全 文 ：橡胶草（Taraxacum Kok-saghyz Rodin， TKS）是
一种产胶植物， 属于菊科蒲公英属植物， 又称俄罗
斯蒲公英。 1950 年在我国新疆发现了大量的野生
种[1]， 目前分布在我国的东北﹑华北以及西北等地。
橡胶草喜冷凉气候， 适应性强， 干旱、 盐碱地等仍
可良好生长 。 橡胶草根部橡胶含量在 2.89％～
27.89％， 从橡胶草根部提取的橡胶， 与巴西橡胶
树胶乳的结构和性能相似。 橡胶草当年播种当年即
可收获提取橡胶， 产胶周期较短 [2]。 早在 20 世纪
50 年代， 前苏联为了建立天然橡胶的原料基地，
对橡胶草开展了大量的研究， 其中研究最多的是橡
胶草的栽培、 橡胶草乳管系统的发育及橡胶提取
等； 但目前国内外关于橡胶草胶乳蛋白质方面研究
的相关报道甚少。
电泳技术和层析技术已成为蛋白质分离的两大
主要技术 [3]。 在蛋白质组研究中应用最多的是二维
聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，
2-DE）。 样品的制备是双向电泳成功的关键 [4]， 考
虑到橡胶草胶乳含有大量的色素、 多糖、 核酸及其
它一些次生代谢产物， 用常规蛋白提取方法杂质不
容易去除干净， 对后面的双向电泳过程干扰较大，
通过比较 Tris 饱和酚法和 TCA/丙酮沉淀法提取蛋
白质的双向电泳图谱， 明确适合橡胶草胶乳蛋白质
提取与双向电泳的条件。 通过对橡胶草胶乳蛋白质
的双向电泳实验， 为巴西橡胶树产胶相关的功能蛋
白研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
橡胶草由中国热带科学院橡胶研究所采胶生理
实验室从新疆引种， 2009 年 3 月 12 日种植于橡胶
研究所种质资源圃， 种植于荫棚区沙床内， 株行距
热带作物学报 2013， 34（2）： 272-275
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2011-11-13 修回日期 2012-12-26
基金项目 乙烯刺激对橡胶树萜类次生代谢的调控（No. XJSYWFZX2009-15）。
作者简介 黄荣辉（1983年—）， 男， 硕士研究生； 研究方向： 植物生理生化。 *通讯作者： 刘实忠， Email： sz_liu@126.com。
橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立
黄荣辉 1，2， 校现周 2， 仇 键 2， 刘实忠 2*， 罗世巧 2
王启超 1，2， 梅志刚 1，2， 牛静明 1，2
1 海南大学园艺园林学院， 海南海口 570228
2 中国热带农业科学院橡胶研究所， 海南儋州 571737
摘 要 采用 Tris 饱和酚法和TCA/丙酮沉淀法提取橡胶草（Taraxacum Kok-saghyz Rodin）胶乳蛋白质， 并建立蛋
白双向电泳方法。 结果表明， TCA/丙酮沉淀法得到的双向电泳图谱横条纹较多， 背景模糊， 得到约 446 个蛋白
质点； Tris 饱和酚法提取样品双向电泳的聚焦效果较好， 图谱显示约 630 个蛋白点， 其中包括较丰富的低分子
量蛋白。
关键词 橡胶草； 胶乳； 蛋白质； 电泳
中图分类号 S576 文献标识码 A
Establishment of Two-dimensional Electrophoresis for Taraxacum
Kok-saghyz Rodin Latex Protein
HUANG Ronghui1,2, XIAO Xianzhou2, QIU Jian2, LIU Shizhong2, LUO Shiqiao2
WANG Qichao1,2, MEI Zhigang1,2, NIU Jingming1,2
1 College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
2 Rubber Research Institute, CATAS, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract The total protein samples of Taraxacum Kok -saghyz Rodin ( TKS) latex extracted by Tris -saturated
phenol method and trichloroacetic acid ( TCA) /acetone precipitation method were analyzed by two -dimensional
electrophoresis ( 2 -DE). The 2 -DE gel of TCA/acetone precipitation showed strong horizontal streaks and
background blur， and 446 protein spots; While the Tris -saturated phenol extraction was capable of generating
more than 630 protein spots, obtaining better effect of isoelectric focusing. There were more small proteins
revealed by Tris-saturated phenol extraction.
