全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测
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2013年 第38卷 第11期
收稿日期：2013-05-27
基金项目：河南省重点学科建设项目(10466-X-082301)。
作者简介：高向阳(1949 —)，男，教授，主要从事食品分析、食品新资源开发研究的工作。
高向阳1,2，孔欣欣1，韩帅2
(1.郑州科技学院食品科学系，郑州 450064；
2.河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002)
摘要：建立了高效阴离子交换色谱法同时测定贼小豆中9种糖类化合物含量的分析方法。用
CarboPacTM PA10阴离子交换分离柱和脉冲安培检测器，以0.25 mol/L氢氧化钠和水等度洗脱，
流速0.80 mL/min，柱温30 ℃。结果表明：25 min内能完成9种糖的分离，在0.05~25.0 mg/L
范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.9993，检出限为0.05~1.20 μg/L，加标回收率为
91.66%~103.2%，相对标准偏差RSD小于2.3%(n=6)。方法灵敏度高，前处理简单快速、选择性
好、无需衍生，用于郑州地区野生贼小豆中糖类化合物的快速检测，结果较满意。
关键词：高效阴离子交换色谱法；脉冲安培检测；糖类化合物；贼小豆
中图分类号：S 529 文献标识码：A 文章编号：1005-9989(2013)11-0284-06
Analyze carbohydrate compounds in Vigna minima (Roxb.) with
high performance anion-exchange chromatography using pulsed
amperometric detection
GAO Xiang-yang1,2，KONG Xin-xin1，HAN Shuai2
(1.Department of Food Science , Zhengzhou Institute of Science and Technology,
Zhengzhou 450064; 2.College of Food Science and Technology,
Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)
Abstract: A chromatographic method was developed for the simultaneous determination of 9
高效阴离子交换色谱—脉冲安培
检测法分析贼小豆中的糖类化合物
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2013年 第38卷 第11期
贼小豆[Vigna minima(Roxb.) Ohwi et Ohashi]
为豇豆属(Vigna)，菜豆族(Trib.Phaseolease)，
豆科 ( F a b a c e a e )，豆目 ( F a b a l e s )，木兰纲
(Magnoliopsida)，被子植物门(Angiospermae)，一年
生缠绕野生草本。常生长于草丛或林中，国内外
分布较为广泛[1-3]。糖类是重要的有机营养物质，
具有生理活性作用，对食品的加工品质有较大影
响。贼小豆中糖类的组成、含量水平目前尚未见
文献报道，因此，建立准确测定贼小豆中糖类的
分离分析方法，了解野生贼小豆的糖类状况，对
进一步科学开发利用野生贼小豆资源、评价其营
养特性等均具有重要的现实意义。
目前，测定食品中糖类的比色法[4-5]、近红
外光谱法[6-7]和流动注射法[8]等方法只能分析总
糖量，不能分离和定量单一组分，且干扰多，
选择性较差。对基体组成较复杂的样品，常用
的分离分析方法是气相色谱法[9-10]、高效液相色
谱法[11-13]和毛细管电泳法[14-15]等，但这些方法需
要进行衍生化处理，操作复杂，灵敏度较低，选
择性较差。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法
(High performance anion-Exchange chromatography-
pulsed amperometric detection ，HPAEC-PAD)可直
接分离分析糖类化合物，具有检测限低、线性范
围宽、重现性好、操作简单、无需衍生的特点，
已经得到应用[16-18]。本文利用超声波技术浸提，
用膜过滤法处理样品，HPAEC-PAD法同时测定
了郑州地区野生贼小豆中的糖类化合物，简便快
捷、准确可靠，为分析贼小豆等食品中糖类的组
成和含量提供了科学方法，为进一步合理利用和
开发野生贼小豆资源提供了参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
贼小豆：2010年至2012年秋季采集于郑州市
龙子湖高校园区同一位置(113:42E；34:44N)，经
河南农业大学生命学院朱长山教授鉴定为贼小豆
果实，测定时分别取完整、饱满籽粒依次用蒸馏
水、超纯水淋洗后于60 ℃烘箱中烘至恒质量，经
植物粉碎机粉碎过60目筛，存于磨口瓶，于干燥
