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应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2016，22 ( 2 ) : 0179-0183
2016-04-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2015.05015
植物生存依赖诸多条件，其中包括外部环境条件和自
身内部因素. 就外部环境因素而言，温度绝对是关系植物
生存非常重要的因素之一，其中，低温很容易影响植物的
生长发育，造成植物减产，甚至是大规模的死亡 [1]. 因此研
究植物的抗寒机制对于改良植物抗寒基因、降低低温寒害
造成的农作物损失等方面具有重要意义.
植物的抗寒能力直接受到抗寒基因如COR、KIM等表
达的影响，抗寒基因的诱导表达能引起植物一系列生理生
化变化，提高植物抗寒能力. 植物抗寒基因的激活受到一
系列转录因子的调控，其中，CBF是激活植物冷响应基因
表达的顺式调控元件，CBF1蛋白能特异性结合冷响应基因
收稿日期 Received: 2015-05-14 接受日期 Accepted: 2015-11-25
*国家自然科学基金项目（31171447）和四川省科技厅项目 （2014GZX0005、
2015JPT0032、15010302）资助 Supported by the National Natural Science
Foundation of China (31171447) and the project of the Science and Technology
Department of Sichuan Prouince (2014GZX0005, 2015JPT0032, 15010302)
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: scuqiaodr@163.com)
播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其
蛋白质的EMSA试验分析*
陈麒名 常菲菲 李 茜 刘 博 田 磊 陈天盈 徐 辉 乔代蓉**
四川大学生命科学学院微生物与代谢工程四川省重点实验室 成都 610064
摘 要 CBF（C-repeat binding factor）是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子，可与下游冷应答基因
启动子的核心序列CBT/DRE元件（CCGAC）特异性地结合，启动耐寒基因的表达，提高植物的抗寒能力. 为揭示
播娘蒿（Descurainia sophia）的抗寒机制，研究播娘蒿转录因子DsCBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒
基因表达的作用. 首先分析DsCBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性，设计重叠延伸PCR引物，定点突变DsCBF1
基因；然后构建pET32a-DsCBF1突变体原核表达载体，通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21（DE3）中，进行原
核表达，并通过镍离子亲和层析纯化DsCBF1突变体蛋白；最后利用化学发光法EMSA试验（Electrophoretic mobility
shift assay）方法分析DsCBF1蛋白与含有CRT/DRE元件的DNA探针之间的相互作用. EMSA试验分析显示，播娘
蒿DsCBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F（TTT）和68位缬氨酸V（GTT）分别突变为精氨酸R（CGT）和谷氨酸E
（GAA），导致播娘蒿顺式调控因子DsCBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势，
说明播娘蒿DsCBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力. 本研究表明播娘蒿DsCBF1的
AP2区域的57位苯丙氨酸F（TTT）和68位缬氨酸V（GTT）位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用. （图7
表1 参19）
关键词 播娘蒿；CRT/DRE元件；AP2区域；重叠延伸PCR；pET32a-DsCBF1突变体；EMSA
CLC Q945.78 : Q78
Construction of transcription factor DsCBF1 mutant and EMSA analysis of its
protein*
CHEN Qiming, CHANG Feifei, LI Qian, LIU Bo, TIAN Lei, CHEN Tianying, XU Hui ＆ QIAO Dairong**
Microbiology and Metabolic Engineering Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
Abstract CBF (C-repeat binding factor) is a transcriptional activator related to the regulation of plant cold acclimation gene
expression, and AP2 domain of CBF protein can specifi cally bind with CBT/DRE element of cold-responsive gene promoter,
which switches on the expression of anti-cold gene and improves plant cold hardiness. To reveal the anti-cold mechanism of
Descurainia sophia and the mechanism of how AP2 domain of CBF protein activates the expression of its downstream genes, we
analyzed the hydrophobic amino acids of AP2 domain of CBF protein, designed PCR primer to mutant DsCBF1 gene, constructed
mutant pET32a-DsCBF1 prokaryotic expression vector, transformed it into E. coli BL21(DE3) by freeze-thaw method, expressed
and purifi ed DsCBF1 mutant proteins by nickel ion affi nity chromatography. After that we analyzed using EMSA the interaction
between DsCBF1 mutant protein and DNA probe. The EMSA results showed that the mutation of the 57th and the 68th amino
acid sites in the AP2 region of D. sophia from F(TTT) and V(GTT) to R(CGT) and E(GAA) respectively, leading to an obvious
decline of binding DsCBF1 with its downstream genes, thereby affecting the freeze resistance of D. sophia. The reults suggested
that the 57th amino acid site F and the 68th amino acid site V play an important role in the cold acclimation of D. sophia.
