全 文 ：第 48 卷 第 2 期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vol． 48 No． 2
2014 年 4 月 Journal of Henan Agricultural University Apr． 2014
收稿日期:2013 － 09 － 17
基金项目:国家自然科学基金项目 (31170351) ;河南省教育厅自然科学基金项目(2008A180012)
作者简介:王亚平，1990 年生，女，河南许昌人，硕士研究生，研究方向:植物资源方面的研究．
通讯作者:叶永忠，1957 生，男，湖北黄冈人，教授，博士生导师．
王红卫，1969 年生，男，河南平舆人，教授，硕士生导师．
文章编号:1000 － 2340(2014)02 － 0186 － 05
磁珠富集法构建播娘蒿 SSＲ文库及特性分析
王亚平1，焦振彬1，裴宋雨2，叶永忠1，王红卫2
(1．河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002;2．河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)
摘要:为构建播娘蒿 SSＲ文库，通过 Dynal磁珠富集法富集生物素标记的(AC)8，(AG)8 和(ATG)12探针与播娘
蒿基因组的酶切片段杂交的片段，捕获含有 SSＲ位点的 DNA序列，连接到 pMD 18 － T载体上，并转入感受态细
胞 DH 5α，共获得 778 个克隆．挑选阳性克隆，利用 SuperSNX 24 － F引物对菌液克隆进行 PCＲ检测．利用 M13F，
M13Ｒ载体引物和探针结合的方法对文库进行 2 次筛选，获得 93 个长度为 400 ～ 1 000 bp的克隆并测序．结果表
明，82 条序列含有 SSＲ位点，占测序条数的 88． 17% ．共有 SSＲ位点数 127 个．其中完全型 SSＲ位点 102 个，不完
全型 SSＲ位点 10 个，混合型 SSＲ位点 15 个，分别占 SSＲ 位点总数的 80． 31%，7． 87%，11． 81% ． SSＲ 重复基元
中，以二核苷酸(CT)n，(AC)n，(GT)n，三核苷酸(GAT)n 最为常见，得率分别为 20． 47%，26． 77%，21． 26%和
15． 75% ．
关键词:播娘蒿;磁珠富集法;SSＲ文库
中图分类号:Q948． 4 文献标志码:A
Construction and characterization of enriched SSＲ library
from Descuminia sophia with magnetic beads
WANG Ya-ping1，JIAO Zhen-bin1，PEI Song-Yu2，YE Yong-zhong1，WANG Hong-wei2
(1． College of Life Science，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China;
2． College of Plant Protection，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China )
Abstract:In order to construct enriched microsatellite library of Descuminia sophia，Dynal magnetic
beads were used to enrich biotin-labeled (AC)8，(AG)8 and (ATG)12 probes hybridized with genomic
fragments that have SSＲ of Descuminia sophia． The enriched DNA fragments were connected to pMD
18-T easy vector and then were transformed into competent DH 5α cell，778 clones were obtained． U-
sing SuperSNX 24-F primers to detect the positive clones and using the M13F，M13Ｒ vector primers