器中密闭保存。
纯度大于99.9%的蕈糖Mushroom sugar、鼠李
糖rhamnose：Alfa Aesar公司；分析纯乳糖lactose：
上海山浦化工有限公司；纯度大于99.9%的棉籽糖
raffinose、阿拉伯糖arabinose：美国Sigma-Aldrich
公司；纯度大于99.5%的D-无水葡萄糖glucose、
D-果糖fructose、蔗糖sucrose、麦芽糖maltose：中
国药品生物制品检定所；纯度大于99.9%的叠氮化
钠：美国 Sigma-Aldrich 公司。
试验用水为超纯水，电阻率大于18.3 MΩ ·cm。
1.2 主要仪器与设备
ICS-3000离子色谱仪及在线脱气装置的四元
梯度泵、自动进样器(配有25 μL定量环)、ED3000
电化学检测器、Chromeleon 6.80色谱工作站：美
国DIONEX公司；Milli-Q Advantage A10型超纯水
设备：美国Millipore公司；VIC-412 型Sartorius电
子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；SB-
5200DTS型超声波清洗器：宁波新芝生物科技股
份有限公司。
kinds carbohydrate compounds in Vigna minima(Roxb.) using high performance anion-exchange
chromatography coupled with pulsed amperometric detection(HPAEC-PAD). The analyzes were separated
on CarboPacTM PA10 anion exchange separation column using 0.25 mol/L NaOH solution and water as
mobile phase in the isocratic elution at fl ow rate of 0.80 mL/min and detected with column temperature
30 ℃. The results showed that: nine carbohydrate compounds can be separated well within 25 min．
Linearity ranges for all the 9 kinds carbohydrate compounds were 0.05~25.0 mg/L with a correlation
coeffi cient exceeding 0.9993. Under the optimum conditions, the limits detection (3S/N) were 0.05~1.2 μg/
L (25 μL injection, and the quantitative analysis was based on the peak areas) respectively. Moreover，the
standard addition recoveries were 91.66%~103.2%, and the relative standard deviations(RSD) less than
2.3%(n=6). This method is simple, rapid, high sensitive, and has good selectivity, and needn’t derivation in
the process of determination. It is quite suitable for the determination of carbohydrate compounds in Vigna
minima(Roxb.) in Zhengzhou area with satisfying results.
Key words: high performance anion exchange chromatography (HPAEC); pulsed amperometric detection
(PAD); carbohydrate compounds; Vigna minima(Roxb.)
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1.3 试验方法
1.3.1 基本原理 中性糖类是pKa为12~14的弱酸，
电离度小，在高pH值淋洗液中会部分或全部以糖
阴离子形态存在，可与阴离子交换柱上的OH-发
生交换，交换作用与OH-的浓度有关，不同糖分
子组分对OH-浓度的敏感性有差异，洗脱出柱到
达金电极脉冲安培检测器和产生测定信号的时间
不同，以此进行分离分析。
1.3.2 标准溶液的配制 准确称取1.1节中9种糖各
0.1 g(准至0.0001 g)分别加水溶解，移至100 mL容
量瓶中定容，得到1 mg/mL标准储备液，于4 ℃冰
箱中贮存备用。分别移取10.00 mL各标准储备液
至100 mL容量瓶中定容，得到100 μg/mL的标准混
合液。吸取0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、
16.00、25.00 mL 上述标准混合液于100 mL容量瓶
中，以超纯水定容，得到各种糖的系列标准混合
