全 文 ：※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.14 301
UPLC-MS/MS法测定多裂翅果菊中
植物甾醇的含量
侯彩婷1，王瑞华1，邹昀员1，宋晓娜1，刘海霞1，李凤华2，徐凌川1,*
(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东省疾病预防控制中心，山东 济南 250014)
摘 要：目的：建立超高效液相色谱与质谱联用法测定植物甾醇单体化合物含量的方法。方法：对多裂翅果菊不同
采收期以及不同部位的β-谷甾醇、豆甾醇进行含量测定。试样用石油醚回流提取，ACQUITY UPLC C18超高效液相
色谱柱、甲醇和1%乙睛溶液流动相进行分离，以大气压化学电离源正离子模式进行质谱分析，多反应监测(MRM)
定量。结果：在0.2～25μg/mL范围内，β-谷甾醇、豆甾醇质量浓度与峰面积均有良好的线性关系，相关系数r分别
为0.9990、0.9997，两种单体的加样回收率维持在93.45%～104.23%范围内，RSD不高于7%。多裂翅果菊中β-谷甾
醇、豆甾醇含量由高到低依次为：基生叶、茎叶、采收初期根、采收末期根。结论：该方法灵敏度高，分析速度
快，操作简便，适用于植物甾醇的含量测定分析。
关键词：超高效液相色谱-质谱联用法；多裂翅果菊；植物甾醇
Analysis of Phytosterol Content in Pterocypsela laciniata (Houtt.) Shih by Ultra-Performance Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
HOU Cai-ting1，WANG Rui-hua1，ZOU Yun-yuan1，SONG Xiao-na1，LIU Hai-xia1，LI Feng-hua2，XU Ling-chuan1,*
(1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China；
2. Shandong Center for Disease Control and Prevention, Jinan 250014, China)
Abstract：Objective: To establish a method for determining phytosterol content in Pterocypsela laciniata (Houtt.) Shih by
ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Methods: The contents of β-sitosterol
and stigmasterol at different harvest times and different parts of Pterocypsela laciniata (Houtt.) Shih were determined.
Samples were extracted with petroleum ether by reflux extraction, and β-sitosterol and stigmasterol in the extract were
separated by an Acquity BEH C18 UPLC column, with methanol and 1% acetonitrile as mobile phase. Atmospheric pressure
chemical ionization was applied for MS analysis in the positive ion mode, and quantification was performed under the
multiple reaction monitoring (MRM) mode. Results: Good linearity was observed for β-sitosterol and stigmasterol in the
concentration range of 0.2 to 25 μg/mL, with correlation coefficients of 0.9990 and 0.9997, respectively. The average
recovery rates were between 93.45% and 104.23%, with relative standard derivations less than 7%. Pterocypsela laciniata
(Houtt.) Shih was rich in phytosterol. Different positions of the plant harvested at different stages of growth were ranked in
decreasing order of the contents of β-sitosterol and stigmasterol as follows: basal leaves, leaves on the stem, roots at the early
stage of growth and roots at the later stage of growth. Conclusion: The method is sensitive, simple, convenient, accurate and
efficient, and it can be used for determining phytosterol.
