全 文 ：※农业科学 农业与技术 2015, Vol.35, No.17 1
掌叶蜂斗菜（Petasites tatewakianus Kitam.）是菊科
蜂斗菜属植物，国内资源比较丰富。主要分布于小兴安
岭、长白山地区。蜂斗菜属植物已经被证实具有很好的
抗炎、抗过敏作用 [1-3]。其中 蜂斗菜（Petasites japonicus
（Sieb. et Zucc.）Maxim）地上部分提取物已被证实具有
抗过敏和抑制肥大细胞脱粒作用 [4]。同属植物欧蜂斗菜
（Petasites hybridus），在欧洲应用历史悠久，其根茎中
的内酯类提取物已用于治疗哮喘 [5-6]。蜂斗菜属主要有效
成分是倍半萜类化合物，研究表明，蜂斗菜素和硫蜂斗
菜素等倍半萜类化合物具有抗组胺，阻止白三烯合成，
使细胞内钙离子浓度降低的作用，从而达到对炎症和痉
挛的治疗作用。本研究力图鉴定掌叶蜂斗菜叶片中的主
要活性成分，并检测其抗炎、抗过敏作用，为掌叶蜂斗
菜临床应用提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
掌叶蜂斗菜采自吉林省白山市浑江区大镜沟乡经
鉴定为蜂斗菜属植物掌叶蜂斗菜（Petasites tatewakianus
Kitam.）
1.1.2 试剂及药物
200-300 目硅胶，青岛海洋化工。乙醇、正己烷、
乙酸乙酯，国药生产；Gibco RPMI 1640 培养基（美国
Invitrogen 公司，）；胎牛血清（上海玉博生物科技有限
公司）； 抗 -DNP IgE 单抗、4- 硝基苯 -N- 乙酰 -β-D-
氨基葡萄糖苷（Amresco 公司）；二硝基苯基化牛血清
白蛋白（美国 Biosearch Technologies 公司）；富马酸酮
替芬（美国 Sigma 公司）；OVA（鸡卵球蛋白 V 级）购
于 sigma 公司（美国）；其它如无特别说明为国产分析纯。
1.1.3 实验动物及细胞
实验动物 SPF 级 4-6 周龄 BALB/c 雌性小鼠，中国
医学科学院实验动物研究所，合格证号：SCXK（京）
2013-0078，RBL- 2H3 细胞（美国 ATCC）。
1.1.4 仪器
RE52-98 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；激
光共聚焦显微镜（L8681074， NiKon，日本）；倒置显
微镜（ZKD 一 3，OLYMPUS，日本）；台式高速冷冻离
心机（德国 Sigma 公司；CO2 培养箱（上海西域机电系
统有限公司，型号：KB53）；超净工作台（上海西域机
电系统有限公司，型号：SW-CJ-1D）。
1.2 实验方法
1.2.1 蜂斗菜内酯 -D 的分离
掌叶蜂斗菜新鲜叶片（3000g）搅拌粉碎，75% 乙醇
掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯 -D 的抗炎和抗过敏作用研究
李余先 1，2*，官丽丽 2，杨 晶 2 ，张晓美 2
（1. 吉林农业科技学院中药学院， 吉林 吉林 132101；
2. 吉林农业大学教育部生物反应器与药物开发工程研究中心，吉林 长春 130118）
摘 要：本文旨在研究掌叶蜂斗菜提物取物对过敏反应及炎症的影响， 为其临床治疗过敏性哮喘提供药理学依据。主
要通过硅胶柱色谱技术从掌叶蜂斗菜叶片中得到蜂斗菜内酯 -D; 采用抗原诱导的 RBL-2H3 细胞活化脱颗粒模型，测
定蜂斗菜内酯 -D 对 β-HEX 的影响；通过 OVA 诱导和激发 BALB/c 小鼠，构建哮喘小鼠模型，并对支气管灌洗液
（BALF）中炎症细胞计数和分类计数，观察蜂斗菜内酯 -D 的抗过敏、抗炎作用。结果表明 0.1-10ug/ml 蜂斗菜内酯 -D
对 β-HEX 抑制率分别为 26.82%、34.1%、44.25%、61.32%，可见蜂斗菜内酯 -D 在此剂量内能够较明显抑制抗原诱导
RBL-2H3 细胞活化脱颗粒的 β-HEX 释放，抑制率与浓度相关；通过分析 BALF 中炎症细胞的数量， 蜂斗菜内酯 -D
治疗组与模型对照组相比，能有效抑制 BALF 中炎症细胞的数量（P<0.01）。　蜂斗菜内酯 -D 具有良好的抗炎、抗
过敏作用，可以用来治疗过敏性哮喘疾病。
关键词：蜂斗菜内酯 -D; 抗炎 ; 抗过敏
中图分类号：Q949.783.5 文献标识码：A DOI:10.11974/nyyjs.20150932001
