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山杏组培繁殖技术研究



全 文 :北方园艺2013(03):115~118 ·生物技术·

参考文献
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Study on Optimum for Regeneration System of Leaves in Hovenia acerba
SUN Ye-fang1,ZHENG Qi 1,SUN Jun-wei 2,CHEN Zhen3,ZHOU Dan2
(1.Shaoxing Academy of Agriculture Sciences,Shaoxing,Zhejiang 312003;2.Department of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou,
Zhejiang 310018;3.School of Life Sciences,Taizhou University,Taizhou,Zhejiang 318000)
Abstract:A regeneration protocol for Hovenia acerba were set up via organogenesis from calus derived from leaf disc of
regeneration Hovenia acerba plants in vitro.The results showed that the best explants were mature leaves with dark
green color,and the best placement way of explants was face-up;the most appropriate medium for the induction of calus
and adventitious buds was 1/2MS+BA 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L,with the induction rate more than 85%and
proliferation rate more than 6.0;the most appropriate medium for the rooting was 1/4MS+NAA 0.1mg/L,with
addition of 2%sucrose,in which the rooting rate exceeded 95%.
Key words:Hovenia acerba;plant growth regulator;leaf disc of regeneration plants;adventitious buds induction;
rooting induction
第一作者简介:郑可(1987-),女,硕士,现主要从事森林培育等方
面的研究工作。E-mail:zhengke19870430@163.com.
责任作者:董胜君(1974-),男,博士,副教授,现主要从事森林培育
及种子与苗木培育等研究工作。E-mail:dsj928@163.com.
基金项目:国家林业公益性行业科研专项资助项目(201004034);
中央财政林业科技推广示范资金资助项目([2010]02)。
收稿日期:2012-10-22
山 杏 组 培 繁 殖 技 术 研 究
郑   可1,董 胜 君1,田 明 芳2,刘 明 国1,吴 月 亮1,安 成 亮1
(1.沈阳农业大学 林学院,辽宁 沈阳110866;2.阜新蒙古族自治县林业科技示范中心,辽宁 阜新123000)
  摘 要:以山杏为试材,研究了外植体的消毒、基本培养基筛选、外植体的种类及不同浓度配
比的激素对外植体各阶段生长的影响。结果表明:采用1.0g/L的HgCl2消毒3min灭菌效果最
好;以改良MS[C(NH4+)∶C(NO3-)=0.16]为基本培养基,组培苗分化和生长效果较好;最适外
植体为茎尖;初代培养最适的激素配比为1.0mg/L的6-BA和0.05mg/L的NAA;继代培养最
适的激素配比为0.5mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。
关键词:山杏;组培;繁殖技术
中图分类号:S 662.204+.3 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2013)03-0115-04
  山杏(Prunus sibirica)属蔷薇科李属杏亚属落叶灌
