全 文 ：文章编号:1001-8220(2001)03-0225-05
播娘蒿原生质体培养研究
周颂东
(四川师范学院生物系 ,四川 南充　637002)
摘　要:以播娘蒿无菌苗的子叶和下胚轴分离原生质体 ,每克鲜重产量最高达(1 ～ 1.5)×106 个.对原生质体进行
液体浅层静置培养.结果表明:最佳酶解液酶组成为 4 %纤维素酶+2 %果胶酶+0.5 %离析酶;最佳培养密度为
20×104 个/mL;最佳渗透压稳定剂为 10 %蔗糖+2 %葡萄糖.观察表明:播娘蒿原生质体 1 ～ 7d 内出现第一次分
裂 ,分裂频率约 20 %,培养 18 d 时具几十个细胞的细胞团 , 以后逐渐形成肉眼可见的小愈伤组织.
关键词:播娘蒿;原生质体;培养
中图分类号:Q945.39;S336　　　文献标识码:A
　　植物原生质体是被去掉纤维素外壁的具有生活力的裸露细胞 ,它能直接摄取外源 DNA ,细胞器等 ,因此
是研究细胞生理现象的理想材料 ,同时也是遗传转化的理想受体.在原生质体培养中可通过遗传操作和突变
体的筛选对品种进行改良 ,创造优异品种.在十字花科(Cruciferac)原生质体培养中 , Kartha[ 1]等首次从油菜
(Brassic napus)实生苗叶片游离的原生质体得到了再生植株 ,之后在许多种中由原生质体培养获得了再生植
株[ 2-5] .迄今为止 ,还未见国内外有关播娘蒿(Descurainia sophia)原生质体培养的报道.播娘蒿为十字花科播
娘蒿属植物 ,是四川大学植物研究所筛选出来的有希望的特种油料植物之一[ 6] .本实验以播娘蒿无菌苗的子
叶和下胚轴为材料分离原生质体 ,经培养获得了愈伤组织.这一研究期望能为播娘蒿在原生质体水平上的遗
传转化 、突变体筛选以及体细胞融合育种提供必要的技术途径.
1　材料和方法
1.1　实验材料
供试材料为采自四川红原草原所室温袋装保存于四川大学植物研究所的播娘蒿种子.接种于培养基中 ,
所得无菌苗的子叶和下胚轴为游离原生质体的材料.
1.2　实验方法
1.2.1　无菌苗的获得
播娘蒿种子先用 70 %乙醇浸泡 1 min ,无菌水冲洗一次 ,然后转入 0.1 %HgCl2溶液中消毒 6 ～ 8 min ,再
用无菌水冲洗 5次 ,接种于含30 g/L 蔗糖和6 g/L 琼脂的MS培养基中 ,25 ℃发芽 ,培养 7 ～ 10 d便长成可供
利用的无菌苗.
1.2.2　原生质体制备
(1)酶解液的制备　酶解液由不同浓度的纤维素酶(Cellulase Onozuka , R-10)、果胶酶(Pectinase)、离析酶
(Macerozyme ,R-10)以及 0.1 %MES(2-morpholino ethanesulfonic acid)组成 , 溶于原生质体洗涤液中 ,经
0.45μm 微孔滤膜过滤灭菌.洗涤液成分为每升含:27.9 mg KH2PO4 , 101 mg KNO3 , 1 480 mg CaCl2·2H2O ,
繱收稿日期:2001-01-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670084)
作者简介:周颂东(1972-),女,重庆荣昌人,四川师范学院生物系讲师 ,硕士,主要从事植物生理、遗传的教学和科研工作.
　第 22卷　第 3期　　 　　　　四 川 师 范 学 院 学 报 (自 然 科 学 版 )　　　 　　　2001年 9月
　Vol.22　 No.3　　　 　　Journal of Sichuan Teachers College (Natural Science)　　　　　　Sep.2001
DOI :10.16246/j.issn.1673-5072.2001.03.004
246 mg MgSO4·7H2O ,0.166 mg KI ,0.025 mg CuSO4·5H2O(即 CPW盐),附加 10 %甘露醇 , pH 5.6 ～ 5.8.
(2)原生质体分离　用解剖刀将播娘蒿无菌苗的子叶和下胚轴尽可能切细 ,投入 50 mL 三角瓶中 ,按每
克材料加 5 mL 的比例加入酶液 ,置于水平旋转式摇床上(45 r/min)黑暗条件下酶解 ,待原生质体游离较完全
时 ,将酶解液经 50μm 尼龙网过滤 ,滤液经 500 r/min离心 5 min ,去掉上清液 ,用洗涤液(CPW-10M)离心洗
涤原生质体2次 ,再用原生质体培养基离心洗涤1 ～ 2次即可得到较纯净的原生质体.