基金项目：吉林农业科技学院青年基金资助项目（项目编号：吉农合字[2013]第 221号）
* 为本文通讯作者
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室温提取。旋转蒸发回收乙醇，剩余水溶部分分别用正
己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。正己烷层真空干燥
得提取物（100.5g），硅胶柱色谱，以正己烷 - 乙酸乙
酯梯度洗脱，薄层色谱监测，洗脱液合并，将第 3 份硅
胶柱色谱分离，以正己烷 - 乙酸乙酯 5：1 洗脱，薄层
色谱监测，合并洗脱液，经重结晶得化合物。
1.2.2 细胞培养
RBL-2H3 贴壁细胞用做实验细胞，RPMI-1640 培养
液（含 10% 胎牛血清，100μg / mL 青霉素，100 μg/mL
链霉素），培养温度 37℃、5% CO2 培养箱中培养。取对
数生长期的细胞，台盼蓝排斥染色，活细胞率 >95%。
1.2.3 蜂斗菜内酯 -D 对抗原诱导的 RBL-2H3 细胞活
化脱颗粒 β-HEX 释放的影响
实验分组：正常组、模型组、给药组、药物阴性对
照组、富马酸酮替芬阳性对照组。 其中，给药组和药物
阴性对照组分别由蜂斗菜内酯 -D 0.1、1、10、100ug/ml
四个浓度组成；富马酸酮替芬 100ug/ml 作为阳性对照药
组。将处于对数生长期的 RBL-2H3 细胞从培养箱中取
出，进行细胞消化并制备成细胞悬液。用培养基调整细
胞数至 2.5×105 /mL，每孔 1000μL 接种于 24 孔培养板
中，在 37℃ 5% CO2 培养箱中培养。按已定方法分组后，
每孔加入 0.25μg/mL 的抗 DNP-lgE 单抗致敏孵育过夜。
次日，各浓度的药物加至给药组及药物阴性对照组中预
孵育 1h，用等量 RIPM1640 培养基替代加至正常组、模
型组。1h 后，用 PIPES 缓冲液清洗细胞 3 次。每孔加入
200μL PIPES 缓冲液（含 25ng/mL 的 DNP-HSA）至模
型组及给药组，用等量缓冲液替代加至正常组和药物阴
性对照组，37℃孵育 1 h，刺激细胞 β-HEX 的释放。每
组上清各取 50μL，加入到 96 孔培养板中，取 50μL 显
色液加入，37℃孵育 1h。加入 200μL 碳酸钠缓冲液终
止反应，在 405nm 波长下检测 OD 值。β-HEX 释放抑
制率计算：β-HEX 抑制率（%）=[1 －（TOD － BOD －
NOD）/（COD － NOD）] ×100%。
1.2.4 支气管哮喘小鼠模型的建立及 BALF 中炎症细
胞计数和分类计数
雌性，4 ～ 6 周龄，Balb/c 小鼠， 18 只 ，随机分为
阴性对照组、药物对照组、OVA 模型组和药物治疗组。
始终给予 PBS 液处理阴性对照组，在第 0，1，2 天，
给予阴性对照组和药物对照组小鼠腹腔注射 PBS 0.2ml/
只，给予 OVA 模型组和药物治疗组小鼠腹腔注射 100ug
OVA+ 2mgAl（OH）3，在第 5~11d，给予阴性对照组和
OVA 模型组小鼠每只每天腹腔注射 0.2ml PBS 液，药物对
照组和药物治疗组腹腔注射蜂斗菜内酯 -D（1mg/kg PBS
溶解），在第 14、15、19d，乙醚麻醉小鼠后， OVA 滴
鼻激发，最后一次滴鼻后 48 小时处死小鼠，取血，支气
管肺泡灌洗（BALF），回收支气管肺泡灌洗液，记录回
吸收量 ; 取 BALF 500g，37℃，离心 5min，取离心后的沉
淀细胞，用 1mL PBS 重悬细胞，进行计数 ; 细胞悬液涂片，
染色液染色，计数 200 个细胞，进行细胞分类计数。
2 实验结果
2.1 蜂斗菜内酯 -D 鉴定
化合物白色针状结晶，经 EI-MS（m/z）、IR（KBr，
cm-1）、1HNMR（500MHz，CDCL3） 、13CNMR 和 DEPT
数据分析，比较文献 [7] ，确认化合物为蜂斗菜内酯 -D
（Bakkenolide-D）。
2.2 蜂斗菜内酯 -D 对抗原诱导 RBL-2H3 细胞活化脱
颗粒 β-HEX 释放的影响
根据相应的 β-HEX 释放抑制率的公式计算所得
0.1 ～ 100ug/L 蜂斗菜内酯 -D 的抑制率分别为 26.82%、
34.1%、44.25%、61.32%。 这 表 明 该 剂 量 范 围 内 的 蜂