Key words：ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Pterocypsela laciniata (Houtt.) Shih；phytosterol
中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)14-0301-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201314063
收稿日期：2012-06-20
作者简介：侯彩婷(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为中药质量控制。E-mail：houcaiting@126.com
*通信作者：徐凌川(1962—)，男，教授，学士，研究方向为中药质量控制与品质评价和药用真菌分类与鉴定。
E-mail：xulingchuan518@sina.com
多裂翅果菊(Pterocypsela laciniata (Houtt.) Shih)为翅
果菊属(Pterocypsela Shih)的多年生草本植物。翅果菊属
为菊科一年生或多年生草本，过去曾称为山莴苣属[1]，
分布于东亚及南亚地区，目前共报道7种，在我国都有生
产[2]。本属植物在山东省境内分布有3种，分别为翅果菊
(Pterocypsela indica (L.)C. Shih)、多裂翅果菊(Pterocypsela
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laciniata (Houtt.) Shih)和毛脉翅果菊(Pterocypsela
raddeana (Maxim) Shih)[3-4]。其中，多裂翅果菊在山东分
布极广，它不仅风味好、质地细嫩、营养价值高，而且
具有抗肿瘤、抗氧化、抗心脑血管病等多方面的重要作
用[5-7]。它可以作为蔬菜种植，在蔬菜淡季为人们提供营
养丰富的茎叶[8]，也可以作为人们养生保健的佳品。通
过对多裂翅果菊根及根茎的化学成分进行系统的分离测
定，发现其植物甾醇类化合物含量非常丰富。
植物甾醇是3位为羟基的甾体化合物，其化学结构
与胆固醇主环结构相似，只是侧链结构的C24位上多一
个或多个碳单元[9-10]。近年来，对植物甾醇的研究日益
活跃，国内外药理及临床研究[12-17]表明，植物甾醇的两
种主要活性物质——β-谷甾醇、豆甾醇有明显的降血
脂、消炎、抗溃疡、抗肿瘤作用。关于甾醇类化合物的
含量测定方法，到目前为止，已有过重量法[17-18]、紫外
法、薄层扫描法[19-20]、气相色谱法[18-21]、高效液相色谱
法[18]、反相高效液相色谱等的报道，但这些方法都存在
一定的局限性。本实验运用超高效液相色谱与质谱联用
法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry，UPLC-MS/MS)对多裂翅果菊基生叶，茎叶
以及不同采收期的根中β-谷甾醇以及豆甾醇的含量进行
了比较，为植物甾醇的研究方法以及多裂翅果菊的临床
用药和日常应用提供了一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原药材采集于山东中医药大学长清校区，由山东中
医药大学生药系徐凌川教授鉴定。
甲醇、乙腈、石油醚均为色谱纯 美国Merk公司；
水为超纯水(经过milli-Q超纯水纯化系统纯化)；β-谷甾醇
标准品 中国药科大学天然药物化学实验室；豆甾醇标
准品(MUST-11030901)。
1.2 仪器与设备
ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色
谱仪、Quattro Premier XE三重四极杆串联质谱仪以及
Masslynx4.1数据采集软件)、ACQUITY UPLC BEH C18柱
(2.1mm×100mm，1.7μm) 美国Waters公司；万分之一
分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司；AGB5型十万
分之一电子天平 美国Mettler Toledo公司；恒温水浴
锅、干燥箱、微孔滤膜等。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Acquity Uplc Beh C18柱(2.1mm×100mm，
1.7μm)；柱温：35℃；进样量：5μL；流速：0.2mL/min；流
动相为纯甲醇和1%乙腈溶液(V/V)；流动相梯度洗脱见表1。
表 1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间/min 流动相配比/%甲醇 1%乙腈溶液
0.0 95 5
3.0 98 2
6.0 98 2
6.5 100 0
8.0 100 0
8.5 95 5
15.0 95 5
1.3.2 质谱条件
离子源为APCI +；毛细管电压：3 .5kV；锥孔电
压：30V；脱溶剂气温度：550℃；锥孔气流量(N2，
99.99%)：50L/h；脱溶剂气流量(N2，99.99%)：500L/h。
质量分析器：低端分辨率LMLens：13.0V；高端分辨率
HMLens：13.0V；质量条件参数详见表2。
表 2 质量条件参数
Table 2 UPLC-MS/MS parameters
组分 母离子(m/z) 子离子(m/z) 锥孔电压/V 碰撞能量/eV
豆甾醇 395.64 134.95 30.00 40.00
395.64 313.37 30.00 30.00
β-谷甾醇
397.54 161.14 30.00 40.00
397.54 257.29 30.00 25.00
397.54 287.72 30.00 20.00
1.3.3 对照品溶液的制备
精密称取β-谷甾醇、豆甾醇对照品各2.5mg，用甲醇
溶解并定容至50mL，即得0.05mg/mL的储备溶液。
1.3.4 供试品溶液的制备