and probes for the second screening，93 clones containing 400 ～ 1 000 bp DNA fragments were sent to
sequencing． The results showed that 82 sequences contained SSＲ locus，accounting for 88． 17% of the
number of sequencing． In total，127 SSＲ locus were obtained，including 102 perfect type SSＲ locus，
10 imperfect type SSＲ locus and 15 mixed type SSＲ locus，accounting for 80． 31%，7． 87%，
11． 81%，respectively． Dinucleotide (CT)n，(AC)n，(GT)n，and trinucleotide (GAT)n were com-
mon，and the percentage was 20． 47%，26． 77%，21． 26% and 15． 75% respectively．
Key words:Descuminia sophia;magnetic beads enriched method;SSＲ library
DOI:10.16445/j.cnki.1000-2340.2014.02.014
第 2 期 王亚平等:磁珠富集法构建播娘蒿 SSＲ文库及特性分析 187
播娘蒿(Descuminia sophia (L．)Webb． ex
Prantl)为十字花科播娘蒿属 1 年生或 2 年生植物，
俗名米米蒿，分布于北美洲、亚洲、欧洲及南美洲，
在中国主要分布于华北、华东、西北和四川．其种子
具有止咳平喘、消肿利尿、抗癌的功效［1］，在调血
脂、抗菌等方面也具有显著的药理活性［2］． 以播娘
蒿种子为原料榨出的油可以作为食用油，含有约
37%的 α －亚麻酸，对人体的健康有重要作用［3］;
亦可作为工业用油，以播娘蒿籽油为原料制备出的
脂肪酸甲酯，经冷冻处理后表现出和生物柴油相近
的性质［4］．播娘蒿种子含油 33% ～ 44%［5］，无论是
作为工业用油还是食用油，都具有较大的开发利用
价值．因此系统开发和利用播娘蒿资源，能够很好
的平衡人类对油料的需求． 近年来，对播娘蒿的研
究多集中在化学成分与生物学特性的分析上［6 ～ 9］，
关于播娘蒿遗传资源的研究鲜有报道．研究播娘蒿
的遗传多样性，对今后播娘蒿野生资源的开发和利
用十分必要． 分子标记是研究植物资源的有效手
段，其中 SSＲ 标记具有共显性、重复性强、多态性
高、多态位点丰富等优点［10］，它比其它分子标记如
ＲFLP，ＲAPD，AFLP和 ISSＲ虽然成本高，但能较好
的运用于植物分类、群体遗传多样性研究和基因图
谱的构建．传统的 SSＲ 文库构建策略不仅复杂，而
且效率低，利用磁珠富集法构建 SSＲ 文库具有操
作简单、效率高等优点． 它的原理是用含有生物素
标记的探针如(CA)10与基因组 DNA 酶切片段含
SSＲ片段特异性杂交，而磁珠外边所包被的链霉素
亲和素可以和探针上的生物素共价结合，通过磁珠
的磁力直接将探针连同与之互补的含有 SSＲ 片段
吸附［11］．这种方法能显著缩短构建 SSＲ 文库的时
间，并且极大的提高了效率．本研究即是利用 Dynal
磁珠富集法构建播娘蒿 SSＲ 文库，研究播娘蒿的
遗传资源，为播娘蒿的资源研究和开发利用提供理
论依据．
1 材料与方法
1． 1 材料
播娘蒿材料是 2012 － 04 － 18 采自郑州北郊的
黄河湿地国家级自然保护区，沿直线每隔 50 m 取
样 1 次(共 20 份) ，采集的叶片加硅胶密封包装，
干燥处理 1 周后用于提取 DNA．干燥处理过程中，
如发现硅胶变红，立即更换硅胶．
1． 2 方法
1． 2． 1 酶切 本研究采用 Dynal磁珠富集法构建
播娘蒿 SSＲ 文库． 首先采用改良的 CTAB 法［12］提
取播娘蒿基因组 DNA，纯化后利用内切酶 Ｒsa I 于
16 ℃温度下酶切 16 h．
1． 2． 2 连接 获得的酶切产物经琼脂糖凝胶检测
后加上接头 SuperSNX 24 － F(5’－ GTTTAAGGC-
CTAGCTAGCAGAATC)和 SuperSNX24 － Ｒ(5’－
