全 文 ：中国农学通报 2012,28(10):168-172
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
大丽花(Dahlia pinnata)为菊科大丽花属多年生球
根植物，花大色艳，花型丰富，品种繁多，常作花境、花
坛或盆栽观赏，是重要的园林绿化材料。目前，通过传
统的常规育种方法已得到大丽花品种3万多个[1]，但还
远远不能满足人们对新品种的需求。建立大丽花高效
基金项目：河北省林业局资助项目“大丽花优质种苗繁育技术研究”(1118411)。
第一作者简介：曹明颜，女，1985年出生，河北平山人，在读硕士，主要从事观赏植物遗传育种方面的研究。通信地址：071000河北省保定市河北农业
大学西校区园艺学院，E-mail：1035502359@qq.com。
通讯作者：陈段芬，女，1968年出生，河北宁晋人，教授，硕士生导师，博士，主要从事观赏植物教学与研究。通信地址：071000河北省保定市河北农业
大学西校区园艺学院，E-mail：chenduanfen@sohu.com。
收稿日期：2011-12-07，修回日期：2012-02-27。
大丽花叶片离体再生体系的建立
曹明颜，陈段芬
（河北农业大学园艺学院，河北保定 071000）
摘 要：为了建立大丽花高效遗传转化体系及解决今后通过植物基因工程选育新种质的问题，以大丽花
为试材，研究光照条件、叶片生理状态、激素浓度等因素对叶片再生的影响，建立以大丽花离体叶片为外
植体的高频再生体系。研究结果表明：以顶部充分展开的 25天叶龄的无菌苗叶片为外植体，在含KT
7 mg/L+NAA 0.05 mg/L的MS分化培养基上，暗培养15天后转到光下培养，20天后开始有不定芽直接
从叶片上分化产生，出现的高峰期在接种后30~35天，芽分化率最高可达86%，平均叶片再生芽位点数
为5.0。待不定芽长至2 cm以上时，将其剪下转到生根培养基1/2MS+ NAA 0.1 mg/L上培养后得到生根
的完整植株。
关键词：大丽花；叶片；再生体系
中图分类号：S682.261 文献标志码：A 论文编号：2011-3629
Establishment of Leaf in vitro Regeneration System in Dahlia pinnata
Cao Mingyan, Chen Duanfen
(Horticultural Department, Agricultural University of Hebei, Baoding Hebei 071000)
Abstract: In order to establish Dahlia pinnata efficient genetic transformation system and to solve the problem
of breeding of new varieties in the future through genetic engineering. In this paper, the D. pinnata leaf
regeneration system was discussed. The leaves of D. pinnata were used as the experimental material. Several
factors such as illumination condition, explant condition, hormone concentration and so on were investigated to
optimize the regeneration system in vitro. The experimental results showed that leaf situation could greatly
affect D. pinnata regeneration frequently. The best explants were those 25 days apical leaves from the cultured
plantlets. The high frequency of shoot regeneration was observed when explants were cultured on MS medium
supplemented with 7 mg/L KT and 0.05 mg/L NAA. The leaves were cultured in dark for 15 days firstly, and
then they were transferred under light and began to directly regenerate adventitious buds in about 20 days. The
maximum number of the adventitious buds was observed within 30-35 days. Maximum shoot differentiation
frequency was 86%. Shoot site number per explant was 5.0. When the shoots grew to more than 2 cm high, they
were cut from and transferred to the root differentiation medium 1/2MS+0.1 mg/L NAA and developed into the
whole plants.
