全 文 ：2 01 2 年 月
第 卷 第 期
四川大学学报 自然科学版
一
播娘篙叶绿体型 ■ 脱饱和酶的功能研究
李 湘 ,叶华勋 ,兰利琼 ,傅华龙 ,汪乐霓 ,陈 波 ,卿人韦
四川大学生命科学学院 ,成都
摘 要 本文应用 一 和 方法扩增出了的播娘篙叶绿体型 ■ 脱饱和酶
全长 。 ,其完整编码框为 ,编码 个氨基酸 该基 因 在 酵母
“。。 ` 中的表达阐明其功能为将 凸脱饱和生成亚油酸 ■, ` 进
一步切除叶绿体信号肤后的脱饱和酶在酵母中把 护 脱饱和生成 ■, 的效率提高了
通过 分析转基因酵母的磷脂及酞基辅酶 库发现 ,该脱饱和酶的作用底物
为磷脂 ,而不是以酞基辅酶 形式结合的脂肪酸
关键词 播娘 篙 脂肪酸脱饱和酶 底物类型 酞基辅酶 库
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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引 言
脂肪酸脱饱和酶是在脂酞链中引人一个双键
从而产生不饱和脂肪酸的酶类 ,除一些细菌如大肠
杆菌外 ,几乎存在于所有生命有机体中 〔`〕脂肪酸
脱饱和酶对维持生物膜的正常结构和功能发挥着
重要作用 ,而且与生命体应对低温 、高盐等胁迫环
境的机制相关 〔〕参与多不饱和脂肪酸形成的脱饱
和酶主要是高度膜结合的蛋白 ,很难在体外进行功
能鉴定图 目前主要是通过构建包含目标基因的转
基因酵母 ,并诱导表达后分析转基因酵母 的脂肪酸
组成来鉴定其功能 但脂肪酸在细胞里存在的形态
收稿 日期 一 一
基金项目 国家高技术发展计划 计划 , 教育部留学回国人员启动基金 一 一 国家
自然科学基金面上项 目
作者简介 李湘 一 ,女 ,湖南会同县人 ,硕士 ,从事脂肪酸合成方面的相关研究 一
通讯作者 卿人韦 一 ·
四川大学学报 自然科学版 第 卷
是非常复杂的 ,主要以与磷脂 、酞基辅酶 、酞基载
体蛋白 等结合的形态存在 〔`〕而要进一步阐
明脂肪酸脱饱和酶的具体底物 ,则需要分别分析磷
脂 、酞基辅酶 库以及 库 ,基于这些工作的
复杂性 ,很少有脂肪酸脱饱和酶底物类型特异性的
研究报道
播娘 篙 、 召
尸 属十字花科植物 ,为一年生野生杂草 ,广泛
生长在中国主要的小麦产区川 播娘篙在世界范围
内被作为一种药用植物 ,其蒸煮出来的汁液可作为
退热剂 、利尿剂 、止血剂 ,用于治疗喉痛 、麻疹 、天
花 、丹毒 、炭疽热等叫 其种子油还具有一定的抗抑
郁效果叫 近年来对播娘篙植物体丰富的化学物质
的研究引起了社会的广泛关注 ,已分离出 种香豆
素化合物 ,包括食若亭 、蓑若林 、异蓑若林 、花椒毒
酚 、花椒毒素 、补骨脂素 、佛手内酷 ,以及 种氨基
酸和约 种脂 肪 酸川 播 娘篙 种子 含油量高 达
,不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的比例高
达 ,其 中亚油酸和亚麻酸的含量分别为
和 随着人类对不饱和脂肪 酸
的需求量的不断提高 ,寻找优质的脂肪酸来源成为
巫待解决的问题 ,而不饱脂肪酸含量如此之高的播
娘篙可作为开发食用油的原料
本文克隆了播娘篙叶绿体型■ 脱饱和酶基
因 ,研究 了该脱 饱和酶的功能 ,并
进一步阐明了该酶的底物类型 ,为深入认识脱饱和
酶的作用机理奠定了基础
材料与方法
材 料
植物材料 播娘篙取 自四川省红原县 ,液
氮冷冻后于一 ℃超低温冰箱中保存
菌株与载体 异源表达载体为 ,宿
主 为
亚克隆及测序载体用 一 ,宿主为
试 剂 相关分子生物学试剂及聚合酶等
分别购 白 公司和 ` 公司 脂 肪
酸 甲醋及酞辅酶 等标 准品购 自 公司 甲
醇 、正己烷为色 谱纯 薄层硅胶 板
购 自青 岛海 浪公司 其 他药 品均为分析
纯
方 法
基 因 中间 片段 克
隆 根据 已报道 的 个已知 的高等植物 的
的氨基酸序列 拟南芥 , 甘蓝
型油菜 , 大豆 , 进行比对 ,设计
游 和 下 游 引 物 一 一
一 和 一 一
一 ,以 为模
板进行 扩增 产物亚克隆人 一
载体 ,转 化 人 。 ,经 测 序得 到
洲基因 中间片段
基 因 全 长 克 隆及
载体构建 按试剂盒