工作溶液。
1.3.3 样品制备 称取过60目筛的样品0.1 g(准至
0.0001 g)于150 mL磨口三角瓶中，分2次加入50.00
mL水，盖上塞子，用磁力搅拌器中速搅拌均匀
后，室温下以250 W功率超声20 min，用定性滤纸
过滤，弃去几毫升初滤液，取后清滤液用水稀释
50倍，过0.22 μm尼龙滤膜后上机分析。
1.3 .4 色谱条件及淋洗液的配制 色谱柱：
CarboPacTM PA10阴离子交换分析柱(4 mm×250
mm)和保护柱(4 mm×50 mm)；淋洗液：水(A)+
0.25 mol/L NaOH溶液(B)=80+20；柱温和检测池
温度30 ℃；进样量25 μL；流速0.80 mL/min；
ED3000脉冲安培检测器，糖标准四电位波形
[Carbohydrates (standard quad)]。
0.25 mol/L NaOH淋洗液：取经0.22 μm尼龙
滤膜过滤的超纯水987 mL于2 L塑料瓶中，加50
g/100 mL NaOH溶液的上清液13.10 mL，混匀后施
加大约34~55 kPa(5~8 psi)的氮气加以保护。
2 结果与分析
2.1 提取剂的选择
用80%乙醇提取糖类化合物的过程较复杂，
且能溶解贼小豆中的色素物质，使色谱图产生明
显干扰峰，降低测定灵敏度。试验结果显示：用
水提取糖类时未检出其他干扰峰，分离效果比较
理想。
2.2 料液比的确定
试验结果表明：称样量为0.1000 g加入50 mL
水，按1.3.3和1.3.4条件测定时，样品信号值及分
离效果较佳。减少水用量，糖类提取不完全；加
大水用量，提取液中糖类浓度降低，色谱峰面积
减少。试验确定用50 mL水提取，料液比为1:500。
2.3 超声提取时间
按1.3.3和1.3.4条件处理和测定，其他条件不
变，分别对同一样品超声提取15、20、25、30、
35、40 min后测定。试验结果显示：超声提取30
min时，各糖组分均有较好的提取效果。
2.4 色谱条件选择
2.4.1 色谱柱与流速的选择 CarboPacTM PA10分离
柱内填有薄膜阴离子交换树脂，主要用于单糖、
双糖及低聚糖的分离[16]，故选CarboPacTM PA10为色
谱分析柱。试验表明，流动相的流速为0.80 mL/min
时，分离效果理想。
2.4.2 淋洗液的选择 通过对氢氧化钠淋洗液浓度
的优化试验表明，淋洗液为水(A)+0.25 mol/L NaOH
溶液(B)，体积比为80+20时，用等度洗脱各色谱峰
可得到理想的分离效果。
2.4.3 柱温的选择 在其他色谱条件和试验条件不
变时，分别考察了20、25、30、35、40 ℃下9种糖
的分离情况。结果显示：30 ℃时可保持较高柱效
及分离度，并降低了系统压力，使检测器响应稳
定，故选择30 ℃作为柱温。
2.5 检测电位的选择
试验结果显示：四电位得到的色谱图基线平
稳且分离度好。故采用DIONEX公司推荐的糖标准
四电位脉冲安培检测波形，以降低电化学腐蚀和
金电极表面凹陷现象，保证检测的高灵敏度和稳
定性。
2.6 标准曲线和检出限
混合糖标准工作液在0.05~25.0 mg/L范围
内，按“1.3.4”节色谱条件测定。用保留时间定
性，用峰面积外标法进行线性回归。按3倍信噪
比(S/N=3)计算检出限，按10倍信噪比(S/N=10)计算
定量限，结果如表1所示。
由表1可知，9种糖类化合物标准曲线的线
性关系良好，相关系数r大于0.9993，检出限为
0.05~1.20 μg/L，定量限为0.17~3.96 μg/L。
2.7 精密度
取贼小豆粉末各6份，按“1.3.3”节方法制备
样品溶液，在“1.3.4”色谱条件下测定，测得9种
糖含量的RSD均小于2.3%(n=6)。
2.8 试液稳定性
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表1 线性方程、相关系数、线性范围和检出限
糖类 线性回归方程 相关系数r 检出限/(μg/L) 定量限/(μg/L) 浓度范围/(mg/L)
蕈糖 y=3.1280x + 0.6048 0.9993 0.20 0.67 0.05~25.0
鼠李糖 y=3.1682x +0.3671 0.9995 0.10 0.33 0.05~25.0
阿拉伯糖 y=4.1443x + 0.4847 0.9995 0.40 1.33 0.05~25.0
葡萄糖 y=4.1130x-0.1954 0.9998 0.05 0.17 0.05~25.0
果糖 y=3.7049x-0.6602 0.9997 0.30 0.99 0.05~25.0
蔗糖 y=3.3242x+ 0.6889 0.9994 0.90 2.97 0.05~25.0
乳糖 y=3.600x+ 0.2737 0.9996 1.20 3.96 0.05~25.0
棉籽糖 y=0.80605x+ 0.3837 0.9996 0.80 2.67 0.05~25.0
麦芽糖 y=1.5353x-0.1791 0.9997 1.10 3.66 0.05~25.0
称取贼小豆粉末0.1000 g，按“1.3.3”节制备
样品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h各进
行5次平行测定，测得9种糖峰面积的RSD均小于
2.1%，试液在12 h内基本稳定。
2.9 干扰
选择F-、CH3COO-、HCOO-、NO2-、Cl-、