斗菜内酯 -D 对抗原诱导 RBL-2H3 细胞活化脱颗粒的
β-HEX 释放具有较明显的抑制作用，抑制作用强弱与
浓度相关，如图 1。其中阳性对照药富马酸酮替芬 β-HEX
释放抑制率为 63.0%。结果显示 100ug /ml 的蜂斗菜内酯
对 β-HEX 释放的抑制作用很明显，可与阳性药物富马
酸酮替芬的抑制作用相媲美。
图 1 蜂斗菜内酯 -D（0.1-100ug/ml）对抗原诱导 RBL-2H3
细胞活化脱粒 β-HEX 释放的影响
结果以均值 ±SD 表示（n=3）。实验重复 3 次。
2.3 蜂斗菜内酯 -D 对过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌液
（BALF）中炎症细胞抑制作用
通过分析 BALF 中炎症细胞的数量，进一步观察蜂
斗菜内酯 -D 对过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌液（BALF）
中炎症细胞的抑制作用。如图 2 显示， 空白对照组与单
独蜂斗菜内酯 -D 组无明显差异，蜂斗菜内酯 -D 治疗组
与模型对照组相比，能有效抑制 BALF 中嗜酸性粒细胞、
0
10
20
30
40
50
60
70
0.1 1 10 100
蜂斗菜内酯-D浓度(ug/ml)
β
-H
EX
抑
制
率
※农业科学 农业与技术 2015, Vol.35, No.17 3
巨噬细胞、淋巴细胞的数量（P<0.01）。
图 2 蜂斗菜内酯 -D 对哮喘小鼠 BALF 中炎症细胞的影响
3 讨论
炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于
刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。
炎症性疾病在临床上较常见，如外伤感染及各种传染病
等。过敏反应是指已免疫的机体在再次接受相同物质的
刺激时所发生的反应。反应的特点是发作迅速、反应强烈、
消退较快；一般不会破坏组织细胞，也不会引起组织损伤，
有明显的遗传倾向和个体差异。临床研究表明炎症与过
敏反应具有一定相关性，密不可分，通常情况下具有过
敏体质的机体对抗原性物质发生过敏反应，同时会出现
相应部位的急性和慢性炎症病理反应。如临床常见的过
敏性炎症疾病过敏性鼻炎、慢性支气管炎、哮喘、过敏
性皮炎等。蜂斗菜属植物主要成分为倍半萜内酯类化合
物 [8-9] ，张福金等从此属植物中分离的蜂斗菜内酯类倍半
萜化合物，具有抗卵清蛋白诱导的大鼠过敏性鼻炎作用，
并能降低血清中组氨酸和白介素水平，减少鼻粘膜中嗜
酸性粒细胞的浸润和大鼠搔鼻次数 [3]。另有文献报导蜂
斗菜提取物具有抗Ⅰ型过敏、抑制肥大细胞脱粒和对卵
清蛋白诱导的小鼠肺炎模型中气道炎症的抑制作用 [2，4]。
本研究为对掌叶蜂斗菜的主要成分蜂斗菜内酯 -D 的
药理作用进行研究，进一步揭示蜂斗菜内酯抗炎、抗过
敏作用的相关性及物质基础。采用抗原诱导 RBL-2H3 细
胞活化脱颗粒模型，观察蜂斗菜内酯 -D 对 β-HEX 释放
的影响；采用卵清蛋白诱导的哮喘小鼠模型，观察蜂斗
菜内酯 -D 对支气管肺泡灌液（BALF）中炎症细胞抑制
作用。结果发现 0.1-100ug/ml 蜂斗菜内酯 -D 的抑制率分
别为 26.82%、34.1%、44.25%、61.32%，在研究剂量范
围内的蜂斗菜内酯 -D 对抗原诱导 RBL-2H3 细胞活化脱
颗粒的 β-HEX 释放具有较明显的抑制作用，抑制作用
强弱与浓度相关；蜂斗菜内酯 -D 治疗组与模型对照组相
比，能有效抑制 BALF 中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋
巴细胞的数量。综上所述，蜂斗菜内酯 -D 具有明显的抗
炎、抗过敏作用，为其临床使用提供药理学依据。
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作者简介：李余先（1979-），男，博士，讲师，研究方向：
中药学。
0
40
80
120
160
200
Total Eosinophils macrophage lymphocyte
PBS
Bakkenolide-D
OVA
OVA+Bakkenolide-D
Cells （
×
10 4 /ml）
in BALF