木或乔木。山杏是亚洲特有的生态经济型树种,其生态
特性为喜光,耐寒性强,耐干旱瘠薄[1],是丘陵山区阳坡、
半阳坡造林绿化的先锋树种;而且具有优良的水土保持
和防风固沙功能,成为我国三北地区水土保持、防风固
沙和小流域综合治理等生态建设工程的主要造林树种;
山杏同时具有很高的经济价值,主要体现在杏仁、花、树
皮、叶、核壳和杏肉等方面;山杏的树形优美,春季先叶
开花,花色迷人,也是较好的园林绿化树种。因此,研究
山杏的组培技术,为山杏的繁殖提供快速有效的方法,
能使山杏在经济,生态,优良品系的保持上发挥重要
511
·生物技术· 北方园艺2013(03):115~118
作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
分别选取沈阳农业大学校园内25a生的山杏当年
生枝条的茎尖、茎段和叶片及阜新市阜蒙县大巴沟山上
的10a生山杏的当年生枝的茎尖为外植体材料。
1.2 试验方法
1.2.1 初代培养 外植体灭菌时间的筛选:将采取的外
植体用自来水冲洗干净,再用灭菌滤纸吸干水分,将其
放入75%的酒精中浸泡30s,无菌水冲洗3~5次,
用1.0g/L HgCl2进行灭菌处理。并不停的搅拌,使消
毒更加彻底,最后用无菌水冲洗5~7次。将处理过的
材料浸泡在无菌水中待用。分别设1、3、5min 3个时间
升汞消毒处理。以茎段为外植体,每个处理10瓶,每瓶
接2个外植体,3次重复,10d后统计存活率和污染率。
基本培养基的筛选:分别以MS、改良 MS[C(NH4+)∶C
(NO3-)=0.16]、WPM为基本培养基,其中均附加1.0
mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA,蔗糖30g/L,琼脂6g/L。
以茎尖为外植体,每处理培养10瓶,每瓶接种1个外植
体,每个处理重复3次。观察外植体的成活率、萌发率、
分化率和生长情况。激素筛选:以选定培养基为基本培
养基,以茎尖为外植体,以6-BA 0.0、0.5、1.0、2.0mg/L
和NAA 0.00、0.05、0.10、0.15mg/L为试验水平,采取
完全随机区组试验设计,设计16个处理,每个处理培养
10瓶,每瓶接种1个外植体,每个处理重复3次。其中
均附加蔗糖30g/L,琼脂6g/L。观察在不同浓度和不
同激素的作用下,丛生芽诱导率和生长情况。外植体筛
选:以选定的培养基为基本培养基,添加选定的激素浓度,
其中均附加蔗糖30g/L、琼脂6g/L。分别用山杏的茎
尖、茎段、叶片为外植体,接种到培养基上。每处理培养
10瓶,每瓶接种1个外植体,每处理重复3次。观察不
同外植体的芽启动时间、分化率和生长情况。
1.2.2 继代培养 初代培养后,选取生长健壮,无染菌
的幼苗,进行继代培养的激素浓度的初步筛选,以6-BA
0.5、1.0mg/L和NAA 0.05、0.10mg/L交叉配比为4
个试验水平,以初代培养中选定的培养基为基本培养
基,其中均附加蔗糖30g/L,琼脂6g/L。每处理培养10
瓶,每瓶接种1个外植体,每个处理重复3次。观察丛生
芽诱导率和生长情况。
1.2.3 培养条件 培养室温度为24~25℃,光照强度
为2 000~3 000lx,光照时间为16h/d,空气相对湿度为
40%~70%,以上培养基的pH均为5.6~5.8。
1.3 数据分析
数据分析均采用Excel和Spss软件进行处理和分
析。生长情况的评价标准分为3个等级:第1个等级为
组培苗细弱,生长缓慢,叶色发黄(+);第2个等级为组
培苗长势一般,叶色浅绿(++);第3个等级为组培苗健
壮,生长较快,叶色浓绿(+++)。
2 结果与分析
2.1 不同激素浓度对初代培养中组培苗的影响
2.1.1 灭菌时间对外植体灭菌效果的影响 对山杏茎
段采用3种升汞灭菌时间处理。由表1可知,当用1.0
g/L HgCl2消毒1min时,10d后茎段的死亡率最低,但
污染率最高;消毒5min时,10d茎段的死亡率最高,污
染率却最低;而消毒3min时,茎段的污染率和死亡率都
控制在较低的水平,成活率可达81.7%,而且外植体在
培养基上生长良好。因此用1.0g/L HgCl2消毒3min
为最佳的消毒时间。
表1 消毒时间对外植体灭菌效果的影响
  Table 1 Efect of disinfection time on the explants sterilizing efect
消毒时间
Processing
time/min
外植体数
Explants number
/个
死亡率
Mortality rate
/%
污染率
Contamination rate
/%
成活率
Survival rate
/%