Key words: Dahlia pinnata; leaf; regeneration system
曹明颜等：大丽花叶片离体再生体系的建立
再生体系，利用转基因技术定向导入目的基因培育出
观赏性状优良、抗逆性强的品种对大丽花的种质创新，
尤其是抗病毒病品种的选育具有重要意义。其中，离
体叶盘侵染法由于操作简单、转化效率高成为转基因
的首选途径[2]，所以，利用组织培养方法建立和优化叶
盘高效再生体系是开展转基因的基础工作之一。
国内外关于大丽花组织培养方面的研究多集中
于脱毒和快繁领域。张立磊等[3-4]以茎尖和花蕾为外植
体，以MS为基本培养基，附加6-BA 1.5~2 mg/L+NAA
0.01~1 mg/L的固体培养基上，先脱分化诱导愈伤组
织，再将愈伤组织诱导不定芽，得到了脱毒种苗。韦三
立等[5]以块根上所生的嫩芽为外植体，以MS为基本培
养基，附加 6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 1 mg/L
的固体培养基上可诱导产生不定芽。Fatima等[6]以大
丽花子叶和下胚轴为外植体，以MS+6-BA 3 mg/L+
NAA 3 mg/L为培养基，愈伤诱导率为 60%，再生率只
有 13%。Priyanka等[7-9]以茎尖和腋芽为外植体，研究
认为最佳的增殖培养基为MS+6-BA 1~2 mg/L+NAA
0.1~0.2 mg/L，最佳的生根培养基为 1/2 MS + NAA
0.1 mg/L或1/2 MS+IBA 0.1 mg/L。
由上可见，前人的研究主要集中于利用组织培养
方法生产和快繁脱毒苗等环节。当前，国内外关于大
丽花的研究报道较少，且集中于其病毒病原的鉴定和
分离[10]，至今未见有大丽花离体叶片高效再生体系研
究的报道。笔者拟以大丽花无菌苗离体叶片为外植
体，通过激素浓度、叶片生理状态及光照条件等因素的
调控实现离体叶片的直接高效再生，为建立大丽花高
效遗传转化体系奠定基础，也为今后通过植物基因工
程选育优良品种提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料大丽花取自河北农业大学西校区标本
园，品种为‘珠宝’。
1.2 试验方法
1.2.1 无菌苗的获得和增殖培养 生长季剪取大丽花茎
尖和带芽茎段，先用流水冲洗 1 h，再用 75%的酒精消
毒 30 s，然后用 0.1%升汞或 2%的次氯酸钠（滴加 1~2
滴吐温 80），消毒 4~6 min，用无菌水冲洗 5次。将顶
芽或腋芽接种于初始培养基 (MS+6-BA 0.5 mg/L +
NAA 0.3 mg/L)上获得无菌苗。取生理条件相近的组
培苗置于附加不同配比激素和蔗糖浓度的培养基上培
养，观察记录各种因子对大丽花增殖、壮苗及生根的影
响，初步筛选出合适的增殖培养基，获得健壮一致的组
培苗，于 100 mL的三角瓶中光照培养，供叶片再生研
究之用。
1.2.2 离体叶片再生培养 取不同叶龄的叶片，切成
0.5 cm×0.5 cm的外植体小块，远轴面向下接种在添加
了不同种类和浓度激素的培养基上。暗处理15天后，
分别转入光下培养或继续于暗处培养。外植体每 20
天继代1次。光照培养处理的光强为1000~2000 lx，光
周期为14 h光照、10 h黑暗。培养室温度为(25±2)℃。
1.3 数据统计
大丽花顶芽或腋芽经继代培养约30天后，调查芽
体增殖系数（式(1)）和株高、叶色等；叶盘外植体在再
生培养基上培养45天后，调查不同处理叶片不定芽分
化率（式(2)）和叶片平均再生芽位点数（式(3)），每处理
调查30个外植体，重复3次。
芽体增殖系数=出芽总数/接种总芽体数 …… (1)
叶片不定芽分化率=(出芽叶片数/接种总叶片
数)×100%…………………………………………… (2)
叶片平均再生芽位点数=叶片再生芽位点数/再生
芽叶片总数 ………………………………………… (3)
2 结果与分析
2.1 无菌苗的增殖培养
接 种 于 初 始 培 养 基 (MS + 0.5 mg/L 6-BA +
0.3 mg/L NAA)上的大丽花外植体经初代培养后，只
有单芽生长而无增殖现象，且组培苗节间较长，出
现徒长现象（图 1A）。通过不同水平KT和NAA组
合及蔗糖浓度处理后，大丽花组培苗的增值系数及
长势明显得以改变。由表 1和图 1B~D可见，当培
养基中蔗糖浓度为 30 g/L时，随着KT浓度的增加，
组培苗顶芽生长受到抑制，而腋芽和不定芽的发生
得以促进。当KT浓度增加到 8 g/L时，茎尖增殖系
数达到 8.8个/外植体，但丛生不定芽出现明显的玻
璃化。当调整蔗糖浓度为 50 g/L时，不同激素组合