pGATTCTGCAGCTAGGCCTTAAAC AAAA)．对加接
头产物进行 PCＲ 扩增，反应体系 25 μL，为 10 ×
PCＲ缓冲液 2． 5 μL，10 μmol·L －1 SuperSNX24 － F
1． 3 μL，2 mmol·L －1 dNTP 1． 875 μL，双蒸水 18． 3
μL，5 U·μL －1 exTaq 0． 2 μL，加接头的 DNA 2
μL． PCＲ程序为 95 ℃预变性 2 min，随后为95 ℃变
性 20 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 90 s 的 24 次循
环，最后 15 ℃保持 10 min． PCＲ反应后进行琼脂糖
凝胶检测，检测成功后进行富集工作．
1． 2． 3 富集 利用含有生物素标记的(AC)8，
(AG)8 和(ATG)12(由上海生工合成)探针与连接产
物充分杂交，杂交后利用 Dynal 磁珠对杂交产物进
行富集．采用 PCＲ对富集 DNA片段进行扩增，反应
体系为 25 μL，10 × PCＲ缓冲液 2． 5 μL，1 000 mg·
μL BSA 0． 625 μL，10 μmol·L －1 SuperSNX24 － F
1． 3 μL，2 mmol·L －1 dNTP 1． 875 μL，双蒸水 16． 5
μL，5 U·μL －1 exTaq 0． 2 μL，富集 DNA 片段 2
μL． PCＲ程序为 95 ℃预变性 2 min，随后为95 ℃变
性 20 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 90 s 的 24 次循
环，72 ℃充分延伸 30 min 后于 15 ℃保持 10 min．
PCＲ反应后进行琼脂糖凝胶检测．
1． 2． 4 克隆及克隆筛选 将富集产物连接到
pMD18 － T上，转入 DH 5α 感受态细胞，在 LB 培
养基上进行克隆培养，挑选阳性克隆转入液体 LB
培养基进行培养．利用 SuperSNX 24 － F 引物对菌
液克隆进行 PCＲ 检测，反应体系 10 μL，包括 2 ×
PCＲ Taq Mix 5 μL，双蒸水 4 μL，10 μmol·L －1 Su-
perSNX24 － F 0． 5 μL，菌液 0． 5 μL． 反应程序为
94 ℃预变性 10 min，随后进入 30 次循环，包括 94
℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，最后
终延伸 10 min，15 ℃保持 10 min．选择插入片段长
度为 400 ～ 1 000 bp的克隆．
随后，采用 M13F，M13Ｒ 和(AC)8，(AG)8，
(ATG)5 探针相结合的方法对文库进行 2 次 PCＲ扩
增筛选，PCＲ体系 10． 5 μL，包括 2 × PCＲ Taq Mix 5
μL ，双蒸水 3 μL，10 μmol·L －1 M13Ｒ(F)0． 5 μL，
10 μmol·L －1(AC)8 0． 5μL，10 μmol·L
－1(AG)8
0． 5 μL，10 μmol·L －1(ATG)5 0． 5 μL．反应程序为
94 ℃充分变性 10 min，随后进入 30 次循环，包括
94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，最
188 河 南 农 业 大 学 学 报 第 48 卷
后终延伸10 min，15 ℃保持 10 min．对扩增出条带的
克隆送样测序(此工作由华大基因完成)．
1． 3 数据处理
WEBEＲ将 SSＲ分为 3 种类型［13］，完全型为核
心序列以不间断的重复方式构成 SSＲ;不完全型是
核心序列之间有几个非重复碱基，但其两端的核心
序列重复次数大于 3;混合型为 2 种或 2 种以上的
串联核心序列由几个连续的非重复碱基分隔开，但
各种连续性的核心序列重复次数不少于 5． 测序
后，统计 SSＲ 情况，柳属植物研究中，表现出多态
性的二核苷酸基元重复次数在 4 次以上［14］，本研
究统计二核苷酸基元重复次数在 4 次以上的;三核
苷酸及其以上基元统计重复次数在 3 次以上［15］，
计算完全型 SSＲ，不完全型 SSＲ 以及混合型 SSＲ
各自所占的比例，以及平均单个克隆含有的 SSＲ
位点数等．
2 结果与分析
2． 1 酶切结果
对纯化后的播娘蒿总基因组 DNA利用内切酶