60
60
60
3.3±0.26c
8.3±0.46b
26.7±1.31a
43.3±1.25a
10.0±0.70b
3.3±0.36c
53.4±1.25c
81.7±1.11a
70.0±1.14b
  注:表中数据为3次重复的均值±标准差;LSD多重比较,表中同列中不同字母
表示α=0.05显著水平,下同。
Note:Data in the table is the mean of three repetitions±standard deviation;LSD
multiple comparisons,diferent letters in the same column in the table representα=0.05
significant level,the same below.
  表2 培养基对外植体分化和生长情况的影响
  Table 2 Efect of division and growth condition of explants in medium
培养基
Medium
成活率
Survival
rate/%
萌发率
Germination
rate/%
分化率
Division rate
/%
平均丛生芽数
Average number of
multiple shoots/个
生长情况
Growth
condition
WPM
MS
改良 MS
50.0±2.98c
63.3±2.95b
70.0±1.51a
10.0±1.93c
16.7±2.41b
60.0±2.10a
0.0±0.00c
6.7±1.31b
50.0±3.80a
0.0±0.00c
1.3±0.36b
2.5±0.66a

++
+++
2.1.2 基本培养基对外植体生长的影响 表2结果表
明,在WPM培养基上外植体没有分化的现象,而且生长
状态较差;而在MS和改良MS培养基上,外植体都有分
化的现象,但是MS培养基上分化的丛生芽较少而且生
长状态一般,而改良MS培养基上外植体生长健壮,丛生
芽较多而且有高生长趋势。所以山杏的适宜基本培养
基为改良MS培养基。
2.1.3 激素浓度对外植体生长的影响 6-BA和NAA
的2因素4水平的完全随机区组试验结果见表3。当
NAA的浓度为0mg/L时,随着6-BA的浓度增加丛生
芽的诱导率不断增加。其中6-BA 1.0mg/L+NAA
0.05mg/L和6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L的培
养基中外植体生长的都很好,叶色深绿而且健壮,但是
611
北方园艺2013(03):115~118 ·生物技术·
6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L的培养基中外植体
的丛生芽诱导率更高些,而且6-BA 2.0mg/L+NAA
0.10mg/L的组培苗有些出现了玻璃化现象,因此6-BA
1.0mg/L+NAA 0.05mg/L的激素配比更适宜山杏的
丛生芽的诱导和组培苗的生长。在最适激素浓度培养
基上,5d茎尖开始在原有的基础上生长变大(图1-1);15
d基部开始长愈伤组织,有些叶腋处长出芽并生长变大
(图1-2);22d后基部的愈伤组织分化出丛生芽,有些叶
腋也长出了丛生芽(图1-3);30d开始有些丛生芽开始
往高生长并且继续分化(图1-4)。对试验结果进行双因
素方差分析。由表4可知,4,6-BA和NAA对山杏的丛
生芽诱导率极显著,6-BA×NAA的交互作用对山杏的
丛生芽诱导率也极显著,显著水平达到了0.000。
  表3 不同激素浓度对外植体诱导率和生长情况的影响
  Table 3 Efect of induction rate and growth condition of explants in diferent hormone concentrations
处理
Treatment
6-BA
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
外植体数
Explants
number/个
产生丛生芽外植体数
Explants number of
producing multiple
shoots/个
丛生芽诱导率
Induction rate
multiple shoots/%
平均丛生芽数
Average number of
multiple shoots/个
生长情况
Growth condition









10
11
12
13
14
15
16
0.0
0.5
1.0
2.0
0.0
0.0
0.0
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
2.0
2.0
2.0
0.00
0.00
0.00
0.00
0.05
0.10
0.15
0.05
0.10
0.15
0.05
0.10
0.15
0.05
0.10
0.15
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30










15
10


12

0.0±0.00j
10.0±0.72i
16.7±1.65g
20.0±1.32f
0.0±0.00j
0.0±0.00j
0.0±0.00j
10.0±0.96i
13.3±1.14h
0.0±0.00j
50.0±1.00a
33.3±0.30c
20.0±0.98f
30.0±0.30
40.0±0.36b
26.7±0.53e
0.0±0.00c
1.0±0.30b
1.0±0.26b
1.0±0.62b
0.0±0.00c
0.0±0.00c
0.0±0.00c
1.0±0.62b
1.0±0.26b
0.0±0.00c
2.5±0.66a
1.7±0.62a
1.8±0.44a
1.9±0.40a
2.1±0.36a
1.8±0.46a


++
++



++
++

+++
++
++
++
+++
++
图1 改良MS中山杏组培苗不同天数生长情况
Fig.1 Growth condition of tissue culture seedling of Prunus sibiricain improved MS medium in diferent days
表4 方差分析结果
  Table 4 Results of analysis of variance
变异来源
Source of variation
自由度
Degrees of freedom
F值
Fvalue
显著水平
Significant level
6-BA
NAA
6-BA×NAA



4 459.215
710.160
306.219
0.000
0.000
0.000
2.1.4 外植体筛选结果 分别选用山杏的茎尖、茎段、
叶片为外植体进行组培试验,由表5可知,茎尖分化产
生丛生芽的时间是第22天,最快;叶片是32d;茎段需要
45d,最慢。而且茎尖的分化率最高达到50%,茎段分化
率最低只有3.3%。而且以茎尖为外植体的组培苗生长
健壮,分化的丛生芽较多,丛生芽容易向高生长。因此
茎尖为山杏的最适外植体材料。这3类外植体产生丛
生芽的状况分别不同。茎尖是先生长变大,并且基部开
始长愈伤组织,然后由基部愈伤组织和叶腋处分化出丛
生芽;茎段是叶腋处芽先突破芽鳞,开始生长变大,然后
分化出丛生芽,或者长大后的腋芽转接到其它培养基然
后分化出丛生芽;叶片首先生成愈伤组织,然后在愈伤
组织上分化出丛生芽,但是产生的丛生芽叶色淡绿发
黄,生长较慢。
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·生物技术· 北方园艺2013(03):115~118
表5 外植体筛选结果
  Table 5 Result of selecting explants
外植体种类
Explants type
芽启动时间
Bud start up time/d
分化率
Division rate/%
生长情况
Growth condition
茎尖
茎段
叶片
22
45
32
50.0±3.80a
3.30±0.57c
10.0±1.47b
+++