方法 完 成 中 间 片 段 的 和
设 计 出 全 长 引 物 飞 〕
二 、 , 八 , 一
下划线的碱基是限制性内切酶 “ , 识别位点
,
丁 以玉 ,以刃 ,一 下划线的碱基是限制性
内切酶 识别位点 以 为模板进行高
保真酶 扩增 ,反应 产物亚 克隆测序确认 ,用
皿和 工双酶切 ,连接进表达载体
载体上 ,得 创, 转
人酵 母 〕,所 得 阳性 克 隆挑 单 克 隆培 养 提 取
,经 进一步验证后得转基因酵母
酵母转化体的诱导培养及脂肪酸成分的
分析 转基因酵母 目的基因的诱导表达及总
脂肪酸的提取分析方法参照参考文献 门
转基 因酵母的磷脂提取及分析 用薄层层
析的方法分离转基因酵母细胞的磷脂参照参考文
献 〕即用 的酵母细胞提取总磷脂 ,总磷
脂在薄层层版上用展开剂分离 ,用钥蓝试 剂 显色 ,
用磷脂标准品即大豆磷脂 、 和 进行定性 鉴
定和定量分析 `〕 将分离纯化所得到各磷脂组 分
分别溶于氯仿 甲醇 中 ,反应 ,用
于 分析
酵母转化体 的脂酞 分析 转基因酵
母脂酞 的分析方法参照参考文献 〕,酵母
细胞脂酞 提取见参考文献 「 ,各种脂酞
的定性检测和定量分析使用乙酞辅酶 标准
品 一 、 一 和 一 取适 量酵
母细胞加人 一 做为内标 ,提取总脂酞基辅
酶 脂酞 与 的正丁胺在 ℃下发生反
应得到正丁胺 衍生物 ,将 此衍生 物用 分
析
第 期 李湘 , 等 播娘篙叶绿体型■ 脱饱和酶的功能鉴定及其底物类型特异性研究
结 果
基因全长 的分离
通过 一 和 得到了
基因全长 序列 ,该基因完整开放阅读框为
, 登 录 号 为 通 过
软件分析 ,该核昔酸序列推演出的氨基
酸序列与拟南芥 登录号 、甘蓝型油菜 登
录号 和大豆 登录号 的叶绿体型
■ 脂 肪 酸 脱 饱 和 酶 基 因 的 同 源 性 分 别 为
写 , 和 。 用信号肤分析软件预测
酶含有一个由 个氨基酸残基组
成的导向叶绿体的信号肤
在酵母中的表达
分别构建了含全长 基因的转基
因酵母 和不含叶绿体信号肤的转基
因酵母 转基因酵母脂肪 酸组 成
结果见图 在转化体酵母细胞中 ,脂肪酸成分发
生了变化 ,产生了一个新的色谱峰 通过与标准样
脂肪酸甲酷的保留时间比对 ,发现其与亚油酸
, ■ , 一致 ,且质谱图 图 中都出现了荷质
比为 的离子特征峰 因此可知 ,
具有将 , ■ 脂酞链 的 ■ 位置上脱饱和形
成新的烯键而转化为 , ■ , 亚油酸 的功
能 另外 ,如表 和表 ,通过
可计算得出 的转化效率为
, 的转化效率为 ,
说明这两个基 因的表达活性相对较低 而且 ,切除
信号肤后得到的 在酵母中的表达
活性有了较明显的提高
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图 气相色语分析转基因酵母和对照组酵母的主要脂肪酸成分
,
表 转基因酵母 的主要脂肪酸成分及相对百分含量
、
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表 转基 因酵母 的主要脂肪酸成分及相对百分含最
记
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1 3 7 8 四川大学学报 自然科学版 第 卷
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图 转基 因酵母 、 中亚油酸 甲酣 , 助的质语 分析 图
, 。 、 砂
表 转基因 的磷脂各组分中脂肪酸成分及相对百分含最
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作用的底物类型特异性分析
磷脂分析 转基因酵母总磷脂成分分离纯
化结果如图 ,对各磷脂组分进行 分析 ,其
结果如表 , 转基 因酵母 的表达
产物 , ■ , 在 , , , , 中都有
分 布且 相 对 百 分 含 量 分 别 为 , ,
, , 比较数据可发 现 ,表达产
物在磷脂组分 中基本都有分布 ,但在各组分中的分
布量有差异 ,这说明这类脂肪酸脱饱和酶作用于与
磷脂结合的脂肪酸 ,但 对某种磷脂
组分是否具有明显的偏爱性 ,还需进一步探究 ,因
为不同组织中各磷脂组分的相对百分含量并不相