Ｒsa I 进行酶切，酶切产物集中在 300 ～ 1 000 bp
(图 1) ，符合后续试验对 DNA片段长度的要求．
M． DL 2 000 Marker;1．酶切产物．
M． DL 2 000 Marker;1． Enzyme-digested fragments
图 1 播娘蒿基因组 DNA Ｒsa I酶切产物
Fig． 1 The result of enzyme digestion of Descuminia
sophia genomic DNA with ＲsaⅠ
2． 2 连接结果
以 SuperSNX24 － F 作为引物对连接产物进行
PCＲ扩增，取 2 μL 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳
检测(图 2)．连接结果很成功，可以直接用于下一
步富集．
2． 3 富集
生物素标记的探针与加接头的 DNA 片段杂
交，磁珠吸附后对富集片段进行 PCＲ扩增，为增加
富集产物浓度，做 3 管 PCＲ，富集结果如图 3，富集
片段集中于 500 ～ 800 bp，适用于构建 SSＲ文库．
M． DL 2 000 Marker;1．扩增产物．
M． DL 2 000 Marker;1． PCＲ products．
图 2 连接产物检测结果
Fig． 2 PCＲ products of ligated DNA
M． DL 2 000 Marker;1 ～ 3 扩增产物．
M． DL 2 000 Marker;1 to 3 PCＲ products．
图 3 富集产物 PCＲ结果
Fig． 3 PCＲ products of microsatellite-enriched DNA
2． 4 克隆筛选
将 3 管 PCＲ 合并纯化，与 PMD18 － T 载体连
接后转入感受态细胞在 LB 培养基上培养，共挑选
774 个阳性克隆至液体 LB 培养基，培养后进行菌
液 PCＲ扩增检测，检测结果如图 4． 为避免盲目测
序，对有条带的菌液用 M13Ｒ(F)通用引物和
(AC)8，(AG)8，(ATG)5 探针相结合进行 2 次筛
选，选取含有理想条带的克隆进行测序．
2． 5 播娘蒿 SSＲ统计
筛选获得 93 条插入片段为 400 ～ 1 000 bp 的
克隆测序．经测序，82 条序列含有 SSＲ 位点，占测
序总条数的 88． 17% ． 共有 SSＲ 位点数 127 个，完
全型 SSＲ位点数目 102 个，不完全型 SSＲ 位点数
目 10 个，混合型 SSＲ位点 15 个． SSＲ重复单元(表
1)中，以二核苷酸(TC /CT) ，(AC /CA) ，(TG /GT)
和三核苷酸(TGA /GAT /ATG)最为常见，得率分别
第 2 期 王亚平等:磁珠富集法构建播娘蒿 SSＲ文库及特性分析 189
为 20． 47%，26． 77%，21． 26%和 15． 75% ．
M． DL 2 000 Marker;1 ～ 14．有插入片段克隆的
PCＲ扩增产物．
M． DL 2 000 Marker;1 to 14． PCＲ products
of clones with insert fragments．
图 4 菌液 PCＲ检测结果
Fig． 4 PCＲ amplification of clones
表 1 播娘蒿微卫星富集文库基元类型及比例
Table 1 Characteristics of the enriched library of
Descuminia sophia in terms of the identified
microsatellite sequences
项目
Item
SSＲ基元类型
Ｒepetition primitive
数目 /个
Number
得率 /%
Sequence
二核苷酸基元
Dinucleotide primitive
AT /TA
AC /CA
13
34
69． 68
AG /GA 8
TG /GT 27
TC /CT 26
三核苷酸基元
Three nucleotides primitive
TGT
GGA
1
1
28． 39
GGA 1
CAC 1
TGA 20
AGA 4
CCT 1
CAT 15
GAC 1
四核苷酸基元
Four nucleotides primitive
ACAT 1 0． 65
六核苷酸基元
Six nucleotide primitive
TGAGGA
