全 文 ：第 33卷　第 5期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 33 No. 5
2005年 5月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) May 2005
山杏下胚轴再生植株的研究
王　鸿1, 2 ,马锋旺 1 ,郝　燕 2
( 1西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌 712100;
2甘肃省农科院果树研究所 ,甘肃兰州 730070)
　　 [摘　要 ]　研究了影响山杏下胚轴再生的有关因素 ,首次获得了山杏下胚轴再生植株。结果表明 ,经 15 d的暗
培养 ,山杏下胚轴切段在附加 TDZ 2 mg / L+ N AA 0. 5 mg / L的改良 M S培养基 ( 1 /2 NH4NO3 )上 ,愈伤组织诱导
率 ( 100% )和再生频率 ( 37. 5% )均最高 ,细胞分裂素用 TDZ效果优于 6-BA,再生获得的不定芽在改良 M S+ IBA
0. 2 mg /L培养基上生根率为 75. 8%。
[关键词 ]　山杏 ;下胚轴 ;再生植株 ;组织培养
[中图分类号 ]　 S662. 204+ . 3　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2005) 05-0127-03
　 　山 杏 〔 Armeniaca vulgaris Lam. va r. ansu
( Maxim)〕是杏属重要的果树资源之一 ,不仅用作栽
培杏的砧木 ,而且还是生产杏仁的重要经济树种。自
Valerie等 [1 ]首次报道杏离体叶片经胚状体培养获
得再生植株以来 , Miaja等 [2 ]、马锋旺等 [ 3]、孙清荣
等 [4 ]也分别利用杏离体叶片、原生质体和幼胚子叶
先后培养得到了再生植株。 下胚轴再生植株已见于
李 [5 ]、核桃 [6 ]、柿 [7 ]、枣 [8 ]等果树树种 ,但目前尚未见
杏下胚轴获得再生植株的报道。 本试验对山杏离体
下胚轴再生的有关因素进行了研究 ,以期为进一步
开展山杏的遗传转化提供再生体系。
1　材料与方法
1. 1　下胚轴的获得
　　供试材料为山杏当年成熟种子。砸开核壳 ,取出
种仁 ,用自来水冲洗 30 min后 ,用体积分数 75%乙
醇浸泡 30 s, 1 g /L升汞表面消毒 7 min,然后用无
菌水冲洗 4～ 5次 ,装入盛有无菌水的三角瓶中浸泡
24 h,在无菌条件下剥去种皮 ,将种子接种在改良
MS培养基 ( 1 /2 N H4NO3 )上 ,放入 3～ 4℃的冷藏
柜中 30 d,然后转至 25℃、 1 500 lx、光暗周期 16 h /
8 h条件下培养 15 d,得到生长健壮的下胚轴。
1. 2　基本再生方法
本试验中基本培养基为改良 MS培养基 ( 1 /2
N H4NO3 ) ,根据需要加入不同浓度的激素 ,并附加
蔗糖 30 g /L、琼脂 6 g /L,灭菌前将 pH值调至 5. 8,
121℃ ( 1. 2 kg /cm2 )湿热灭菌 20 min。无菌条件下
将下胚轴切成约 0. 5 cm的小段 ,水平接种于再生培
养基上 ,每处理最少接种 5瓶 ,每瓶接种 5～ 7段 ,接
种后置于 22℃左右黑暗条件下培养 15 d,然后转至
( 23± 2) ℃、 1 500 lx、光暗周期 16 h /8 h条件下培
养 ,并连续观察愈伤组织诱导率和再生频率。试验中
对尚未产生再生不定芽的外植体进行多次继代培
养 ,观察继代次数对愈伤组织诱导和再生的影响。
1. 3　激素种类及其浓度对再生的影响
再生培养基附加的细胞分裂素为 TDZ( 0. 5,
1. 0, 2. 0, 3. 0 mg /L )和 6-BA( 1. 0, 2. 0, 5. 0 mg /L) ,
生长素为 NAA( 0. 25, 0. 50, 1. 00 mg /L )和 2, 4-D
( 0. 5, 1. 0 mg /L) ,激素组合及其浓度详见表 1。在研
究不同激素组合及浓度对愈伤组织诱导率和再生频
率的影响时 ,各处理均经 15 d暗培养后转至 23℃、
2 000 lx、光暗周期 16 h /8 h条件下培养 ,每 20 d继
代 1次至相同培养基。接种后连续观测愈伤组织生
长状况及愈伤组织诱导率和再生频率。 愈伤组织诱
导率 /% = (形成愈伤组织的轴段 /总接种轴段数 )×
100% ,再生频率 /% = (分化出不定芽的轴段数 /总
接种轴段数 )× 100% 。
1. 4　暗培养时间对再生的影响
在激素组合为 TDZ 2 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L
的再生培养基上 ,设 5, 10, 15和 20 d暗培养时间处
理 ,然后转入 ( 23± 2) ℃、 1 500 lx、光暗周期
16 h /8 h条件下培养 ,观察愈伤组织诱导率和再生
[收稿日期 ]　 2004-08-17
[作者简介 ]　王　鸿 ( 1973- ) ,男 ,甘肃灵台人 ,助理研究员 ,在读硕士 ,主要从事核果类果树生理与栽培育种技术研究。
[通讯作者 ]　马锋旺 ( 1964- ) ,男 ,山东汶上人 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,主要从事果树生理及生物技术改良研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2005. 05. 031
频率。
1. 5　生长与生根
得到的再生不定芽在改良 MS培养基 ( 1 /2
N H4NO3 )上伸长生长后 ,取大于 2 cm长的健壮芽
分别在附加 0. 1, 0. 2, 0. 4 mg /L IBA的改良 M S培
养基上进行生根培养。培养条件为 25℃、 1 500 lx、
光暗周期 16 h /8 h。
2　结果与分析
