全 文 ：收稿日期:2005-05-18
基金项目:国家植物转基因专项资助项目(J2002-B-006)和 “ 863” 资助项目(2002AA212071)
作者简介:高峰(1979-),男 ,博士研究生 ,研究方向:植物细胞工程与基因工程.
＊通讯作者
　文章编号:1671-9352(2005)05-0113-06
小盐芥(Thellungiella salsuginea)CBF1基因的克隆
高　峰 ,高　强 ,岳桂东 ,杨爱芳 ,张举仁＊
(山东大学　生命科学学院 , 山东　济南　250100)
摘要:CBFs(CRT/DRE-binding factor)是结合 DNA 顺式元件CCGAC 的转录因子.拟南芥中 CBFs 由一个小的基因家
族编码 , 包括 3个成员:CBF1 、CBF2 和 CBF3 , 它们在植物抗逆性调控中起重要作用.为了获得高度耐盐耐旱的转
基因植物 , 我们以盐生植物小盐芥为材料 ,依据拟南芥中 CBF1 的序列信息设计引物 ,扩增出小盐芥中 CBF1 的部
分序列 , 然后使用SMARTTMRACE 等方法 ,从小盐芥中克隆到全长的 CBF1 cDNA序列 , 进而重组到植物表达载体
中 , 为植物抗逆基因工程提供了有用基因.
关键词:小盐芥;CBF 基因;克隆;快速扩增 cDNA末端
中图分类号:Q781　　　文献标识码:A
Cloning of CBF1 gene from Thellungiella salsuginea
GAO Feng , GAO Qiang , YUE Gui-dong , YANG Ai-fang &ZHANG Ju-ren＊
(School of Life Science , Shandong Univ., Jinan 250100 , Shandong , China)
Abstract:CBFs are a small transcriptional activators family , which can combine with the DNA-cis element CCGAC and induce
the expression of some cold-regulated genes.CBFs gene family in Arabidopsis includes three members , i.e.CBF1 , CBF 2 and
CBF3 , which play a key role in plant gene expression regulation under drought , high-salt and cold stress.A gene fragment was
amplified from Thellungiella salsuginea by a pair of primers designed from Arabidopsis CBF1 gene.With this gene fragment , the
full-length CBF1 gene was cloned from Thellungiella salsuginea by SMARTTM RACE.To obtain transgenic plants with high toler-
ance to salt and drought , the CBF1 gene was cloned into plant expression vector under the control of the ubiquitin promotor.The
present study provides a good candidate gene to improve crop and horticulture plants for their stress tolerance.
Key words:Thellungiella salsuginea;CBF gene;cloning;RACE
0　引言
植物处于不良环境(如低温 、高温 、干旱 、盐渍
等)条件下 ,体内发生一系列的生理代谢反应 ,表现
为代谢和生长的可逆性抑制 ,严重时甚至引起不可
逆伤害 ,导致整个植株死亡[ 1 ,2] .各种胁迫中 ,干旱 、
盐碱 、冷(冻)害对植物的影响尤为突出 ,是影响植物
生长和农作物产量最主要的环境因子.分子生物学
的发展 , 使人们能够在基因组成 、表达调控及信号
传导等分子水平上认识植物对逆境胁迫的耐(抗)性
机理.经过大量研究 ,人们已经克隆到来自微生物等
有机体的编码生化代谢关键酶和逆境胁迫信号传导
的一些重要基因[ 3～ 6] .通过基因工程手段和转基因
技术向栽培植物导入外源目的基因已成为改良植物
耐(抗)胁迫性的新途径.
　第 40 卷　第 5期
　Vol.40　 No.5 　 　 　 　 　
山　东　大　学　学　报　(理　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
　 　 　 　 　 2005年 10 月　
Oct.2005　
　　DREB(dehydration responsive element binding pro-
tein)基因是 AP 2/ EREBP 基因家族中的一个亚家
族 ,它在胁迫应答基因表达中起着重要作用.刘强
等[ 6]从拟南芥中分离到 5个 DREB 基因 ,它们可以
分 为 两 类:CBF1 、 CBF2 、 CBF3 (即 DREB1B 、
DREB1C 、DREB1A)和 DREB2A 、DREB2B.近几年
来 ,一些学者从油菜 、水稻 、大麦等植物[ 7] 中分离
DREB 基因的同源基因 ,它们能与 CRT/DRE顺式调
控元件特异结合 ,激活启动子中具有这一调控元件
的冷诱导和脱水诱导基因的表达 ,从而引起植物体
内的多种生理生化变化[ 8～ 10] .转基因实验证明 ,
CBF 基因在拟南芥和油菜中过表达 , 显著增强了转
基因植株对低温 、干旱和高盐胁迫的耐性[ 6 ,11] .