Keywords Descurainia sophia; CBT/DRE element; AP2 domain; SOE-PCR; pET32a-DsCBF1 mutant; EMSA
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2期播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的⋯⋯
启动子的核心序列CBT/DRE元件，启动抗寒基因的表达 [2].
迄今为止，CBF基因已经在许多十字花科植物中有发现，
常见的十字花科植物有拟南芥[3-4]、油菜[5]等.
播娘蒿属于十字花科，来源于青藏高原，是一种极
端耐寒的植物. 此前有研究报道，播娘蒿DsCBF1顺式调控
因子与DsCOR启动子上的核心序列CRT/DRE元件有特异性
结合，但是并未在此基础上进一步确定结合到COR启动子
核心区域的CBF的AP2区域核心序列. 在此基础上，本研究
探讨播娘蒿DsCBF1基因AP2区域的编码氨基酸的功能，利
用SOE-PCR定点突变的方法构建突变体，利用镍离子亲和
层析方法纯化突变体蛋白，利用化学发光法EMSA反映播
娘蒿突变体蛋白与含有冷诱导基因DsCOR启动子核心元件
CRT/DRE的DNA探针之间的结合效率，进而通过结合效率
的高低发现影响植物播娘蒿抗寒能力的重要氨基酸位点.
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌 种　　大肠杆菌BL21（DE3）购于宝生物公司；含有
DsCBF1-pET32a重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）由本实验
室构建并保存.
1.1.2 主要试剂　　常用试剂均为国产分析纯；限制性内
切酶、高保真DNA聚合酶、R NA酶、氨苄青霉素青霉素
（Amp）、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自于TaKaRa生物
工程公司；胶回收试剂盒购于TIANGEN生物公司；化学发光
法EMSA试剂盒购自于成都碧云天公司；DNA探针由上海英
潍捷基测序公司合成.
1.1.3 主要仪器设备　　PCR仪，恒温摇床，恒温培养箱，紫
外分光光度法，高速冷冻离心机，超声波破碎仪，SDS-PAGE
电泳仪等.
1.2 方 法
1.2.1 获得播娘蒿DsCBF1基因AP2区的突变位点　　利用
酶BamHI和SacI双酶切实验室已经构建好的质粒DsCBF1-
pET32a，胶回收大小约642 bp的目的片段，送样测序，测序结
果提交到NCBI数据库，通过blast序列比对确定获得正确的目
的片段DsCBF1 ORF.
提交DsCBF1 ORF片段到NCBI数据库，通过blast序列
比对，获取几种亲缘性近的常见十字花科植物的CBF1片段
信息，如拟南芥、烟草 [7]、油菜、萝卜 [8]等. 分析这些CBF1
基因AP2区域蛋白编码序列的疏水性，从中找出播娘蒿
DsCBF1基因AP2区域氨基酸位点和其他植物该氨基酸位点
疏水性差异的位点. 根据这些位点的信息，设计含有该位
点突变碱基的引物，利用高保真DNA聚合酶，进行重叠延
伸PCR实验[9-10]，胶回收定点突变的DNA片段.
1.2.2 构建播娘蒿DsCBF1突变体　　经过重叠延伸PCR方
法，胶回收获得突变DsCBF1片段，利用XhoI和EcoRI双酶
切后，连接到经过同样方法双酶切后质粒pET32a上，构建
pET32a-DsCBF1原核表达载 [11-12]. PCR验证目的DNA条带转化
成功后，送交测序，测序结果利用软件vector NTI分析确定播
娘蒿DsCBF1的AP2区域氨基酸57位、68位点突变结果.
1.2.3 IPTG诱导突变体蛋白的表达　　参见文献[13]，接种测
序验证正确的DsCBF1突变体菌株，按1%的接种量，接种到
含50 μg/mL氨苄青霉素的试管LB液体培养基中，37 ℃、180
r/min条件下振荡培养过夜，再次按1%的接种量接种到试管
LB液体培养基中，培养条件分别按照培养时间、培养温度
和IPTG诱导浓度分组讨论，IPTG溶液在菌液OD600值约为0.6
时添加. 其中，培养时间为1 h，2 h，3 h，4 h和5 h；培养温度
为20 ℃，28 ℃和37 ℃；IPTG诱导浓度为0.125 mmol/L，0.25
mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L和2 mmol/L. 待培养结束，离
心收集菌体，分别加入500 μL 1 × PBS缓冲液，超声波破碎细
胞（工作3 s，间歇8 s，破碎功率100 W）2 min，再次离心，收
集上清，按20%的量加入loading buffer，煮沸10 min，12 000 r/
min离心，上样进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的诱导表达
情况.
