全 文 ：　理化检验-化学分册　　　　　PTCA(PART B:CHEM.ANAL .)　　　2008年　第 44卷　4
工作简报
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法
分析漏芦多糖中单糖组成
李发胜 , 徐恒瑰 , 李明阳 , 刘　辉
(大连医科大学 检验医学院 , 大连 116044)
摘　要:采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PA D),建立了一种测定漏芦多糖
中单糖组成的方法。水提 、醇沉法提取粗多糖 ,Sevage法除蛋白 ,用2 mo l·L-1硫酸在 100 ℃水解
多糖 ,以 CarboPac PA10色谱柱(2 mm×250 mm)为分离柱 ,100 mmol·L-1氢氧化钠溶液为淋洗
液 ,流速为 1.0 mL ·min-1 ,脉冲安培检测 ,总分析时间为 6 min 。测定漏芦多糖中单糖组成为阿
拉伯糖 、葡萄糖和果糖 ,其摩尔比为 1.55∶1.00∶2.10;加标回收率为 93.0%～ 107.8%,检出限为
2.8 ～ 12.3 μg ·L-1 。
关键词:高效阴离子交换色谱;脉冲安培检测;多糖;单糖;漏芦
中图分类号:O657.7　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4020(2008)04-0342-03
Determination of Monosaccharides in Polysaccharides of Rhaponticum
Uni forum by High-performance Anion Exchange Chromatography
with Amperometric Detection
LI Fa-sheng , XU Heng-gui , LI Ming-yang , LIU Hui
(College o f Med ical Testing , Dalian Med ical University , Dalian 116044 , China)
Abstract:High perfo rmance anion-exchange chromatog raphy with pulse-ampe romet ric detection (H PAEC-
PAD) w as applied to the determination of mono saccharides in polysaccha ride of Rhaponticum uni f orum.
Poly saccha ride was sepa rated from the sample by refluxing-extr action with C2H5OH-H 2O (80 +20) fo r 3 h to
defat.Af te r vo latilization o f ethano l , the drug re sidue was extr acted tw ice w ith boiling w ater , maintaining 1 h for
each ex traction.Ethano l(95%)w as added to the w ate r e xt ract in a volume of 200 mL to make content of ethanol in
the so lution achieved to 4/ 5 of its to tal v olume.Polysaccha rides in the e thanol solution we re precipita ted overnight
at 4 ℃.Pro tein in the crude po ly saccharide was removed by the Sevage me thod.One mg of the poly saccharide w as
hydrolyzed fo r 4 h at 100 ℃ in 2 mo l· L-1 H2 SO4 , and then sepa rated on the CarboPac PA10 chromatog raphic
co lumn.100 mmo l· L-1 NaOH solution w as used as eluant passing through the colum n at a flow-r ate o f 1.0 mL·
min-1 .Monosaccharides in the elua te w ere determined by PAD.Six min w ere taken for the w ho le analy sis.It w as
found that arabinnose , g lucose and f ructose in the mo le ra tio of 1.55 to 1.00 to 2.10 w ere the 3 mono saccharides in
po ly saccharide of Rhaponticum uni f orum.Detection limits found w ere in the r ange f rom 2.8μg · L-1 to 12.3μg·