2. 1　激素种类与浓度对愈伤组织诱导和再生的影
响
观察发现 ,下胚轴在再生培养基上培养 3～ 5 d
后轻度变褐 ,略有增粗和伸长。培养 7 d后各处理开
始产生乳白色及淡黄色愈伤组织 ,在第 20～ 40天时
陆续获得再生不定芽。表 1结果表明 ,山杏下胚轴在
含 TDZ 2. 0 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L的培养基上愈
伤组织诱导率和再生频率均最高 ,分别达到 100%
和 37. 5% 。在含 6-BA 1. 0 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L
的培养基上也获得了相对较高的愈伤组织诱导率
( 96. 4% )和再生频率 ( 28. 6% )。 TDZ适宜浓度为
2. 0 mg /L,低浓度 ( 0. 5 mg /L ) TDZ易于诱导愈伤
组织但再生频率较低。 0. 5 mg /L N AA对提高愈伤
组织诱 导率 及再生 频率 效果最 佳 , 高浓 度
( 1. 0 mg /L)时愈伤组织诱导率及再生频率均下降 ,
低浓度 ( 0. 25 mg /L )时诱导愈伤组织效果良好 ,但
再生频率明显下降。高浓度 ( 1. 0 mg /L) 2, 4-D不利
于愈伤组织诱导 ,且没有不定芽再生。
表 1　植物生长调节剂对山杏下胚轴再生植株的影响
Table 1　 Effects of plant g r ow th regula tor s on regeneration of hypocoty ls o f Armeniaca vul garis va r. ansu
植物生长调节剂 / ( mg· L- 1)
Plant g row th reg ulato rs
TDZ NAA 6-BA 2, 4-D
外植体数
No. of
explan ts
愈伤组织诱导率 /%
Percentage of
calli ind ucing
hypoco tyl
再生频率 /%
Percen tage of
reg enerating
h ypocotyl
1. 0 0. 5 0. 0 0. 0 27 96. 3 3. 7
2. 0 0. 25 0. 0 0. 0 33 97. 0 12. 2
2. 0 0. 5 0. 0 0. 0 32 100. 0 37. 5
2. 0 1. 0 0. 0 0. 0 27 72. 2 18. 5
3. 0 0. 5 0. 0 0. 0 31 90. 3 13. 0
0. 0 0. 0 5. 0 0. 5 35 94. 3 11. 4
0. 0 0. 0 5. 0 1. 0 26 76. 9 0. 0
0. 0 0. 0 2. 0 1. 0 34 88. 2 0. 0
0. 0 0. 0 2. 0 0. 5 34 97. 1 14. 7
0. 0 0. 5 1. 0 0. 0 28 96. 4 28. 6
0. 0 0. 5 2. 0 0. 0 35 94. 3 20. 0
0. 5 0. 5 0. 0 0. 0 25 100. 0 16. 0
0. 5 0. 25 0. 0 0. 0 27 88. 9 14. 8
0. 0 0. 0 1. 0 0. 5 26 96. 2 0. 0
2. 2　暗培养对愈伤组织诱导和再生的影响
图 1表明 ,在改良 M S+ TDZ 2 mg /L+ N AA
0. 5 mg /L培养基上 ,未进行暗培养时其愈伤组织诱
导率和再生频率均为 0;不同暗培养时间处理对愈
伤组织的诱导率均超过 90% ,各处理间无明显差
异 ;但不同暗培养时间处理的山杏下胚轴不定芽再
生频率差异显著 ,其中以暗培养 15 d效果最好。
2. 3　继代次数对愈伤组织诱导和再生的影响
试验结果表明 ,山杏下胚轴愈伤组织诱导率及
再生频率在接种后 40 d内即可达到最高 ,多次继代
并不能使之提高。
2. 4　不定芽的生长和生根
山杏下胚轴抽生的不定芽转接到改良 MS培养
基上生长良好 ,生长至 4～ 5片叶大于 2 cm长时 ,在
附加不同浓度 IBA的改良 M S培养基上进行生根
培养 ,结果发现在改良 M S+ IBA 0. 2 mg /L培养基
上 , 15 d即可诱导出不定根 ,进一步培养可形成完
整植株 ,平均生根率达到 75. 8% 。
图 1　暗培养时间对愈伤组织诱导率及再生频率的影响
- ○ - .愈伤组织诱导率 ; - □ - .再生频率
Fig. 1　 The effec t of differ ent day s cultured
in da rk on calli inducing and bud regeneration
- ○ - . Percentage of inducing h ypocotyl;
- □- . Percentag e of reg enerating hypocotyl
128 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 33卷
3　讨　论
本研究获得了山杏成熟胚下胚轴较高的不定芽
再生率 ,且所需时间短 ,为山杏遗传转化提供了有效
方法 ,并为杏的子叶、叶片高频再生提供了参考。
通常获得再生芽都需要切口造伤 [9, 10 ] ,并且不
定芽往往产生于愈伤组织暴露于空气中的部分 [11 ] ,
这与本试验研究结果一致 ,不定芽的产生部位均在
下胚轴切段的切口处 ,其起源有待进一步研究。
离体器官不定芽的形成在一定程度上受到光敏
色素的控制 ,暗培养更有利于不定芽的形成。许多研
究结果 [ 12～ 16 ]表明 ,暗培养时间依树种、品种的不同
而异 ,一般在 1～ 4周 ,山杏下胚轴再生所需暗培养
时间与 Olaya Pé rez-To rnero等 [17 ]获得的 Canino杏
叶片高频再生所需时间相同。
激素种类和浓度对山杏下胚轴不定芽再生有重
要作用 ,对于同浓度的细胞分裂素 , TDZ的效果优
于 6-BA,这与对许多木本植物再生的研究结果相