1.2.4 镍离子亲和层析纯化蛋白　　按照摸索出来的DsCBF1
突变体蛋白最适诱导表达条件培养1 L的菌液，离心收集菌
体，加入20 mL冰预冷的1 × PBS缓冲液重悬菌体，超声波破
碎细胞30 min（工作3 s，间歇8 s，破碎功率为100 W）. 4 ℃，
12 000 r/min离心10 min取上清液进行Ni亲和层析纯化蛋白[14].
收集洗脱液样品进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白纯化效果.
1.2.5 EMSA试验分析　　送测序公司合成大小50 bp的DNA
探针寡核苷酸序列：Sense：5’TGTATACATAACCACAACTT
CATGGCCGACCTATATTTTTTTTTCTTTTT3’；Anti：3’AC
ATATGTATTGGTGTTGAAGTACCGGCTGGATATAAAAAAA
AAGAAAAA5’.
各取10 μL体积DNA的寡核苷酸序列于灭菌后的薄壁塑
料管中，37 ℃水浴30 min，自动退火后，4%琼脂糖凝胶电
泳检测DNA探针大小. DNA探针和播娘蒿DsCBF1突变体蛋
白样品的处理如表1所示，按照EMSA试剂盒说明书对电泳
后凝胶进行染色[15].
表1 EMSA实验的样品和对照处理
Table 1 Sample and control processing
编号
Number
DNA探针体积(V/μL)
Volume of DNA probe
蛋白质体积(V/μL)
Volume of protein
成分E (V/μL)
Component E
dH2O (V/μL)
dH2O
成分D (V/μL)
Component D
1 1 3 2 4 2
2 1 6 2 1 2
3 1 3 2 4 2
4 1 6 2 1 2
5 0 0 2 8 2
6 1 0 2 7 2
7 0 6 2 2 2
实验组①和②号的蛋白样品为播娘蒿DsCBF1突变体蛋白；对照组③和④号的蛋白样品为前期实验得到的播娘蒿DsCBF1蛋白；成分D和成分E是EMSA试剂
盒中的试剂.
Experimental protein samples of group ① and ② are DsCBF1 mutant proteins; contrastive protein samples of group ③ and ④ are preliminary obtained DsCBF1 protein;
component D and component E are EMSA kit reagents.
18122卷
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陈麒名 等
2 结果与分析
2.1 确定播娘蒿DsCBF1基因AP2区57位、68位氨基酸
突变位点
将实验室前期得到的 pET32a-D sCBF1载体通过酶
BamHI和SacI双酶切，获得大小约642 bp的目的条带，提交测
序结果到NCBI 数据库，blast比对证实为正确的DsCBF1 ORF.
多序列比对（图1）获得的DsCBF1的AP2区域编码氨基酸序
列和其他几种常见十字花科植物的CBF1编码氨基酸序列的
差异位点，并分析其疏水性（图2），结果找到AP2区域内的
57位苯丙氨酸F（TTT）和68位缬氨酸V（GTT），据此设计引
物，将该两处位点疏水性氨基酸分别变为亲水性的精氨酸R
（CGT）和谷氨酸E（GAA）.
图1 多序列比对CBF1的编码氨基酸序列. 选取了6种CBF1序列重复性较
高的十字花科植物进行多序列比对.
Fig. 1 Alignment of CBF1 sequences. Six kinds of high repetitive CBF1
sequences of cruciferous plants were selected to align.
图2 播娘蒿DsCBF1 ORF的蛋白编码序列. 根据网站http://web.expasy.
org/translate/翻译氨基酸序列，氨基酸的正负值分别表示该氨基酸为疏
水性和亲水性.
Fig. 2 The protein coding sequence of DsCBF1 ORF. Data obtained from
http://web.expasy.org/translate/. The positive values denote hydrophobic amino
acid; the negative values denote hydrophilic amino acid.
2.2 IPTG溶液诱导表达条件的确定
通过序列分析，确定播娘蒿DsCBF1的AP2区域氨基酸
57位、68位点突变正确，碱基分别由TTT和GTT突变为CGT
和GAA，成功构建了播娘蒿DsCBF1突变体. 播娘蒿DsCBF1
突变体蛋白诱导表达时间（图3）、诱导表达温度和IPTG
溶液浓度（图4）结果显示，28 ℃、0.5 mmol/L IPTG溶液浓
度诱导表达3 h，细胞破碎上清液中有大量的播娘蒿DsCBF1
突变体蛋白表达.