CBF1基因在番茄中过表达可以提高番茄对多种逆
境(缺水 ,冷激 ,过氧化)的耐性[ 12 , 13] .这为基因工程
综合改良大田作物和园艺植物的抗逆性提供了一种
全新而有效的技术途径.
小盐芥是典型的盐 生植物[ 14 ,15] , 能耐受
0.5 mol/L的 NaCl ,其耐盐机制的研究近年来受到关
注.本工作以小盐芥为材料 ,利用拟南芥的序列信
息 ,使用 RACE等方法获得小盐芥 CBF1 基因的全
序列 ,将其命名为 TsCBF1 ,并将它插入到植物表达
载体中 ,为将该基因应用于农作物和园艺植物的遗
传改良打下了坚实基础.
1　材料和方法
1.1　实验材料
小盐芥(Thellungiella salsuginea)种子采自山东
省东营市农校 ,由邵秋玲老师惠赠.
大肠杆菌 DH5α由实验室自己保存 ,T/A 克隆
载体 pGEM-T easy Kit 购 自 PROMEGA 公 司 ,
SMARTTM cDNA Library Construction Kit 、 SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit 和反转录酶购自 Clon-
tech公司 , Oligotex★R mRNA Kit 购自 QIAGEN 公司 ,
PyrobestTM DNA polymerase、DNAMarker和胶回收试剂
盒购自 Takara公司 ,引物合成和测序由上海博亚公
司完成.
植物表达载体 pCAMBIA1300-als 由本实验室构
建 ,该质粒带有除草剂氯磺隆抗性基因 als 和玉米
ubiquitin启动子(Pubi).
1.2　小盐芥总 RNA的提取和mRNA分离
将生长 3周的小盐芥用 0.2mol/L NaCl 灌溉24 h
后取样 ,以酸酚-异硫氰酸胍法分别提取根和叶的总
RNA.按照Oligotex★R mRNA Kit操作手册分离mRNA.
1.3　小盐芥 CBF1基因片段的克隆
取 3 μL polyA+ mRNA(0.2μg)加入 CDSIII/3′
PCR引物和 SMART IV 引物(来自 SMARTTM cDNA
Library Construction Kit), 反转录体系其它各组分按
反转录酶的使用说明添加 ,反转录条件为 72 ℃水浴
2min ,冰上骤冷 2 min , 42 ℃反应 1.5 h ,合成 ds cD-
NA.根据拟南芥 CBF1基因序列设计引物 P1和 P2 ,
以反转录的 ds cDNA为模板进行 PCR扩增.PCR条
件为 95 ℃预变性 4min ,94 ℃变性 60 s ,55 ℃退火60
s ,72 ℃延伸 60 s ,35个循环.PCR产物电泳分离后回
收 ,连入 T/A克隆载体进行测序.
1.4　小盐芥 CBF1基因全序列的克隆
根据已测序的小盐芥 CBF 1基因部分序列 ,按
照SMARTTM RACE试剂盒的要求设计引物(见表 1).
3′和 5′RACE 按照 SMARTTM试剂盒说明进行.将
RACE得到的 PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶中电
泳分离 ,回收目的片段进行克隆测序.用GeneTool软
件进行序列组装 ,并在ORF两端设计引物(ORF P1 ,
ORF P2),以反转录的 ds cDNA为模板进行 RT-PCR ,
获得小盐芥 CBF 1基因的全长 cDNA 序列.所用引
物序列见表 1.
表 1　克隆 CBF1 基因所用的引物序列
Tab.1　Primer sequence for cloning CBF1 gene
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
CBF1 部分片段 P1 5′ CGGCGGGTCGTAAGAAGTTTCGT 3′
扩增引物 P2 5′ CCTCCACCAACGTCTCCTCCAT 3′
3′RACE引物 3′RACE GSP(gene specific primer) 5′ AGCGGCTGCTGAAGCGGCGGTTG 3′
3′RACE嵌套引物 3′RACE NGSP(nest gene specific primer) 5′ GACTCGGCTTGGCGGCTTAGAATCC 3′
5′RACE引物 5′RACE GSP(gene specific primer) 5′ GGGATTCTAAGCCGCCAAGCCGATTC 3′
5′RACE嵌套引物 5′RACE NGSP(nest gene specific primer) 5′ GCTGCCATCTCGGCTGTTGGAAAAGT 3′
ORF 扩增引物 ORF(open reading frame)P1 5′ ATAAACACCAACCCTCACTCCCA 3′
ORF(open reading frame)P2 5′ TCGTCTCTCAGTGACCACCAAAAA 3′
　114　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 40卷　
1.5　含有 TsCBF1基因的植物表达载体的构建
用限制内切酶 EcoRI 从带有 TsCBF1 基因的
pGEM-T easy 载体上切下 TsCBF1 基因片段 , 加
EcoRI-KpnI接头 ,在经过 KpnI酶切后 ,回收两侧带
有KpnI酶切位点的 TsCBF 1基因片段.将本实验室
构建的带有除草剂氯磺隆抗性基因 als和玉米ubiq-
uitin启动子(Pubi)的植物表达载体用限制内切酶
KpnI酶切后 ,对载体片段的 5′末端进行去磷酸化 ,
然后将两侧带有 KpnI 酶切位点的 TsCBF 1基因片
段与脱磷的载体进行连接.将连接产物转化大肠杆
菌DH5α,筛选正确的转化子.