精密称定干燥至恒质量的多裂翅果菊不同采收期以
及不同部位的粉末各0.5g，置100mL圆底烧瓶中，加石
油醚(60～90℃)30mL，80℃加热回流提取2次，每次1h，
提取液过滤，滤液减压蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至
10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微
孔滤膜过滤，备用。
2 结果与分析
2.1 色谱条件和质谱条件的选择
应用Acquity Uplc Beh C18柱，以甲醇-1%乙腈溶液
为流动相，流速0.2mL/min，每一次进样的分析时间
为15min，β-谷甾醇和豆甾醇的出峰时间分别为4.65、
5.04min。
β-谷甾醇(C29H50O)的相对分子质量为414.38，豆甾
醇(C29H48O)的相对分子质量为412.48，采用正离子检测
方式，在一级全扫描质谱中获得β-谷甾醇、豆甾醇的准
分子离子峰[M—OH]+分别为m/z 397.54、m/z 395.64，选
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择性的再对[M—OH]+进行二级质谱分析，分别选择丰度
较高的特征离子，β-谷甾醇的准分子离子裂解生成的主
要碎片离子为m/z 134.95和m/z 313.37，其中m/z 134.95可
作为其定量离子峰；豆甾醇的准分子离子裂解生成的主
要碎片离子为m/z 161.14、m/z 257.29和m/z 287.72，其中m/z
161.14可作为其定量离子峰。然后，分别对5.0μg/mL的β-谷
甾醇、豆甾醇在大气压化学电离子源正离子模式使用多反
应监测模式(MRM)对它们进行定量分析，结果如图1所示。
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
50
100
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
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a 5.04
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
50
100
Ⳍ
ᇍ
Є
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/%
ᯊ䯈/min
b 4.64
4.36
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
50
100
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
ᯊ䯈/min
c
3.72
4.64
5.04
a.β-谷甾醇离子流图；b.豆甾醇离子流图；c.总离子流图。
图 1 对照品的多反应模式下的总离子流图谱
Fig.1 MRM chromatograms of phytosterol control
2.2 线性关系考察
将配制好的β-谷甾醇、豆甾醇对照品储备溶液用甲
醇分别稀释为0.2、1.0、2.0、5.0、12.5、25μg/mL系列
标准溶液，分别进样5μL，以峰面积Y为纵坐标，质量浓
度(X，μg/mL)为横坐标绘制工作曲线。β-谷甾醇和豆甾
醇回归方程分别为：Y=1856.29X＋119.66，Y=369.03X＋
12.279。结果表明，在0.2～25μg/mL范围内，两种对照品
质量浓度与峰面积有良好的线性关系，相关系数(r)分别
为0.9990、0.9997。
2.3 重复性实验
对多裂翅果菊样品按1.3.4节供试品制备方法制备提
取液5份，分别进样测定，测得β-谷甾醇和豆甾醇的RSD
分别为3.79%、4.83%。结果表明本方法的重复性良好。
2.4 精密度实验
精密吸取上述对照品5μL，按照上述条件，重复进
样5次，测得β-谷甾醇和豆甾醇的峰面积的RSD分别为
1.26%和 1.92%。结果表明本方法的精密度良好。
2.5 加样回收实验
精密称取已知含量的多裂翅果菊各样品5g，精密加
入一定量的β-谷甾醇和豆甾醇对照品，分别对β-谷甾醇、
豆甾醇进行添加回收实验，重复测定5次，按照1.3.4节的
方法制备供试品溶液，照上述方法测定样品含量，并计
算加样回收率，结果见表3。结果表明，多裂翅果菊的基
生叶、茎叶、采收末期的根、采收初期的根中β-谷甾醇
和豆甾醇平均回收率维持在93.45%～104.23%之间，RSD
值不高于7%，各样品中两种标准品的回收率均较好。
表 3 加样回收率实验结果(n=5)
Table 3 Results of recovery tests (n=5)
组分 样品 样品含量/(mg/100g) 平均回收率/% RSD/%
β-谷甾醇
基生叶 30.32 104.23 6.72
茎叶 25.12 95.36 3.64
采收末期根 10.92 93.45 4.55
采收初期根 14.74 97.22 3.42
豆甾醇
基生叶 17.66 94.12 2.44
茎叶 15.48 97.34 4.67
采收末期根 8.68 103.67 5.89
采收初期根 14.94 101.13 3.25
2.6 稳定性实验
取同一批次的供试品溶液，在室温条件下自然放
置，分别在放置0、6、12、24、48h时后进行测定，结果
如表4所示。结果表明，样品中β-谷甾醇和豆甾醇的含量
的RSD均小于5%，说明样品溶液在48h内稳定性良好。
表 4 稳定性实验结果
Table 4 Results of stability tests
组分 样品 含量/(mg/100g) RSD/%
0h 6h 12h 24h 48h
β-谷甾醇
基生叶 32.24 30.67 30.25 31.09 29.88 2.96
茎叶 24.99 24.42 26.04 25.62 25.34 2.44
采收末期根 10.10 9.95 11.25 10.55 10.63 4.87