图3 播娘蒿DsCBF1突变体蛋白诱导表达时间. Lane 1-5：诱导表达时间
分别为1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，箭头所指为大小约48 × 103（Mr）目的
蛋白；M：116 × 103（Mr）蛋白marker.
Fig. 3 Induction time for expression of DsCBF1 mutant protein. Lane 1-5:
Induction time of 1 h, 2 h, 3 h, 4 h and 5 h respectively. The arrow indicates the
Mr 48 × 10
3 target protein. M: Mr 116 × 10
3 protein marker.
图4 播娘蒿DsCBF1突变体蛋白诱导表达温度和IPTG浓度. Lane 1-5：
IPTG溶液浓度分别为0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0. 5 mmol/L、1 mmol/L
和2 mmol/L；Lane 6-8：诱导温度分别为20 ℃、28 ℃和37 ℃. M：116 ×
103（Mr）蛋白marker.
Fig. 4 Induction temperature and concentration of IPTG for expression of
DsCBF1 mutant protein. Lane 1-5: IPTG concentration of 0.125 mmol/L, 0.25
mmol/L, 5 mmol/L, 1 mmol/L and 2 mmol/L respectively; Lane 6-8: Induction
temperature of 20 °C, 28 °C and 37 °C, respectively. M: Mr 116 × 10
3 protein
marker.
2.3 镍离子亲和层析纯化蛋白结果
播娘蒿DsCBF1突变体蛋白和未突变蛋白于28 ℃，180
r/min，0.5 mmol/L IPTG溶液条件下诱导表达3 h，大量表达
的蛋白存在细胞破碎液的上清中，离心，经镍离子亲和层
析纯化，在不同浓度咪唑溶液的洗脱下，收集出峰时候的
洗脱液，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况（图5）.
蛋白大小正确，纯度足够用于后续的EMSA实验.
图5 镍离子亲和层析纯化蛋白结果. Lane 1-8：紫外检测出峰时收集到
的不同咪唑浓度洗脱的蛋白；M：116 × 103（Mr）蛋白marker.
Fig. 5 Purification result of target protein via nickel ion affinity
chromatography. Lane 1-8: imidazole of different concentration to elute the
target protein; M: Mr 116 × 10
3 protein marker.
2.4 突变体蛋白和DNA探针结合的EMSA实验
本研究所用到的D N A探针序列是送引物合成公司
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2期播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的⋯⋯
直接合成的含有抗寒基因启动子核心序列CRT/DRE元件
（CCGAC）及TATA-box结构. 分别加入10 μL合成的DNA
单链到灭菌后的薄壁塑料管中，放入37 ℃水浴半个小时，
自行退火后获得探针. EMSA实验的样品及对照处理后进行
SDS-PAGE电泳，凝胶显影结果显示播娘蒿DsCBF1的57位
和68位编码氨基酸的突变导致顺式调控因子结合下游抗寒
基因的CRT/DRE元件的效率下降，其中，68位氨基酸位点
的突变影响较大（图6、图7）.
图6 SYBR®Green染料染色结果. Lane 1-7：分别代表样品播娘蒿
DsCBF1的57位突变体蛋白和对照处理的实验编号⑦⑥⑤④③②①；
Lane 8-14：分别代表样品播娘蒿DsCBF1的68位突变体蛋白和对照处理
的实验编号①②③④⑤⑥⑦；箭头从上到下所指分别为蛋白结合探针
后着色和剩余DNA探针着色后的情况.
Fig. 6 SYBR®Green dye results. Lane 1-7: the experimental number
⑦⑥⑤④③②① for the 57th DsCBF1 mutant protein samples and control
treatments respectively; Lane 8-14: the experimental number ①②③④⑤⑥⑦
for the 68th DsCBF1 mutant protein samples and control treatments
respectively; the upper arrow: the protein binding with the probe; the lower
arrow: the protein binding with the remaining DNA probes.
图7 SYPRO®Ruby染料染色结果. Lane 1-7：分别代表样品播娘蒿
DsCBF1的57位突变体蛋白和对照处理的实验编号⑦⑥⑤④③②①；
Lane 8-14：分别代表样品播娘蒿DsCBF1的68位突变体蛋白和对照处理
的实验编号①②③④⑤⑥⑦；箭头所指为SYPRO®Ruby染料染色蛋白后
的情况.
Fig. 7 SYPRO®Ruby dye results. Lane 1-7: the experimental number
⑦⑥⑤④③②① for the 57th DsCBF1 mutant protein samples and control
treatments respectively; Lane 8-14: the experimental number ①②③④⑤⑥⑦
for the 68th DsCBF1 mutant protein samples and control treatments
respectively; arrow: the dyed protein.