2　结果与分析
2.1　RNA的提取和mRNA的分离
以盐胁迫处理过的小盐芥植株根 、叶为材料提
取总 RNA.总 RNA经琼脂糖电泳分离 , 23S 核糖体
RNA与 18S 核糖体 RNA的带型清晰锐利 ,它们的亮
度比基本上呈 2∶1关系 ,看不见基因组 DNA 的污染
(图 1A).为进一步确定 RNA质量 ,使用紫外分光光
度计在波长 230 nm ,260 nm和 280 nm 处测吸光度 ,
得出 A260/ A230 = 2.078 , 大于 2.000;A260/A280 =
1.950.说明此 RNA 完整性较好 ,纯度高 ,不存在蛋
白质 、多糖和酚类物质的明显污染.
2.2　TsCBF1基因片段获得和全长基因的克隆
对 mRNA反转录产物进行电泳 ,确认反转录质
量(图 1B).以 ds cDNA为模板 ,通过 PCR获得 cDNA
扩增片段(图 1C).将扩增产物重组到 T/A克隆载体
后进行测序 ,根据序列信息设计 RACE引物 ,分别获
得 TsCBF1基因的5′和3′序列(图 2A 、B 、C).通过序
列组装 ,获得该基因的全长序列信息.依据该信息 ,
在 TsCBF1基因的ORF 两端设计一对引物(ORF P1 ,
ORF P2)进行 RT-PCR ,获得小盐芥 TsCBF1基因的
全长序列(图 3).
图 1　RNA 质量 、mRNA反转录和 ds cDNA扩增产物
A.总 RNA 在 1.2%变性甲醛胶上的电泳结果;B.小盐芥根和叶的 mRNA 反转录后在 1.0%琼脂糖凝胶电泳的结果 ,M 为
DNA 分子量Marker DL2000 , RT1 和 RT2分别表示来自根和叶的反转录产物;C.用引物 P1 和 P2 对 ds cDNA 进行扩增 , 得到
TsCBF 1基因的片段.
Fig.1　RNA quality , mRNA reverse transcript and amplified products from ds cDNA
A , Electrophoresis of total RNA through 1.2% agarose gel containing formaldehyde;B , Electrophoresis of reverse transcript products on 1.
0% agarose gel , M represents molecular weight marker DL2000 , RT1 and RT2 represent reverse transcript products from leaf mRNA and
root mRNA respectively;C , Amplification of partial TsCBF1 gene fragment from ds cDNA by primer P1 and primer P2.
2.3　TsCBF1基因的测序结果和生物信息学分析
本实验中 ,测序反应由上海博亚公司完成 ,基因
注册号为AY514018.通过NCBI中在线ORF finder分
析 ,推测所测序的 1 040个核苷酸中 ,1 到 201为该
基因的5′非翻译区 , 202到 852为蛋白质编码区 ,共
编码 216个氨基酸 ,853到 1 040为 3′非翻译区和部
分 poly A+尾巴.该基因推测的的氨基酸序列通过
Blast比对分析 ,它与拟南芥中的 CBF 1 、CBF2 、CBF3
在氨基酸水平上分别有 84%, 81%和 82%的相似
性.从第 49位到 109位的 60个氨基酸构成一个 AP
结构域(见图 4).
　第 5期 高　峰 ,等:小盐芥(Thellungiella salsuginea)CBF 1基因的克隆 115　 　
图 2　TsCBF1基因部分序列的 RACE扩增
A.1 , 10分别为 5′和 3′RACE 第一次反应中未加 ds cDNA模板的阴性对照 , 2 , 3 , 4 为 5′第一次反应产物;5 , 6 , 7 , 8 , 9 是 3′RACE
第一次反应的产物.B.用 3′RACE 嵌套引物 3′NGSP对 3′RACE 反应产物进行再次扩增 ,得到特异性良好的条带.C.用 5′
RACE嵌套引物 5′NGSP对 5′RACE反应产物进行再次扩增 , 得到特异性良好的条带.M为 DNA分子量 Marker DL2000.