L-1 , and recoverie s found by standard addition were in the range of 93.0%-107.8%
Keywords: High per formance anion exchange chromatog raphy; Pulse ampe romet ric detection;
Poly saccha ride;Monosaccharide;Rhaponticum uni forum
收稿日期:2007-07-13
基金项目:辽宁省教育厅科研基金项目(202200953)
作者简介:李发胜(1967-), 男 ,湖南桃源人 ,副教授 ,硕士 ,主
　要研究方向为中药有效成分的分析。
漏芦为菊科植物的干燥根 ,始载于《神农本草
经》 ,列为上品 。味苦 、咸 、性寒 、入胃 、大肠经。具有
清热解毒 、消痈排脓 、通乳的功效 。药理研究表明 ,
漏芦提取液具有益智[ 1] 、抗炎 、镇痛 、耐缺氧及抗疲
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　理化检验-化学分册 李发胜等:高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法分析漏芦多糖中单糖组成
劳作用[ 2] 。对漏芦免疫调节的有效成分研究表明 ,
漏芦多糖有很好的免疫调节作用[ 3] ,有望发展为免
疫增强剂 。而多糖的质量控制是多糖类药物研发中
急需发展的技术。其中 ,多糖中单糖组成测定是多
糖质控的主要指标 。目前报道的方法主要有:化学
分析法 、气相色谱法 、液相色谱法和毛细管电泳法
等 ,这些分析方法需要进行复杂的衍生化处理 ,或存
在灵敏度不高 、分离效果差等问题[ 4] 。
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-
PAD)法是近年发展的分析糖类的方法[ 5] ,这种方
法不需要对样品衍生化处理即可直接分析单糖 ,操
作方便 、灵敏度高 、不使用有毒化学试剂 ,对糖类的
检出限可以达到 pmol数量级[ 6] 。
本试验采用 CarboPac PA10色谱柱为分离柱 ,
氢氧化钠溶液为淋洗液 ,脉冲安培三电位波形检测
糖类 ,在 6 min内快速测定漏芦多糖水解液中 3 种
单糖 ,确定了漏芦多糖中单糖组分 。
1　试验部分
1.1　主要仪器与试剂
高效液相色谱系统采用安培脉冲检测系统 ,包
括 582型泵 、542型自动进样器 、Coulochem Ⅱ安培
脉冲检测器及 CoulAarry for w indow s 色谱工作
站;CarboPac PA10色谱柱(2 mm ×250 mm)。
试剂均为分析纯 ,水为纯化水 。
1.2　色谱条件
流动相为 100 mmol ·L-1氢氧化钠溶液 ,流量
为 1.0 mL·min-1 ;进样量 10 μL ;柱温 30 ℃。扫
描电位用三电位波形 ,工作电位为 200 mV ,正清洗
电位为 700 mV ,负清洗为-900 mV;间隔时间 t1
为 300 ms , t2 为 100 ms , t3 为 100 ms。
1.3　单糖标准品溶液的配制
分别称取 105 ℃干燥至恒重的阿拉伯糖 、葡萄
糖 、果糖 10.0 mg 于 250 mL 容量瓶中 ,加水至刻
度 ,得到各单糖的质量浓度为 40 mg ·L-1的标准储
备液 。分别取标准储备液 0 , 10 , 20 ,30 , 40 , 50 ,60 ,
80μL 于10 mL 容量瓶中 ,用水定容 ,得到单糖的系
列标准溶液。
1.4　漏芦多糖提取及纯化
称取已干燥的漏芦 250 g ,加入适量 80%的乙
醇过夜 ,回流提取 3 h脱脂 ,药渣挥尽乙醇后 ,沸水
提取 2次 ,每次 2 h ,合并提取液 ,浓缩至200 mL ,加
95%的乙醇使醇含量达到 80%(比重计测量), 于
4 ℃冰箱中醇沉过夜 ,抽滤 ,滤渣依次用无水乙醇 、
丙酮洗涤 , 得到粗多糖。将粗多糖溶于水 , 用
Sevage法除蛋白 ,反复进行至无蛋白 ,流水透析后 ,
蒸发浓缩至 200 mL ,加 80%的乙醇使醇含量达到
80%(比重计测量),于 4 ℃冰箱中醇沉过夜 ,抽滤 ,
滤渣依次用无水乙醇 、丙酮洗涤 ,真空干燥 ,即得漏
芦多糖 ,提取率为 5.6%。
1.5　多糖水解样品的制备
称取漏芦多糖1.0 mg ,加入 2 mo l·L-1硫酸溶
液 2 mL ,封管 100 ℃恒温水解 4 h ,冷却后用氢氧化
钡溶液中和过量的硫酸 , 放置过夜 ,以 3 000 r ·
min-1速度离心 5 min ,用水稀至 3.0 mL ,得漏芦多
糖水解样品溶液。
2　结果与讨论
2.1　分离条件的优化
2.1.1　淋洗条件的优化
糖类化合物是弱酸(pK a>11),用强碱为淋洗
液可使糖类化合物离子化 ,以阴离子的形式存在。
可以在阴离子交换柱上被保留并得到分离 , 使用
CarboPac PA10色谱柱 。调节淋洗液氢氧化钠的浓
度分别为40 ,60 , 80 ,100 ,120 ,140 ,160 mmol·L-1 ,