1.2.3　原生质体培养
经纯化后的原生质体用原生质体培养基调整密度至(2.5 ～ 20)×104 个/mL ,将 2 mL 原生质体悬浮液滴
在直径6 cm的培养皿中 ,于温度 25 ℃黑暗条件下进行液体浅层静置培养.在 10 ～ 30 d的培养中 ,每隔 10 d
加入 0.2 ～ 0.4mL补充培养基稀释.倒置显微镜下观察原生质体成壁及再生细胞的分裂状况.培养 30 d时 ,
用细吸管小心吸出培养基 ,加入扩增培养基中培养 ,促进愈伤组织的增殖.
原生质体培养基:MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2 ,4-D 1.0mg/L+丝氨酸 100mg/L+谷氨酰胺
800 mg/L 并附加不同浓度的甘露醇 、葡萄糖 、蔗糖.
补充培养基:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2 , 4-D 0.5 mg/L+丝氨酸 100 mg/L +谷氨酰胺
800 mg/L+30 g/L 蔗糖.
扩增培养基:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2 ,4-D 0.5mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂.
以上培养基 pH均为 5.6 ～ 5.8 ,其中原生质体培养基和补充培养基用 0.22μm 微孔滤膜过滤灭菌 ,扩增
培养基为高压灭菌.
2　结果与分析
2.1　原生质体分离
由黑暗条件下培养萌发的播娘蒿无菌苗子叶和下胚轴经不同酶解液酶解之后 ,分离纯化后原生质体产
量很低.光照培养而来的绿苗的子叶和下胚轴在不同酶解液中能不同程度的游离出原生质体 ,产量较黄化苗
高.因此以后都采用绿苗为材料制备原生质体.
由表 1可以看出 ,原生质体产量 、酶液浓度及酶解时间之间有着密切关系.Ⅰ号酶解液经 24 h酶解产量
小于 104 个/gFW ,继续延长酶解时间至 36 h ,产量仍小于104个/gFW.从Ⅰ -Ⅳ号 ,纤维素酶和果胶酶浓度依
次同时增加一倍 ,原生质体产量约有增加 ,继续延长酶解时间 ,原生质体产量反而下降.由Ⅴ , Ⅵ , Ⅶ 对比可
知 ,离析酶对播娘蒿原生质体分离的作用是显著的 ,加入离析酶可大大提高原生质体产量 ,且随离析酶浓度
增加产量也随之增加 , Ⅵ 号酶解液酶解 10 h ,所得原生质体产量最高 ,可达(1 ～ 1.5)×106 个/gFW.原生质体
大小在30-50 μm之间(图 1-1),继续酶解至 16 h ,原生质体产量下降至(0.5×106)个/gFW.这时镜检发现
有较多细胞残渣 ,原生质体破裂 ,同时也还有未被解离的细胞团(图 1-2).由此可见 ,适当选择酶液组成 、浓
度和酶解时间对于提高播娘蒿原生质体产量是至关重要的.酶液组合不适 ,浓度过低或过高 ,酶解时间过短
或过长都不利于获得高产量的原生质体.另外 ,子叶和下胚轴的生育时期对原生质体的产量也有很大影响 ,
苗龄小于 7 d的子叶和下胚轴太小 ,不易取材 ,大于 10 d的子叶 、下胚轴又较难游离 ,因此取 7 ～ 10 d苗龄的
子叶和下胚轴较宜.
2.2　原生质体分裂
采用不同浓度配比的蔗糖 、葡萄糖和甘露醇作渗透压稳定剂 ,结果表明:单独使用 13 %蔗糖 ,原生质体
均漂浮在培养基表面 ,在(2.5 ～ 20)×104个/mL密度下培养 ,原生质体分裂频率均很低.在4 %蔗糖配合7 %
甘露醇的培养基中 ,各密度下原生质体都会有很大程度的破裂 ,几乎没观察到分裂的原生质体 ,这两种组合
培养基最终都未获得再生细胞团.由 10 %蔗糖配合 2 %葡萄糖作渗透压稳定剂效果较好 ,在培养密度为
2.5×104个/mL ,5×104 个/mL ,10×104个/mL , 20×104 个/mL 时 ,原生质体分裂频率依次为 2 %,5 %,15 %,
20 %.由此可见 ,在此培养基中 ,培养密度对原生质体分裂频率的影响是显而易见的 ,随培养密度增加 ,原生
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质体的分裂频率也随之增加.
表 1　酶浓度和酶解时间对播娘蒿原生质体产量的影响
Table 1　Effect on yield of D.sophia of varied enzymic concentration and enzymolysis time
酶液序号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ
纤维素酶(%) 1 2 4 6 4 4 4
果胶酶(%) 0.5 1 2 3 2 2 2
离析酶(%) 0 0 0 0 0.2 0.5 0.5
酶解时间(h) 24 24 16 10 12 10 16
原生质体产量(个/ gFW) <104 ≈104 ≈105 105 ≈106 (1～ 1.5)×106 0.5×106
2.3　原生质体培养及愈伤组织形成
在10 %蔗糖+2 %葡萄糖的培养基中 ,培养密度为 20×104 个/mL时 ,播娘蒿原生质体培养 1 d ,开始形
成细胞壁 ,可观察到部分原生质体分裂 ,方式以均等分裂为主(图 1-3),原生质体发生第一次分裂的时间不
等 ,在 1 ～ 7 d均能观察到 ,第 10 d统计分裂频率为20 %左右 ,在 3 ～ 7 d部分细胞发生第二次分裂 ,形成 4细
胞团(图 1-4),培养 18 d时具几十个细胞的细胞团(图 1-5),以后逐渐形成肉眼可见的小愈伤组织(图 1-
6),及时将小愈伤组织转移至扩增培养基 ,可促进愈伤组织的增殖.