处理的组培苗不仅增殖率提高，而且叶片颜色变
深，植株生长健壮，即较高的KT和蔗糖浓度组合处
理可以控制组培苗高度，起到壮苗作用。其中，最
适组合为 MS+KT 6.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+蔗糖
50 g/L+琼脂 6.5 g/L。
2.2 利用叶片外植体直接诱导不定芽的产生
2.2.1 光照对不定芽分化的影响 试验对光照与大丽花
不定芽分化的关系进行了初步研究，将生理状况相似
的叶片外植体置于同一种分化培养基上，分别进行不
同时间长度的暗培养，统计不同处理下不定芽分化的
情况。由表 2可见，光照条件对大丽花叶片分化具有
重要影响。光处理下叶片外植体的颜色变深，分化出
少量而健壮的芽；暗处理能显著提高叶片外植体的分
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化率。暗处理以 15天为宜，暗处理时间过长时，虽然
愈伤分化率提高，但叶片平均再生不定芽数量降低。
2.2.2 叶片生理状态对不定芽分化的影响 研究发现无
菌苗的叶龄对叶片外植体不定芽分化率有重要影响。
由表3可见，在相同培养条件下，叶龄为25天左右的大
丽花试管苗离体叶片适于再生，该叶龄的叶片外植体
不定芽分化率高达 82.1%。此外，由图 2可见，在相同
的培养条件下，顶部2 cm以下的嫩叶容易被诱导出大
量的愈伤组织，且愈伤组织有少量不定芽分化现象；下
部位置的成熟叶子被诱导出少量的愈伤组织并有膨
大、增厚现象，没有不定芽的分化现象。由此可见，叶
片生长位置及成熟度对不定芽的诱导也有影响，以顶
部充分展开的长度为2~3 cm的嫩叶最为合适。
2.2.3 不同激素配比对不定芽分化的影响 选取顶部充
分伸展的叶龄为25天左右的大丽花试管苗叶片，切成
0.5 cm×0.5 cm的外植体小块，远轴面向下置于分化培
养基上暗培养15天，分别转入光下培养。15天后叶片
体积开始增大。大约20天左右露出芽点，不定芽出现
的高峰期在接种后的30~35天。多数不定芽的形成并
不经历愈伤组织阶段，直接从培养的叶片外植体伤口
处分化产生，不定芽沿着伤口生长，其他部位几乎没有
再生芽点。
不同激素浓度对大丽花叶片外植体不定芽分化的
表1 不同浓度激素和蔗糖组合对大丽花增殖及壮苗的影响
培养基编号
M1
M2
M3
M4
M5
M6
KT/(mg/L)
0
0.5
2
4
6
8
NAA/(mg/L)
0
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
30 g/L蔗糖
茎尖增殖系数
1.0
1.2
1.4
3.4
5.2
8.6
生长情况
单芽生长
单芽生长
腋芽萌发
不定芽生长
不定芽生长
丛生芽玻璃化
叶色
绿
绿
绿
绿
绿
淡绿
50 g/L蔗糖
茎尖增殖系数
1.0
1.3
1.4
3.5
5.3
8.8
生长情况
单芽、粗壮
单芽、粗壮
腋芽、粗壮
不定芽、粗壮
不定芽较粗壮
丛生芽玻璃化
叶色
深绿
深绿
深绿
深绿
深绿
淡绿
A.徒长苗；B. M3培养基下诱导的腋芽；C. M4培养基下诱导的不定芽；D. M5培养基下诱导的不定芽
图1 不同培养基对腋芽和不定芽的影响
表2 光照对大丽花叶片外植体不定芽分化的影响
光照条件
光下
暗处理8天后转光下
暗处理15天后转光下
暗处理20天后转光下
暗处理25天后转光下
外植体数/个
30
32
30
29
31
分化外植体数/个
9
14
25
27
29
分化率/%
30.0
43.8
83.3
93.1
93.5
再生芽位点数/个
9
15
90
20
21
平均再生芽位点数/个
1.0
2.5
5.0
3.7
2.1
叶龄/d
15
25
35
40
接种外植体数/个
40
39
36
34
出芽外植体数/个
8
32
20
10
分化率/%
20.0
82.1
55.6
29.4
表3 叶龄对大丽花叶片外植体芽分化的影响


A D C B
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曹明颜等：大丽花叶片离体再生体系的建立
影响见表 4。由表 4可知，当 KT浓度为 0.05 mg/L，
NAA浓度为0.01 mg/L时，外植体只分化出不定根，说
明KT/NAA比值较小。适当增加KT/NAA比值（S2培
养基），叶片外植体分化的不定芽少而壮（见图3A）；当
KT/NAA比值继续提高时（S5培养基），叶片分化的不
定芽数量增加（见图3B）；最适的叶片外植体不定芽分
化培养基为KT 7 mg/L+NAA 0.05 mg/L的S6培养基，
该处理不仅分化率高，而且分化出的不定芽数量也较