++
2.2 不同的激素浓度对继代培养中组培苗的影响
从初代培养基上选取生长健壮、无染菌的组培苗,
其上的丛生芽分成单芽,将所得的单芽接种到4种不同
浓度配比的继代培养基上,30d后所得结果见表6。表6
结果表明,大部分单芽都产生了新的丛生芽,而且都有
不同程度的生长。继代培养采用原有的初代培养基中
添加1.0mg/L的6-BA的2种激素配比诱导丛生芽的
效果都比较差,而降低了6-BA浓度的培养基诱导丛生
芽的效果比初代时候要好,当激素浓度为0.5mg/L
6-BA,0.10mg/L NAA时,继代培养中丛生芽的诱导效
果最好,诱导率可达到68.8%,而且生长情况最好。
  表6 继代培养激素浓度筛选结果
  Table 6  Results of selecting hormone concentrations in subculture
处理
Treatment
6-BA
/mg·L-1
NAA
/mg·L-1
外植体数
Explants number/个
产生丛生芽外植体数
Explants number of producing
multiple shoots/个
丛生芽诱导率
Induction rate multiple
shoots/%
平均丛生芽数
Average number of
multiple shoots/个
生长情况
Growth condition




1.0
1.0
0.5
0.5
0.05
0.10
0.05
0.10
40
40
44
38
18
17
23
25
45.0±0.89c
42.5±2.35c
52.2±1.90b
68.8±3.03a
2.7±0.36b
2.6±0.44b
2.8±0.26b
3.9±0.62a
++

++
+++
3 结论与讨论
在山杏外植体灭菌筛选试验中,升汞的消毒时间设
置为3min最佳。另外取材季节以材料积累了较丰富的
营养和内源激素为佳,此时外植体抵抗病菌的能力强,一
般情况下,大多在材料休眠末期或萌动前期取材最为有
利[2]。在马琳等[3]的锯叶班克木的外植体消毒试验中可
知,夏季气温较高,各类菌的活跃程度较高,污染率也高。
该试验以春季4~5月份最佳,污染率极低。该试验的基
本培养基筛选设置了3个培养基,分别是 WPM、MS和改
良MS[C(NH4+)∶C(NO3-)=0.16]培养基。该试验结
果表明,最适培养基为改良MS培养基,在改良MS培养
基上外植体分化效果最好,而且生长健壮,这与齐高强[4]
的试验结果一致。在激素浓度筛选中,得到最利于外植体
诱导丛生芽和生长的激素浓度为1.0mg/L的6-BA和
0.05mg/L的NAA。茎尖是山杏的最适外植体,丛生芽
诱导效果比较好,而且丛生芽容易向高生长。这可能由
于不同外植体的内源激素水平不同所导致的。而且茎
尖相对于茎段和叶片来说可能未高度分化,组织代谢旺
盛,再生能力强。在继代培养中,筛选出的最适浓度配比
是0.5mg/L 6-BA、0.10mg/L NAA,该浓度下外植体的
丛生芽诱导率明显高于初代,而且生长较健壮。但一般情
况下继代培养中6-BA和NAA的浓度相对降低会有利于
组培苗的生长,这与该试验结果有所不同,这可能由于继
代培养的激素筛选要考虑外植体的继代次数和外植体的
激素积累等情况。在接下来的试验中,课题组将对继代培
养的激素配比筛选进行进一步的研究。
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Study on Tissue Culture Proportion Technology of Prunus sibirica
ZHENG Ke1,DONG Sheng-jun1,TIAN Ming-fang2,LIU Ming-guo1,WU Yue-liang1,AN Cheng-liang1
(1.Colege of Forestry,Shengyang Agricultural University,Shenyang,Liaoning 110866;2.Fuxin Mongolian Autonomous County Forestry
Science and Technology Demonstration Center,Fuxin,Liaoning 123000)
Abstract:The Prunus sibirica was used as material,the kind of basic medium,the kind of explants and the diferent
proportions of hormones impact the growth condition of explants in the various stages of tissue culture were studied.The
results showed that the best sterilization efect was used HgCl21g/L as disinfectants to disinfect 3min;the division and
growth condition of explants was better in improved MS[C(NH4+)∶C(NO3-)=0.16]medium;the most suitable
explants was shoot tips;the most suitable proportions of hormones was 6-BA 1.0mg/L and NAA 0.05mg/L in primary
culture;the most suitable proportions of hormones was 6-BA 0.5mg/L and NAA 0.1mg/L in subculture.
Key words:Prunus sibirica;tissue culture;proportion technology
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