Key words Taraxacum Kok-saghyz Rodin; Latex; Protein; Electrophoresis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.02.014
第 2 期 黄荣辉等： 橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立
为 20 cm×20 cm， 常规管理。 栽培数月后取成熟植
株根部胶乳进行实验。
1.2 试剂
固相 pH 剃度预制胶条（ReadyStrip IPG strip，
pH5～8， 17 cm）； 载体两性电解质 （Bio-LyteTM3/
10Ampholyte， 40％（W/V）； 丙烯酰胺 （acrylamide，
Acr）； 甲叉丙烯酰胺（N， N-methylenebisacrylamide，
Bis）； 甘氨酸（Glycine）； 十二烷基磺酸钠（Sodium
Dodecyl sulfate， SDS）； 甘油（Glycerol）； 三羟甲基
氨基甲烷（Tris aminomethane Tris-base）； 3-[（3-胆
酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）； 二硫苏糖醇
（1， 4-dithiothreitol， DTT）； 溴酚蓝 （Bromophenol
Blue）； N， N， N′， N′-四甲基二乙胺（N， N， N′，
N′-Tetramethylethylenediamine， TEMED）过硫酸铵
（Ammonium persulfate， AP）； （Agarose）； 三氯乙酸
（TCA）； 硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）； EDTA； 考马
斯亮兰 R-250（CBB R-250）； 考马斯亮兰 G-250
（CBB G-250）； 矿物油（Mineral Oil）； 琼脂糖硫尿
（Thiourea）； 牛血清白蛋白（BSA）； 苯甲基磺酰氟
（PMSF）； 碘乙酰胺（Iodoacetamide）； 尿素（Urea）；
标准蛋白质 Marker； 其它国产分析纯试剂。
1.3 主要仪器
Beckman RL8-80M型超高速离心机， Eppendorf
5415C型微量离心机， Bio-Rad IPG phor 等电聚焦
仪、 Ettan DALT 垂直电泳仪、 GS-800TM 校准光
密度扫描仪 、 PDQuest V 8.00 图像分析软件 ，
Amersham Biosciences Ultrospec4000 型紫外-可见
分光光度计。
1.4 实验方法
1.4.1 样品制备 每次采样时， 选择生长状况基
本一致的植株， 挖取根部， 洗净， 吸去根表面水
份， 用无菌刀片从距根尖处 3 cm 切断， 然后横切
根部（厚度大约 1 mm）， 待切口胶乳渗出， 用移液
枪转移胶乳到蛋白提取液中（置冰上）， 重复操作，
收集足量的胶乳。 样品收集过程中始终带上口罩及
手套， 以防污染。 收集到的橡胶草胶乳蛋白， 迅
速带回实验室进行胶乳蛋白质提取。 胶乳蛋白的
提取采用 TCA/丙酮沉淀法 [5]和 Tris 饱和酚法 [6]2 种
方法。
1.4.2 蛋白质的定量 用改良 Bradford 法测定吸
光度制作标准曲线， 根据待测样品的吸光值（波长
595 nm）， 从标准曲线中计算出样品浓度[7]。
1.4.3 双向凝胶电泳 蛋白双向凝胶电泳方法参
考龚晶晶[5]， 染色方法为银染[8]。
1.4.4 图像扫描 凝胶用 Bio-Rad 的 GS-800TM
校准光密度扫描仪进行扫描， 得到的数字化图像文
件用 PDQuest8.0.0 数据处理软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 SDS-PAGE 图谱比较
Tris 饱和酚法和 TCA/丙酮沉淀法提取橡胶草
胶乳蛋白的单向电泳比较见图 1， 由图 1可以看出，
2 种方法所得到的蛋白条带主要集中在 66.4 ku 以
下， 同时可看出 2 种方法所得单向胶图之间的差
异： 整体上， Tris 饱和酚法所得条带较清晰， TCA/
丙酮沉淀法所得条带稍模糊； 从蛋白质分子量比
较， 用 Tris 饱和酚法得到的低分子量蛋白条带较
多， 在 14.3~20.1 ku， Tris 饱和酚法得到的蛋白条
带， 比相同区域内用 TCA/丙酮沉淀法得到的条带
多； 在高分子量区域（蛋白分子量 66.4 ku 以上），
TCA/丙酮沉淀法得到的蛋白条带更多， 相比此区