高（见图 3C）。当继续增加KT用量时，分化出的不定
芽虽然数量增加，但不定芽的玻璃化现象明显，较难形
成健壮植株。
2.3 大丽花再生苗的生根诱导
当不定芽长到2 cm以上时，将其从叶片外植体上
切下，接种于添加了不同激素的MS生根培养基中进
A B
A.顶部2 cm以下嫩叶的诱导情况；B.下部成熟叶子的诱导情况
图2 叶片生长位置及成熟度对不定芽诱导的影响
培养基编号
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
KT/(mg/L)
0.05
1
1
2
4
7
10
NAA/(mg/L)
0.01
0.05
0.1
0.3
0.05
0.05
0.05
分化情况
生根
伤口处直接分化出少量较壮的不定芽
伤口及接触培养基部分长愈伤但不分化出不定芽
伤口处长大量愈伤但不分化
伤口处直接分化出较少的不定芽
伤口处直接分化出较多的不定芽
伤口处分化出大量不定芽玻璃化
分化率/%
0
5
0
0
55
86
87
表4 不同激素浓度对大丽花叶片外植体不定芽分化的影响
A. S2培养基下诱导的不定芽；B. S5培养基下诱导的不定芽；C. S6培养基下诱导的不定芽
图3 不同培养基处理下从叶片外植体诱导出的不定芽


A B C
行生根诱导。由表 5可知，大丽花叶片再生苗较易生
根，在不加任何激素的MS培养基上可部分生根，但根
系较弱。生根培养基 1/2MS+NAA 0.1 mg/L对大丽花
不定芽生根的诱导效果最好，不仅生根较早，而且根系
发育健壮（见图4）。
此外，笔者研究表明，培养基的 pH对大丽花再生
苗的生根有显著影响，pH 5.5~5.8时，大丽花再生苗生
根快且生根量大。当pH超过6.5时，培养基硬度较大，
大丽花再生苗生根缓慢且生根量减少。
3 结论
（1）大丽花继代增殖的适宜配方为 MS + KT
6.0 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+蔗糖50 g/L+琼脂6.5 g/L。
（2）充分伸展的叶龄为25天左右的大丽花试管苗
叶片外植体接种于添加KT 7 mg/L和NAA 0.05 mg/L
的MS培养基上，暗处理15天，能显著提高叶片外植体
不定芽的分化率。
（3）1/2MS培养基+ NAA 0.1 mg/L能诱导大丽花
不定芽较早生根，而且根系发育健壮。
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表5 不同培养基对大丽花组培苗生根的影响
培养基编号
Y1
Y2
Y3
Y4
Y5
培养基及激素/(mg/L)
MS+NAA 0.0
MS+NAA 0.1
MS+NAA 0.1+6-BA 0.05
1/2MS+NAA 0.1
1/2MS+NAA 0.1+6-BA 0.05
生根情况
1个月后部分生出少量的根
20天后部分生出少量的根
生根缓慢
15天后大部分生根
生根缓慢
A B C
A. Y2培养基下诱导的根；B. Y4培养基下诱导的根；C. Y5培养基下诱导的根
图4 不定芽诱导生根
4 讨论
4.1 大丽花叶盘再生效率与其他组织和器官再生效率
的比较
一直以来，大丽花组织培养的目的是得到一定数
量的脱毒种苗，以解决生产中由于多种病毒病导致的
种苗退化问题。基于转基因目的的高效再生体系研究
极少。虽然Fatima等[6]以大丽花子叶和下胚轴为外植
体进行过愈伤组织诱导研究，但诱导率仅为60%，不定
芽再生率只有 13%，用于遗传转化有很大的局限性。
笔者利用叶盘直接再生不定芽，省略了愈伤组织诱导
培养阶段，且分化率达86%，对建立稳定的遗传转化体
系具有重要意义。
4.2 KT和6-BA对大丽花不定芽分化的影响
以往大丽花组织培养过程中，6-BA被用作细胞分
裂素类物质，诱导愈伤和不定芽的效果很不理想 [8]。
笔者采用KT代替 6-BA，离体叶片获得了高效再生。
这可能是因为大丽花的遗传背景对KT与 6-BA的反
应机理不同而引起[11]，该问题有待进一步探讨。
研究发现，在不定芽诱导和分化过程中，不仅细胞
分裂素与生长素的比值影响着不定芽的分化，而且 2
种激素的绝对含量对不定芽的分化也起着重要作用，
其他研究者在不同材料的研究中也有相似的结论[12-13]。
4.3 大丽花叶片生理状态对分化效果的影响
大丽花的叶片再生对外植体状态要求很高，只
有生理状态适宜的叶片才能得到理想的分化效果。
生理年龄太小的叶片营养积累不够而再生困难，太
大则不容易发生脱分化。这一结论与王磊 [14]、陶兴
林 [15]等在悬铃木和厚皮甜瓜叶片再生研究中的结果
一致。
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