采收初期根 15.29 15.04 14.99 14.06 14.22 3.70
豆甾醇
基生叶 17.19 16.78 18.23 18.02 17.44 1.65
茎叶 15.07 15.54 15.67 16.04 15.02 2.57
采收末期根 8.98 8.55 8.23 9.04 8.15 4.80
采收初期根 14.69 14.99 14.37 15.16 14.94 2.07
2.7 样品含量测定
取适量样品按1.3.4节所述方法制得的供试品溶液，
按拟定的色谱条件进行测定，重复测定3次，各样品的谱
图见图2、3。
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ᯊ䯈/min
2 4 6 8 10 12 14
0
0
100
50
5.03A
3.39
7.65
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
ᯊ䯈/min
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
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20 4 6 8 10 12 14
0
100 5.03
3.39 7.84
B
50
ᯊ䯈/min
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
20 4 6 8 10 12 14
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100 5.03
3.39
7.87
C
50
ᯊ䯈/min
Ⳍ
ᇍ
Є
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/%
20 4 6 8 10 12 14
0
100 5.03
3.39
7.71
D
50
A.基生叶；B.茎叶；C.采收末期根；D.采收初期根。
图 2 样品中β-谷甾醇的多反应模式下的离子流图谱
Fig.2 MRM chromatograms of β-sitosterol in samples
0
100 4.64
4.33
3.102.93 6.93 7.69
ᯊ䯈/min
20 4 6 8 10 12 14
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
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A
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ᯊ䯈/min
20 4 6 8 10 12 14
Ⳍ
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0
100 4.64
4.33
2.91 6.66
B
50
ᯊ䯈/min
20 4 6 8 10 12 14
Ⳍ
ᇍ
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ᑺ
/%
0
100 4.64
4.32
3.10
2.91 6.69
C
50
ᯊ䯈/min
20 4 6 8 10 12 14
Ⳍ
ᇍ
Є
ᑺ
/%
0
100 4.64
4.323.17
2.862.20
6.64
D
50
A.基生叶；B.茎叶；C.采收末期根；D.采收初期根。
图 3 样品中豆甾醇的多反应模式下的离子流图谱
Fig.3 MRM Chromatograms of stigmasterol in samples
根据峰面积计算各样品中β-谷甾醇、豆甾醇的含
量，结果见表5。
表 5 多裂翅果菊β-谷甾醇、豆甾醇含量
Table 5 β-sitosterol and stigmasterol contents in Pterocypsela laciniata
(Houtt.) Shih
样品 采收时间 β-谷甾醇平均峰面积
β-谷甾醇平均
含量/(mg/100g)
豆甾醇平均
峰面积
豆甾醇平均含
量/(mg/100g)
总平均含量/
(mg/100g)
基生叶 2011-05 28254.48 30.32 3272.23 17.66 47.98
茎叶 2011-05 23442.57 25.12 2869.89 15.48 40.60
采收末期根 2011-10 10260.23 10.92 1612.05 8.68 19.60
采收初期根 2011-05 13799.88 14.74 2770.02 14.94 29.68
3 讨 论
目前植物甾醇已成为国际市场尤其是欧美市场最
受关注的功能性食品因子之一。由测定结果可得知，
多裂翅果菊中植物甾醇中含量由高到低依次为：基生
叶、茎叶、采收初期根、采收末期根。基生叶含量最
高，其中β-谷甾醇含量为30.32mg/100g，豆甾醇含量为
17.66mg/100g。采收末期根的含量最低，其中β-谷甾醇
含量为10.92mg/100g，豆甾醇含量为8.68mg/100g。由此
可见，多裂翅果菊中的植物甾醇的含量丰富，尤其是其
基生叶中植物甾醇的含量相当高，加之其基生叶质地细
嫩、叶肉肥厚，分布广泛，易于栽培，可以作为药食两
用品，具有广阔的发展前景。
豆甾醇与β-谷甾醇有极其相似的基本结构，物理性
质差异较小，给分离检测带来一定的困难。本实验选用
的超高效液相色谱与质谱联用法测定植物甾醇单体类化
合物的含量属国内外首次，该方法将UPLC的高分离性
※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.14 305
能和MS的高鉴别特点相结合，大大提高了豆甾醇与β-谷
甾醇分离度，并缩短了分析时间，为建立一种方便、快
速、灵敏、准确的植物甾醇单体化合物的分析检测方法
提供一定的科学依据。
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