3 讨 论
3.1 播娘蒿DsCBF1基因AP2区域编码氨基酸的突变
位点
AP2家族是一个大的植物特异性转录因子家族，包括4
个主要的亚家族：AP2、RAV、ERF和DREB亚科[16]. 其中，
许多胁迫诱导DREB的亚家族成员已经被分离和鉴定. AP2/
ERF家族最早在拟南芥同源基因APETALA 2中发现，一个
类似的结构域在烟草乙烯-反应元件结合蛋白（EREBPs）
中被发现，这些结构域由大约60个残基组成，彼此密切相
关 [17-18]. 有报道称，拟南芥DREB蛋白编码的AP2区域的14
位、19位氨基酸很保守，对于拟南芥CBF调控下游冷响应
基因的表达具有重要作用 [16]. 为了分析CBF1编码氨基酸多
态性对植物抗寒能力的影响，本研究通过多序列比对播娘
蒿和其他几种常见十字花科植物的CBF1编码氨基酸序列，
在55位至115位氨基酸内，发现了十几处具有明显差异的氨
基酸残基位点. 通过针对这十几处位点设计引物，构建定
点突变，最后成功构建了两个播娘蒿DsCBF1突变体.
3.2 播娘蒿DsCBF1突变体蛋白表达条件优化
前期实验就播娘蒿DsCBF1蛋白的诱导表达条件进行了
预实验摸索条件，发现28 ℃、0.5 mmol/L IPTG溶液诱导培
养3 h为其最适诱导表达条件，基于此，本研究根据该诱导
条件进一步摸索播娘蒿DsCBF1突变体蛋白的诱导表达条
件，其中，摸索的3个温度20 ℃、28 ℃和37 ℃为3个常见的
微生物生长温度条件，而且37 ℃为大肠杆菌的最适生长温
度，但该温度条件下菌体破壁后上清液中播娘蒿DsCBF1突
变体蛋白含量很低，推测原因可能是蛋白以包涵体形式表
达而无法出现在细胞质中行使功能. 最终确定在28 ℃，加
IPTG浓度为0.5 mmol/L条件下诱导表达3 h，播娘蒿DsCBF1
突变体蛋白在菌体细胞液的上清中以有生物活性的融合蛋
白形式大量表达.
3.3 播娘蒿DsCBF1突变体蛋白的EMSA实验分析
对DREB1A和DREB1A菌体的结合偏好的详细分析表
明，这些蛋白质对DRE核心序列A/GCCGAC的亲和力最高.
有报道称，CBF蛋白与DRE/CRT元件结合时TATA-box结构
可能起一定作用 [6]，基于此，本研究设计的DNA探针寡核
苷酸单链不仅包含了CRT/DRE核心序列CCGAC，还含有两
个TATA-box结构，加强探针和蛋白的结合. 另外，EMSA
的DNA探针不能太长，太长的探针可能会因为其他的蛋白
结合区域或者不同的结构而不能与目的蛋白结合，因此最
好小于300 bp，这样有利于DNA探针与目的蛋白的结合. 因
此，本研究直接合成了含有播娘蒿COR基因启动子中核心
元件的DRE/CRT序列（CCGAC），大小50 bp的DNA探针.
另外，AP2区在-5-30 ℃范围内稳定性很强[19]，稳定了CBF1
蛋白在低温条件下的调控功能，从而保证了其在低温下与
抗寒基因启动子区的核心序列CRT/DRE结合，激活抗寒基
因的表达，提高植株的抗寒能力. 因此，本研究将DNA探
针和蛋白结合的孵育温度设置为20 ℃.
播娘蒿 D s C B F 1突变体蛋白经过 S Y B R ®G r e e n和
SYPRO®Ruby染料着色后，显影结果显示57位苯丙氨酸和68
位缬氨酸的突变结果存在一定的差异，前者和DNA探针结
合程度明显高于后者，这可能是因为68位缬氨酸突变造成
了蛋白的空间构象变化更大，对蛋白的功能影响也更大，
从而影响其和下游冷响应基因的结合效率，影响冷响应
基因的表达，从而降低了播娘蒿植株的抗寒能力. 此外，
本研究纯化得到的目的蛋白浓度偏低且没有定量分析，后
续工作还需要从诱导表达和纯化两个方面提供目的蛋白的
浓度，绘制蛋白标准曲线，定量控制蛋白的浓度，在此基
础上，进一步分析该位点氨基酸突变对目的蛋白功能的影
响，再结合该目的蛋白体内方面的实验研究，进一步说明
研究的播娘蒿DsCBF1突变的氨基酸位点对于植株抗寒性的
重要作用.
18322卷
http://www.cibj.com/ Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
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