3　讨　论
3.1　实验材料对原生质体分离的影响
在十字花科其它种属的原生质体培养中 ,所用的材料有叶片[ 3] 、子叶[ 4 ,7] 、下胚轴[ 2 ,4 , 7] 、幼根[ 8] 、叶柄[ 5 , 9]
等 ,但常用的是叶片和下胚轴.因为以叶片为材料分离原生质体产量高 ,以下胚轴为材料 ,原生质体的分裂频
率及再生能力相对较高.本实验以播娘蒿下胚轴为材料 ,试图得到高的分裂频率.但因播娘蒿种子太小 ,萌发
的下胚轴也很细 ,且不易得到完全整齐的小苗 ,所以取材时难以把子叶和下胚轴完全分开 ,只能采用两者的
混合材料 ,这可能对原生质体的分离产量和质量有一定影响.实验表明[ 7] ,分离子叶原生质体需要较强的果
胶酶和较长时间的酶解 ,而果胶酶过强或酶解时间过长 ,会损伤原生质体甚至导致其破碎.实验观察到 ,酶解
过程中 ,有的细胞团仍是紧密排列 ,而一些已游离的原生质体已破碎.
本实验用暗培养萌发的黄化苗子叶和下胚轴分离纯化原生质体产量很低 ,远远低于光照培养萌发的绿
苗的产率.这一结果与周冀明以诸葛菜(Oryohophragmus violaccus)为材料观察到情形相反[ 7] .这可能是由于基
因型不同 ,其生理状况有差异 ,对光的反应不同所致.
3.2　渗透压稳定剂和培养密度对原生质体分裂的影响
原生质体能进行正常细胞分裂的首要条件是细胞壁的再生 ,研究表明 ,蔗糖的存在是壁再生的关键性条
件[ 10] ,但是蔗糖浓度过高又会抑制其生长.本实验中 ,单独使用 13 %蔗糖时 ,原生质体均漂浮在液面 ,分裂
频率小于 5 %,正如 Eriksson[ 11]报道 ,蔗糖浓度超过 0.3 M时会抑制原生质体生长和分裂.当用 4 %蔗糖和
7 %甘露醇配合时 ,原生质体多数破裂 ,这可能是渗透压稳定剂浓度过低所致.实验结果表明:对于维持播娘
蒿原生质体的渗透压和壁再生 ,10 %蔗糖和 2 %葡萄糖配和较适宜.
原生质体接种密度对原生质体的分裂有较大影响 ,这是因为细胞壁的尽快恢复 ,需要一个合适的接种密
度[ 12] .在 10 %蔗糖和 2 %葡萄糖配和的培养基中 ,培养密度为 2.5×104 个/mL时 ,原生质体分裂频率仅为
2 %,当培养密度增至 20×104个/mL时 ,原生质体分裂频率增大 10倍 ,对于播娘蒿子叶和下胚轴原生质体
培养 ,20×104/mL 的密度较适宜.
227　第 22卷第 3期 　　周颂东:播娘蒿原生质体培养研究
1　刚分离纯化的原生质体　2　未被酶解的细胞团　　　　3　原生质体第一次分裂
4　形成 4细胞的细胞团　　5　形成几十个细胞的细胞团　6　形成肉眼可见的小愈伤组织
图 1　原生质体分离及愈伤组织形成
Fig 1　The division of protoplast and the formation of microcalli
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Study on Protoplast Culture of Descurainia sophia
ZHOU Song_dong
(Dept.of Biology , Sichuan Teachers College , Nanchong　637002 , China)
Abstract:The highest yield of purified protoplasts isolated from cotyledon and hypocotyl of sterile seeding of D .sophia
could reach about 1 ～ 1.5×106/gFW.When the protoplasts were cultured in liquid medium , the research results showed
that the best combination of the enzyme solution was 4 % Cellulase Onozuka R-10+2 % Pectinase +0.5 %
Macerozyme R-10;the best dentsity of protoplast culture was 20×104/ml;and the best osmotic stabilizerwas 10 % su-
crose+2 %glucose.The first cell divison occurred within 1 ～ 7 days and the highest divison rate was about 20 %.Eigh-
teen days later , a great unmber of cell colonies and microcalli could be observed.
Key words:Descurainia sophia;protoplast;culture
229　第 22卷第 3期 　　周颂东:播娘蒿原生质体培养研究