3
(1甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2 甘南藏族自治州林业技术综合服务中心；3 甘肃省中医院 )
摘 要 目的：分析甘肃省甘南地区野生狭叶红景天与四裂红景天中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔
区PCR扩增产物的电泳图谱，为不同品种鉴别和品质评价从分子水平提供依据。方法：提取2种红景天中药材的
核基因组DNA，利用合成的特异性PCR引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔序列进行nPCR扩增，扩增产
物进行琼脂糖凝胶电泳以得到电泳图谱并进行分析。结果：琼脂糖凝胶电泳图谱显示不同种红景天的rRNA基因
内转录间隔区ITS1序列长度均在340bp左右，ITS2序列长度均在410bp左右，且具有明显的可比性。已具备足
够的遗传信息量进行碱基序列分析。结论：不同DNA中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物可作为从分子水平
进行鉴别的标记之一。
关键词 狭叶红景天；四裂红景天；rRNA；PCR；电泳；甘南
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1004-6852(2007)03-0048-02
红景天为景天科红景天属(RhodiolaSP)多年生草本或
亚灌木植物。始载于公元8世纪藏医药经典《 四部医典》《 月
王药珍》等藏医药著作。全世界有90多种，中国有70余种。
狭叶红景天Rhodiolakirilowi(Regel)Maxim.产于甘肃、青
海、西藏、四川、河北等地，生长于海拔2000～5600m的山地、
多石草地、林缘、灌丛或山坡上。四裂红景天 Rhodiola
quadrifida(pal)fisch.etMay产于甘肃、青海、西藏、四川、新
疆等地，生于海拔2900～5100m的沟边、山坡、石缝中。近年
来，由于市场需求逐年增加，加之乱采乱挖，致使野生资源日
益枯竭。所以，大量繁殖和引种栽培已成为一个亟需解决的
大问题。本文对不同来源红景天基因组DNA中rRNA基因内
传录间隔区PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析，以期从
分子水平对红景天不同品种的鉴别和品质进行初步研究。
1 实验材料、试剂及仪器
1.1 实验材料 狭叶红景天 Rhodiolakirilowi(Regel)
Maxim.，四裂红景天 Rhodiolaquadrifida(pall)fisch.et
May的干燥根。
1.2 实验试剂 UNIQ-10柱式植物基因组抽取试剂盒；
PCR引物序列；即用PCR扩增盒(均由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成)。
1.3 实验仪器 GeneAmpPCRsystem2400，ATphaz-
magerTM凝胶成像系统；DYY-12型电泳仪；台式高速离心机
(以上设备均由甘肃中医学院中心实验室提供)。
2 实验设计原理及技术线路
2.1 实验设计原理 在真核细胞的DNA中，转录rRNA的
基因结构中具有不同的序列区域(图1)，在18S与5.8S
之间、5.8S与26S之间均具有进化较快，不同物种差异
较大的内转录间隔区，而利用DNA提取技术和PCR技术对
不同中草药的这2个间隔区ITS1、ITS2利用特异性引物进
行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱显示出不同
物种的特异性，可以此作为中药材的分子标记之一(条件
许可时，PCR产物进行碱基序列测定，则可得到某一物种
rRNA基因内转录间隔区碱基序列图，更可作为分子水平
鉴定的有效标记)。
2.2 实验技术线路 标本处理→DNA提取→模板制备→
PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳→电泳图谱结果确定。
2.3 实验方法
2.3.1 标本DNA提取及模板制备 采用UNIQ-10柱式植
物基因组抽取试剂盒提取2个样本的模板DNA，根据用途
样品可于4℃或-20℃保存。
2.3.2 引物设计 上网检索美国国立生物信息中心
(NCBI，网址http：//www.Ncbi.nlm.nih.gov/)核酸库中已
登录的rRNA基因，在保守区设计5条寡核苷酸引物。引物
序列如下：ITS1P-P1(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)；ITS1P1
(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA)；ITS1P2(5-GCTGCGTTCTTCATG-
GATGC)；ITS2P1(5-GGATCGATGAAGAACGCAGC)；ITS2P2(5-TCC-
TCCGCTTATTGATATGC)。
2.3.3 扩增模式 见图1。先用引物 ITS1P-P1和 ITS2P2
扩增rRNA基因内转录间隔区全序列；其扩增产物经纯水
稀释后，再分别应用引物ITS1P-P1和ITS1P1扩增ITS1序
列；引物ITS2P1和ITS2P2扩增ITS2序列。由此完成巢式聚
合酶链式反应(nesledPolymeraseChainReactionnPCR)。
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2.3.4 扩增体系参数 优化后的扩增体系为上、下游引物