Fig.2　Amplification of the partial TsCBF 1 gene sequence by RACE
A , Lanes 1 , 10 are negative control respectively in 5′and 3′RACE reaction;Lanes 2 , 3 and 4 are PCRproducts from the first 5′RACE re-
action;Lanes 5 , 6 , 7 , 8 and 9 are PCR products from the first 3′RACE reaction.B , The obtained specific PCR product by amplifying the
first 3′RACE products with 3′NGSP(3′nest gene specific primer);C , The obtained specific PCR products by amplifying the first 5′RACE
product with 5′NGSP(5′nest gene specific primer).M represents molecular weight marker DL2000.
图 3　TsCBF 1基因全长序列的扩增
M:DNA 分子量Marker DL2000;1～ 6:引物 ORFP1和 ORFP2 扩增 ds cDNA得到特异性良好的扩增片段;7:未加 ds cDNA 模板
的阴性对照.
Fig.3　Amplification of the full-length TsCBF 1 gene sequence by RT-PCR
M:molecular weight marker DL2000 from Takara;Lanes 1-6:specific PCR products by primers ORF P1 and ORF P2;Lane 7:negative
control without ds cDNA as template in PCR.
图4　TsCBF1基因编码的氨基酸序列包含一个保守的AP2结构域
Fig.4　Amino acid sequence of TsCBF1 gene containing a conserved AP2 domain
　116　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 40卷　
　　将来自小盐芥 CBF 1基因的推测氨基酸序列和
来自 拟 南 芥 的 AtCBF 1 、 AtCBF 2 、 AtCBF 3 、 At-
DREB2A 、AtDREB2B 以及来自水稻的 CBF 1 和
DREB 1B 通过 Clustal W进行聚类分析(分析结果通
过软件 Treeview 显示),表明来自小盐芥的 TsCBF1
基因和拟南芥的 AtCBF 1有非常近的进化关系如图
5所示.
2.4　植物表达载体的构建
利用 DNA重组技术成功地构建了植物表达载
体 pCAMBIA1300-als-TsCBF1.其 T-DNA 区如图 6C
所示 , 即 TsCBF1 由玉米 ubiquitin 启动子(Pubi)启
动 ,可望在单子叶植物中高效表达.该植物转化载体
已导入到根瘤农杆菌 LBA4404中 ,用于玉米的遗传
转化.
图 5　TsCBF1 的系统树分析
使用 Clustal W 对来自小盐芥 TsCBF1 基因的推测氨基酸序列 、拟南芥的 AtCBF1 , AtCBF2 , AtCBF3 , AtDREB2A , AtDREB2B 及
水稻的CBF1 和 DREB1B 进行聚类分析(分析结果通过软件 Treeview 显示).
Fig.5　Phylogenetic analysis of TsCBF 1
Amino acid sequences of CBF1 from different species were aligned by Clustal W , and the result was viewed by bio-software Treeview.
图 6　TsCBF 1基因植物表达载体的构建
A.携带小盐芥 CBF 1基因的 pGEM-T easy载体;B.由本实验室构建的含有 als筛选标记基因的植物表达载体;C.植物表达载
体 pCAMBIA1300-als-TsCBF1的 T-DNA区.
Fig.6　Construction of plant expression vector containing CBF1 from Thellungiella salsuginea
A , pGEM-T easy vector containing CBF1 gene from Thellungiella salsuginea;B , The plant expression vector containing plant als selective
marker gene;C , T-DNA region of the plant expression vector pCAMBIA1300-als-TsCBF1.
　第 5期 高　峰 ,等:小盐芥(Thellungiella salsuginea)CBF 1基因的克隆 117　 　
3　讨论
小盐芥与拟南芥的亲缘关系近 ,在 cDNA水平
上2个物种的相似程度达到 90%以上[ 16] .我们利用
这种相似性 ,参考拟南芥的序列信息设计引物 ,克隆
出小盐芥的相应基因.基因序列分析表明 ,该基因的
预测氨基酸序列与拟南芥的 CBF 1基因有很高的序
列相似性 ,也同样含有一个 AP2结构域 ,并且二者
在该结构域的氨基酸序列的相似性高达 90%以上.
与来自其水稻的 CBF1基因相比 ,其相似性也主要
集中于该基因的 AP2结构域区 ,其 C 端的氨基酸序
列相似性则较低.同时该基因的氨基酸序列与拟南
芥的 DREB2A和 DREB 2B相比 ,只在 AP2结构域部
分有很高的序列相似性 ,在其他部分 ,氨基酸序列没
有明显的相似性.这些结果表明该基因可能是盐芥
中 CBF 家族的一个成员.
该基因来自盐生植物 ,由于小盐芥和拟南芥具
有很近的亲缘关系 ,而二者分别为盐生植物和非盐
生植物 ,其抗逆机制可能有明显差别 ,盐芥中 CBF1
的克隆和植物表达载体的构建为来自两物种的
CBF1功能比较研究打下了一定的实验基础 ,有助
于揭示植物的抗逆机制及其差异.
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(编辑:胡春霞)
　118　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 40卷