Br-、NO3-、SO42-、 PO43-等常见阴离子及酒石酸、
柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、顺丁烯二酸等有机酸
进行干扰试验。结果表明，上述物质在试验条件
下均不干扰样品中糖类的分离分析。
2.10 加标回收率
精确称取同一贼小豆样品6份，3份加标，分
别加入2.00、4.0、8.0 μg/mL的混合标准溶液，另
3份不加标，按“1.3.3”节处理后进行加标回收率
试验，同时在各添加水平进行3次平行测定，检验
无可疑值后，取平均值报告，结果如表2所示。
由表2可知，样品加标回收率在91.66%~
103.2%之间。
2.11 样品测定结果
在选定色谱条件下，用“1.3.3”节方法样
品处理，取糖标准混合工作溶液及样品溶液各25
μL进样测定，按外标法定量。各样品平行测定6
次。糖的标准色谱图及样品色谱图见图1和图2，
样品测定结果如表3所示。
由图1、图2和表3可知：郑州地区野生贼小豆
含有葡萄糖、果糖、蔗糖、棉籽糖和麦芽糖5种糖
类化合物，其中，蔗糖、葡萄糖和果糖含量相对
较高。棉籽糖，也被称为蜜三糖、蜜里三糖等，
是由半乳糖、果糖和葡萄糖3个单糖缩合成的非还
原糖，能促进双岐杆菌增殖，具有整肠、改善消
化、促进人体对钙的吸收及提高机体免疫力等多
种功能，被广泛应用于食品、医药领域[19]，有棉
籽糖是贼小豆含糖类物质的明显特征。
3 结论
采用CarboPacTM PA10阴离子交换分离柱和脉
表 2 回收率试验结果
糖类 样品测定值/(μg/mL)
加标量/
(μg/mL)
加标后测定
值/(μg/mL) 回收率/%
蕈糖 0.0
2.000 1.984 99.20
4.000 3.942 98.55
8.000 7.869 98.36
鼠李糖 0.0
2.000 2.065 103.2
4.000 3.871 96.78
8.000 8.048 100.6
阿拉伯糖
葡萄糖
0.0
0.883
2.000 1.893 94.65
4.000 3.860 96.50
8.000 7.991 99.89
2.000 2.912 101.4
4.000 4.965 102.0
8.000 8.811 99.10
果糖 0.621
2.000 2.592 98.55
4.000 4.520 97.48
8.000 7.954 91.66
糖类 样品测定值/(μg/mL)
加标量/
(μg/mL)
加标后测定
值/(μg/mL) 回收率/%
蔗糖 1.290
2.000 3.305 100.8
4.000 5.296 100.2
8.000 9.300 100.1
乳糖
0.0
2.000 1.995 99.75
4.000 3.899 97.48
8.000 7.958 99.48
棉籽糖 0.290
2.000 2.287 99.85
4.000 4.282 99.80
8.000 8.199 98.86
麦芽糖 0.435
2.000 2.381 97.30
4.000 4.366 98.28
8.000 8.428 99.91
续表
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冲安培检测器，以氢氧化钠和水等梯度洗脱，流
速0.80 mL/min，进样体积25 μL，建立了高效阴
离子交换色谱法同时测定贼小豆中9种糖类化合
物含量的分析方法。以水超声浸提及膜过滤法处
理贼小豆样品，方法简单、成本低、无污染、选
择性好，用于郑州地区野生贼小豆中糖类化合物
的快速检测，得到了较好的分离效果。贼小豆中
的糖类含量与气候条件、植物种类和生存环境、
采收期、贮藏条件等因素关系密切相关。测定结
果表明：郑州地区野生贼小豆中含有葡萄糖、果
糖、蔗糖、棉籽糖、麦芽糖5种糖，质量分数在
1.453~6.667 mg/g。蔗糖和葡萄糖含量较高，棉籽
糖和麦芽糖含量相对较低，其中，含有一定量的
棉籽糖是贼小豆含糖的明显特征。
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图2 贼小豆样品中糖类化合物色谱图
表3 样品测定结果(n = 6)
糖类 保留时间/min
样品含量/(mg/g)
2010年贼
小豆
2011年贼
小豆
2012年贼
小豆
蕈糖 3.050 N.D. N.D. N.D.
鼠李糖 4.330 N.D. N.D. N.D.
阿拉伯糖 5.034 N.D. N.D. N.D.
葡萄糖 6.000 4.416 4.621 4.458
果糖 6.684 3.104 3.400 3.352
蔗糖 8.484 6.451 6.348 6.667
乳糖 10.130 N.D. N.D. N.D.
棉籽糖 13.100 1.453 1.820 1.764
麦芽糖 22.234 2.175 2.351 2.282
注：N.D.表示未检出。
图1 糖类标准溶液色谱图
(下转第293页)
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2013年 第38卷 第11期
质含量的方法。
试验比较了3种提取方法，结果显示超声提
取法优于索式提取、回流提取法，可能由于温
度过高造成黄酮结构破坏，含量降低。新疆核
桃隔膜中黄酮类物质含量稍高于云南核桃隔膜
中的含量。
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