同 [13～ 1 5, 18, 19]。生长素则以 N AA效果优于 2, 4-D,这
可能与 NAA抑制了酚类物质的分泌作用 [13 ]相关。
在 TDZ与 NAA激素组合中 , N AA浓度主要影响
愈伤组织诱导 , TDZ浓度主要影响不定芽再生 ;在
BA与 2, 4-D激素组合中 , BA浓度过低或 2, 4-D浓
度过高都不利于不定芽的发生。为提高山杏下胚轴
不定芽再生频率 ,不同的激素组合、浓度及其他相关
因素需进一步研究。
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(下转第 134页 )
129第 5期 王　鸿等:山杏下胚轴再生植株的研究
such as critical w ater saturation deficiency ( CWSD) , f ree pro line content, elect rical conductiv ity o f leaves
and shoo t g row th leng th w ere investig ated and analy sed af ter draught st ress t reatment. The result indicat-
ed tha t g row th ra te o f fiv e g round cover plants tended to decrease w hi le the proline content and electrical
conductiv ity w ould increase instead af ter the t reatment. It seemed that the w eaker draught resistance the
plants had the g rea ter increasing ex tent the electrical conductivi ty show ed. When treated plants w ere w a-
tered as usual as CK they w ould resume to g row dif ferently wi th dif ferent species. CWSD should be com-
bined wi th the time during which the leaves tested became permanent w ilting to represent the desiccation
avoiding abi li ty o f the plants in place of CWSD application alone. Otherw ise the value of CWSD would no t
cor respond to the actual plant si tuation about draught resistance f rom time to time. Acco rding to multiple
analysis, draught resistance order o f fiv e species are Buddhanai l> Co ttag e pink> Betony> Thyme> Looses-
trife.
Key words: g round cover plants; draught resistance; critical w ater satura tion deficiency; f ree proline;
electrical conductivi ty
　　 (上接第 129页 )
Abstract ID: 1671-9387( 2005) 05-0127-EA
Plant regeneration from hypoco tyls of
Armeniaca vulgaris Lam. var. ansu Maxim
WANG Hong
1, 2 ,MA Feng-wang
1 ,HAO Yan
2
( 1 College of Horticul ture,N orthwest A & F University , Yangling, Shaanx i 712100,China;
2 The Instit ute of Pomology ,Gansu Academy of Agricultural Science, L anzhou ,Gansu 730070,China)
Abstract: Adventi tio us plants regenera ted f rom mature hypoco tyls of Armeniaca vulgaris var. ansu
have been obtained, wi th the rate of shoo ts regenera ted being 37. 8% when cul tured on the half N H4NO3 of
M S medium supplemented wi th TDZ 2. 0 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L for 15 d in dark and then expo sed to
ligh t. TDZ w as bet ter than 6-BA in plant regenera tion. The roo ting rate was 75. 8% when the buds cul-
tured on half N H
+
4 of M S+ IBA 0. 2 mg /L.
Key words: Armeniaca vulgaris var. ansu; hypoco tyl; reg eneration plant; ti ssue cul ture
134 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 33卷