各1μL，2×PCRmaster25μL，模板6μL，双蒸水17μL，
总反映体系50μL。热循环参数均为94℃预变性5min，
然后按94℃40s→55℃30s→72℃60s，共循环30个周
期。最后1个周期72℃延长至5min。
2.3.5 PCR扩增产物电泳 将经 nPCR扩增后的模板在
1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以证实各种红景天rRNA基因内
转录间隔区(ITS1，ITS2)PCR扩增产物的存在。电泳结果在
透射式紫外灯下观察，应用ATphazmagerTM型凝胶成像系
统进行分析，并照相、确定PCR产物的bp值范围。
3 不同红景天rRNA基因内转录间隔区(ITS1)的PCR产物
电泳结果
电泳图谱见图2。
图2 2种来源红景天rRNA基因内转录间隔区
(ITS1区段，ITS2区段)nPCR产物电泳图谱
1.狭叶红景天ITS2区段 2.四裂红景天ITS2区段
3.狭叶红景天ITS1区段 4.四裂红景天ITS1区段
电泳图谱显示不同种红景天DNA中rRNA基因间隔区
(ITS1)的PCR产物均产生了清晰、明亮的扩增条带，说明应
用特异性引物对不同来源红景天的rRNA基因内转录间隔
区行nPCR扩增达到了预期目的。经与Mark条带对比分
析，确定不同种红景天的rRNA基因内转录间隔区ITS1序
列长度均在340bp左右，ITS2序列长度均在410bp左右，
且具有明显的可比性。
4 讨论
4.1 已有的分子生物学技术鉴定植物中药材的方法 随
着分子生物学技术的进展，中药材的鉴定从最初的性状鉴
定，以至后来所形成的显微、理化、色谱及光谱等方法的应
用已发展到了DNA指纹图谱鉴定等分子水平。20世纪末，
国内学者应用随机扩增多态及DNA测定等技术进行植物
类中药材的鉴定。DNA分子遗传标记技术因不受药材的生
长条件等因素的影响，能够在分子水平刻画野生和栽培品
种遗传背景的DNA指纹图谱的差异，为野生和栽培品种的
生药鉴别以及对野生药材优质种质资源筛选和开发 (育
种)提供重要参考。
4.2 应用本研究方法鉴定植物性中药材的优点 RAPD
技术有无须事先知道受试药材的基因组序列的优点，但
RAPD实验条件苛刻，任何条件的改变都将影响实验结果，
同时还存在结果判断的主观性较强的缺点，而本研究中，
通过柱式提取，无需酚和氯仿抽提，无需乙醇沉淀等繁琐
步骤，并且DNA纯度好、得率高、无杂质和RNA污染。由于
采用 nPCR扩增技术，故检测灵敏度极高。国内外已有
nPCR研究报告中均认为受检标本中只要有一个拷贝的靶
基因，即可被nPCR扩增检出。本文对不同红景天的rRNA
基因内转录间隔区经nPCR扩增后，其PCR产物电泳图谱
显示出清晰、明亮的条带，ITS1序列长度均在340bp左右，
ITS2序列长度均在410bp左右，已具有足够多的遗传信息
可供鉴别药材使用，具有明显的可比性，从而为碱基测序
奠定了基础(若条件允许，对不同品种来源红景天基因组
DNA中等rDNA基因内转录间隔区进行DNA碱基序列的测
序，则更能从碱基排列顺序比较他们的不同，并可以从分
子水平作为鉴定植物性中药材的分子标记之一)。此亦为
野生红景天的引种、栽培提供了分子水平的参考依据。目
前植物性中药材基因组序列绝大部分没有阐明，我们利用
真核细胞中18S-5.8S、5.8S-26SrDNA基因的保守区序
列，自行设计引物，利用巢式扩增得到18S-5.8S第一间
隔区，以及5.8S-26S第二间隔区。由于生物rRNA基因内
转录间隔区是中度保守的，存在科、属、种，甚至株之间的
差异，一般用于属、种以下鉴定。因此近年来已被国内外学
者广泛用于真核生物或原核生物物种鉴别。本文提示：植
物性中药材rRNA基因内转录间隔区的扩增具有重复性较
好，特异性强的优点，且可从分子水平显示对比结果，具有
一定的先进性。
4.3 本研究方法应用展望 本方法在真核生物rRNA基
因保守区设计引物，因此尽管国内植物性中药材绝大多数
(包括我国特有的药材)基因组序列尚不明了，但仍有分析
区别的可能，且DNA提取只需微量种子或药材标本，引物
一旦确定，则可对多种标本进行rRNA基因内转录间隔区
扩增，若能将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析的同时，
再进行扩增产物碱基测序，其结果则更可反映植物性中药
材的种、属的特异性。若能尽早对国内道地植物性中药材
进行DNA的提取，及rDNA基因内转录间隔区PCR扩增，并
进行碱基序列分析，建立起道地中药材rRNA基因内转录
间隔区PCR指纹图谱和碱基序列数据库，则有望建立一种
新的、可靠的、利用分子生物学理论和技术对中药材进行
质量监控和鉴定的有效方法和途径。
参考文献
［ 1］ 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志：34卷：第1分
册［ M］.北京：科学出版社，1995：174.
［ 2］ 姬可平，刘丽莎，张西玲，等.家种及野生秦艽麻花秦艽的
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［ 3］ 虞泓，朱荣勋，李永谊，等.云南常见药用红景天的RAPD分
析［ J］.中草药，2005，36(1)：101-104.
［ 4］ 李国利，庄玉辉，赵铭，等.16S-23SrDNA内转录间隔区序
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(收稿日期 2006-10-26)
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