GATGAC
1
1
1． 29
本研究采用磁珠富集法构建播娘蒿 SSＲ 文
库，该方法中探针与不含 SSＲ 位点的片段存在一
定程度的结合，为减少测序的盲目性，使用 M13Ｒ
载体通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5 探针相结
合进行 2 次筛选，共测序 93 条，含有 SSＲ位点的序
列就有 82 条，占测序总条数的 88． 17% ．
播娘蒿 SSＲ文库中出现了 16 种重复基元，以
二核苷酸 AC /CA，TG /GT，TC /CT 和三核苷酸
TGA /GAT /ATG出现次数最多，分别为 34，27，26
和 20 次，占 SSＲ 位点总数的 20． 47%，26． 77%，
21． 26%和 15． 75%，其它重复基元出现次数较少．
本研究使用的生物素探针为(AC)8，(AG)8 和
(ATG)12，研究结果中 SSＲ基元多以与这些探针互
补配对为主．如果增加更多类型的探针，估计会得
到更多类型的 SSＲ 基元．文库中，二核苷酸基元最
多重复 35 次，三核苷酸单元最多重复 26 次，四核
苷酸基元最多重复 4 次，六核苷酸基元最多重复
4 次．
播娘蒿 SSＲ位点中，重复次数在 4 ～ 35 次(表
2) ，重复次数在 4 ～ 10 次的有 80 个，占 SSＲ 位点
总数的 62． 99%;重复次数在 11 ～ 20 次的有 31 个，
占 SSＲ位点总数的 24． 41%;重复次数在 20 次以
上的有 16 个，占 SSＲ位点总数的 12． 60% ．
表 2 SSＲ重复次数分布
Table 2 SSＲ repetition number distribution
SSＲ重复次数 /次
SSＲ repetition number
SSＲ位点数目 /个
SSＲ locus number
比例 /%
Percentage
4 ～ 10 80 62． 99
11 ～ 20 31 24． 41
20 次以上 16 12． 60
播娘蒿 SSＲ位点中，重复长度在 8 ～ 95 bp(表
3) ，重复长度在 8 ～ 20 bp 的有 65 个，占 SSＲ 位点
数的 51． 18%;重复长度在 20 ～ 40 bp 的有 40 个，
占 SSＲ位点数的 31． 50%;重复长度大于 40 bp 的
有 22 个，占 SSＲ位点数的 17． 32% ．
表 3 SSＲ重复长度分布
Table 3 SSＲ repeatitiion length distribution
SSＲ重复长度 /bp
SSＲ repetition lenth
SSＲ位点数目 /个
SSＲ locus number
比例 /%
Percentage
8 ～ 20 65 51． 18
20 ～ 40 40 31． 50
＞ 40 22 17． 32
3 讨论
播娘蒿 SSＲ重复基元以二核苷酸重复基元最
多，占 SSＲ 位点总数的 69% ． 在莲属植物的研究
中，设计的 11 对 SSＲ 引物全部来自于二核苷酸重
复的基因序列［16］;谷子的研究中，分析多态性的
22 对引物中有 20 对引物的 SSＲ 为二核苷酸重
复［17］;用于分析银杏遗传多样性的 11 对引物其
SSＲ全部为二核苷酸重复［18］． 这说明用二核苷酸
重复基元的 DNA 片段设计引物，较容易检测多态
性．本研究获得的播娘蒿 SSＲ 文库中，二核苷酸重
复的位点占 69． 68%，满足开发 SSＲ标记的需要．
杜仲 20 个能检测到多态性的 SSＲ 分子标记
中，其二核苷酸 SSＲ 重复次数在 9 ～ 16 次，三核苷
酸 SSＲ重复次数在 7 ～ 12 次［19］;兰属植物遗传多
190 河 南 农 业 大 学 学 报 第 48 卷
样性研究中，表现出多态性的 14 对 SSＲ 引物中，
二核苷酸 SSＲ重复次数在 9 ～ 32 次，三核苷酸 SSＲ
重复次数在 4 ～ 12 次［20］;中国红枣的研究中，表现
出多态性的 25 对 SSＲ 引物，全部为二核苷酸基元
重复，重复次数在 6 ～ 15 次［21］．而播娘蒿的二核苷
酸基元重复次数分布在 4 ～ 35 之间，三核苷酸基元
重复次数分布在 4 ～ 26，大部分克隆含有潜在多态
SSＲ 位点，可进行下一步开发 SSＲ 位点引物的
工作．
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(责任编辑:朱秀英)