域内 Tris饱和酚法得到的蛋白条带较少。
2.2 双向电泳图谱比较
分别用 Tris 饱和酚法和 TCA/丙酮沉淀法提取
橡胶草胶乳总蛋白， 通过对 2种方法的双向电泳结
果图谱比较分析， 得知以上方法均得到较好的蛋白
2-DE 图谱。 2 种提取方法的蛋白上样量均为 300
ug， 采用银染染色后用 PDQuest8.0.0 数据处理软件
进行分析后发现， Tris 饱和酚法得到蛋白点约为
630 个， TCA/丙酮沉淀法得到蛋白点约 446 个， 两
200
116
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M A B
ku
图 1 Tris 饱和酚法（A）和 TCA/丙酮沉淀法（B）
提取橡胶草胶乳蛋白的单向电泳比较
273- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
者对比大约少了 29％； 2 种提取方法均出现横条
纹， 通过对比可看出， TCA/丙酮沉淀法 2-DE 图谱
上的横条纹较为明显， 造成背景模糊（图 2）； 对比
2-DE 图谱相同区域的局部放大图可知， Tris 饱和
酚法得到的蛋白质点更为清晰饱满， 而用 TCA/丙
酮沉淀法所得到的蛋白点相对模糊些（图 3）； 此
外， 通过对比低分子量区域的局部放大图， 用 Tris
饱和酚法得到的蛋白点较多， 而 TCA/丙酮沉淀法
得到的蛋白点相对少， 也就是损失了不少低分子量
的蛋白（图 4）， 造成这种原因可能是由于某些蛋白
被 TCA/丙酮变性沉淀后， 这些蛋白沉淀很难重新
溶解， 从而引起蛋白的损失 [9]。 这说明， 在相同聚
焦条件下， 采用 Tris 饱和酚法能得到相对多的低
分子量蛋白； 重复 3 次 Tris 饱和酚法 2-DE 电泳结
果表明， 所提取的蛋白样品的稳定性和重复性均非
常高。
图 3 橡胶草总蛋白 TCA/丙酮沉淀法（A）和Tris饱和酚法（B）电泳图谱局部对比
A B
A B
图 4 TCA/丙酮沉淀法（A）与Tris 饱和酚法（B）缺失蛋白质点的局部2-DE对比图谱
图 2 两种提取方法的双向电泳图谱
IEF （pH5-8）， 17 cm IEF （pH5-8）， 17 cm
SD
S-
PA
GE
SD
S-
PA
GE
A B
A： TCA/丙酮沉淀法； B： Tris 饱和酚法。
274- -
第 2 期
3 讨论与结论
自然界中大约有 2 000 种产胶植物， 均具有特
化的细胞结构——乳管， 其成分较为复杂， 主要有
水、 碳氢化合物、 树脂、 油脂、 生橡胶等 [10]。 由于
易获取大量胶乳， 目前巴西橡胶树的胶乳蛋白组研
究比较多 [11-13]， 而橡胶草的蛋白组研究则刚起步。
因此建立可靠的样品制备方法， 尽可能去除干扰物
质， 从组织或者细胞中得到较多的蛋白种类， 是进
一步开展橡胶草蛋白组研究的基础。
本研究以橡胶草为材料， 采用了 TCA/丙酮沉
淀法和 Tris 饱和酚法 2 种蛋白质制备方法。 前者
能获得更多的高分子量蛋白， 但蛋白质沉淀在裂解
液中不能完全溶解， 图谱出现较多横条纹， 且得到
的低分子量蛋白偏少， 经初步分析， 可能是由某些
蛋白变性沉淀后难以重新溶解造成。 与 TCA/丙酮
沉淀法相比， Tris 饱和酚法操作稍显繁琐， 但得到
的蛋白质沉淀可溶性好， 其 2-DE 图谱分辨率和显
示的蛋白质点数都明显好些， 尤其是低分子量蛋白
更为丰富。 此结果也证实了 Tris 饱和酚法在多糖
和多酚去除上的优势， 最大限度地消除杂质对蛋白
提取的影响， 适用于杂质含量较高的植物蛋白质样
品的提取[14-15]。
从单向电泳和 2-DE 电泳结果中看出， 用 Tris
饱和酚法在低分子量区域能获得种类较为丰富的蛋
白质； 而巴西橡胶树胶乳蛋白组研究表明， 许多重
要蛋白质仅分布在低分子量区域， 如小橡胶粒子蛋
白 SRPP 的分子量为 24 ku， 橡胶延伸因子 REF 的
分子量仅为 14 ku[11，16]。 因此， Tris 饱和酚法在巴西
橡胶树产胶相关的功能蛋白研究方面较 TCA/丙酮
沉淀法更具优势。
综上所述， 本研究对比了 2 种蛋白质制备方
法， 确定了 Tris 饱和酚法是一种较好的橡胶草胶
乳蛋白提取方法， 适合于胶乳蛋白质提取与双向电
泳的条件， 为橡胶草产胶相关蛋白功能的深入研究
奠定了基础。
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责任编辑： 叶庆亮
黄荣辉等： 橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立 275- -