对含有阿拉伯糖 、葡萄糖 、果糖的混合标准溶液进行
分析 。试验结果表明:氢氧化钠溶液浓度在
80 ～ 120 mmol·L-1之间时 ,可获得较好的分离效
果。选用 100 mmol· L-1氢氧化钠溶液作为淋
洗液 。
2.1.2　色谱柱温度的优化
以 100 mmol·L-1氢氧化钠溶液作为流动相 ,
改变柱温 ,考察柱温对单糖混合标准溶液分离的影
响。当柱温高于 40 ℃时 ,葡萄糖和果糖的分离较
差;柱温低于 25 ℃时 ,各色谱峰的峰宽变大 ,在25 ～
30 ℃时 ,峰形较好 ,单糖组分被分离。选择柱温为
30 ℃。
2.2　方法的线性范围与检出限
在优化的分离条件下 ,测定 3 种单糖的线性范
围为 0.2 ～ 40 mg ·L-1 。以信噪比为 3时的试样浓
度作为检测浓度 ,各单糖的检出限分别为 2.8 ,7.9 ,
12.3 μg · L-1 。将 3种单糖标准溶液平行测定 7
次 ,阿拉伯糖 、葡萄糖和果糖的相对标准偏差分别为
1.21%, 0.56%,1.57%。
2.3　样品的测定
对漏芦多糖水解样品溶液经 0.4 μm 微孔滤膜
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　理化检验-化学分册 李发胜等:高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法分析漏芦多糖中单糖组成
过滤后 ,进样 10 μL ,进行色谱分析。结果表明:漏
芦多糖样品中含有阿拉伯糖 、葡萄糖和果糖 ,摩尔
比为 1.55∶1.00∶2.10。3种糖类对照品和漏芦多
糖水解样品溶液的色谱图见图 1 。
2.4　精密度和加标回收率
称取漏芦多糖 1.0 mg 7 份 , 水解处理后 , 用
0.45 μm微孔滤膜过滤 ,进样 10 μL 进行分析 。测
得相对标准偏差(n=7)为 1.08%～ 4.95%。
称取漏芦多糖 1.0 mg 3份 ,分别加入适量阿拉
伯糖 、葡萄糖 、果糖标准品 ,水解处理后 ,用 0.45 μm
微孔滤膜过滤 ,进样 10 μL 进行分析 ,回收率结果见
表 1。
1.阿拉伯糖(Arabinnos e)　2.葡萄糖(Glu cose)
3.果糖(Fructose)
图 1　3种糖类对照品(a)和漏芦多糖水解样品溶液(b)色谱图
Fig.1　Chromatograms of three reference saccharides(a)and
hydrolyzed polysaccharide in Rhaponticum uni forum sample(b)
表 1　试样中单糖的加标回收率
Tab.1　Recoveries of monosaccharides in sample found by standard addition method
单糖名称
Name of
monosaccharide
测定值
Am′t of
monosacharide
fou nd
ρ/(mg· L-1)
标准加入量
Am′t of std.
added
　　　　　　ρ/(mg· L -1)
测得总量
Total am′t
f ound
回收率
Recovery
/%
单糖名称
Name of
　m onosaccharide
测定值
Am′t of
monosacharide
found
ρ/(mg· L -1)
标准加入量
Am′t of std.
added
　　　　　　ρ/(mg· L-1)
测得总量
Total am′t
f ound
回收率
Recovery
/ %
阿拉伯糖 2.71 1.00 3.78 107.0 葡萄糖 2.33 4.00 6.37 101.0
2.00 4.60 94.5 果糖 4.42 1.00 5.35 93.0
4.00 6.88 104.3 2.00 6.45 101.5
葡萄糖 2.33 1.00 3.29 96.0 4.00 8.73 107.8
2.00 4.43 105.0
参考文献:
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作用的实验研究[ J] .沈阳药科大学学报 , 2003 , 20
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[ 3] 　李发胜 ,杨 光 ,咸 丰 , 等.漏芦多糖对小鼠激发态免疫
功能的影响及其可能机制[ J] .中国中药杂志 , 2007 ,
32(5):433-435.
[ 4] 　王 静 ,王 晴 ,向文胜.色谱法在糖类化合物分析中的应
用[ J] .分析化学 , 2001 , 29(2):222-227.
[ 5] 　Yaqi Cai , Jing sheng Liu , Ya li Shi , et a l.Determina-
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[ 6] 　梁立娜 , 张 萍 ,蔡亚岐 , 等.高效阴离子交换-脉冲安培
检测同时分析单糖和糖醛酸[ J] .分析化学 , 2006 , 34
(10):1371-1374.
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