同
脂酞辅酶 库分析 转基轩酵母细胞指
酞辅酶 分析结果如图 ,与标准品以及转人空载
体的酵母对照组的 图对比可知 ,转人表达载体
的酵母细胞的脂肪酸组分并没有发生变化 ,表达产
物亚油酸并没有 出现在脂酞辅酶 库 中 ,说明播
娘篙叶绿体型 ■ 脂肪酸脱饱和酶的底物并不是
、
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图 薄层层析分离转基因酵母的磷脂组分
、 分 别 表 示 转 基 因 酵 母 和 、
的磷脂组分
几
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第 期 李湘 , 等 播娘篙叶绿体型■ 脱饱和酶的功能鉴定及其底物类型特异性研究
以辅酶 为载体
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图 气相色谱分析转基因酵母 , 和 的
脂酞 库中脂肪酸成分
、 ,
讨 论
酵母细胞 二 、 。是研究真核生物代谢
过程的一个重要表达系统 ,其特点有易培养 生长
速度快 脂肪酸组成不复杂 ,主要包括 ,
, ` , , ,不含任何多不饱和脂肪酸 且
、 。细胞可从培养基中吸纳许多结构各异的
脂肪酸并将其整合到细胞 中 口酵母组成型强启
动子有 、 、 ,诱 导 型 强启 动 子 有
、 等 〕,在葡萄糖的存在下 ,各
相关基因的表达会受到严重阻遏 ,我们用棉子糖代
替葡糖作为碳源 ,用半乳糖来诱导 的起始
转录 ,促进基 因的表达 本 文中 , 在
酵母中成功的表达 ,且切除叶绿体信号肤后 ,脱饱
和酶的表达效率 比原生型提高了 ,原 因可
能为切除信号肤后 ,提高了蛋白的表达量 ,从而提
高 了表达效率
目前 ,对脂肪酸脱饱和酶的研究主要集中在分
子克隆 、功能鉴定 、结构分析 、系统发育 、生态因子
如温度 、盐度 以及病菌的胁迫等对脱饱和酶的表达
效率的影响等领域 ,但对于脱饱和酶的一个重要生
物学问题 ,即其底物类型却缺乏详细的研究报道
只有少量研究认为高等植物的 ■ 脱饱和酶的底
物最大可能性为磷脂 ,并且对磷酸类型的选择无特
异性 而 藻类 、真菌 、低 等植物 、蠕虫 等 的 ■ 一和
■ 一脱饱 和酶 的脱 饱 和产 物则 主要 积 累在
上 〔 〕,这说 明这些磷脂脱饱和酶对磷脂类型具有
特异性 本文全面分析 了 的底物类
型包括磷脂及脂酞辅酶 中脱饱和产物的积累情
况 , 明确了 催化与磷脂结合的脂肪
酸进一步脱饱和 ,并且确定脱饱和产物在各类磷脂
中的分布是不均匀的 ,但对该酶是否对某一种磷脂
组分具有绝对偏爱性仍需进一步探究
脂肪酸脱饱和酶的功能底物类型特异性的研
究解决了一个生物酶促反应底物配体的基本生物
学 问题 ,有助于更深人理解脱饱和酶的作用机理及
细胞脂肪酸的代谢转换过程 进而可以利用该酶识
别特定底物来定向改变目标脂肪酸成分 ,高效生产
出人类巫需的脂肪酸资源
参考文献
〔 〕
〔
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。 。 、 〕 。
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钱利武 , 张小平 ,蒋继宏 播娘篙研究进展 〔 〕 中
国野生植物资源 , ,
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1 3 8 0 四川大学学报 自然科学版 第连 卷
, ,
「 陶桓晨 , 罗霞 , 杨志荣 , 等 南草劳子油抗抑郁作用
的初步研究 〔 〕 四川大学学报 自然科学版 , ,
〔 , , , , , 己
〔 〕 , ,
〕 李亮 , 王文国 , 庄国文 , 等 麻疯树 基因的克
隆及原核 表达 四川大学学 报 自然科学版 ,
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刘巍峰 , 高东 , 鲍晓明 , 等 酿酒酵母可诱导启动
子功能特性的研究 〕 山东大学生命科学学报 ,
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