全 文 ：降低（Ｐ＜０．０１），本研究显示在模型组的ＣＩＡ大鼠
关节滑膜中发现ｐ－ⅠκＢα、ＮＦ－κＢ／Ｐ６５成高表达（Ｐ
＜０．０５），与诸多报道有着相似的结果［１１－１４］，这些结
果均进一步提示ＮＦ－κＢ信号活化以及致炎因子ＩＬ－
１β、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α的上升、抑炎因子ＩＬ－１０的下降可
能在ＣＩＡ模型大鼠关节滑膜炎症中起关键作用，并
可能与 ＲＡ关节滑膜炎症的发生、发展密切相关。
对课题组实验结果进一步分析，与模型组大鼠相比，
ｒｈＴＮＦＲ∶Ｆｃ治疗组以及醋酸泼尼松对照组 ＮＦ－
κＢ／Ｐ６５、ｐ－ⅠκＢα表达的灰度比值明显下降（Ｐ＜
０．０５），并能显著下调 ＣＩＡ 大鼠关节滑膜 ＮＦ－κＢ／
Ｐ６５、ｐ－ⅠκＢα蛋白的表达（Ｐ＜０．０５）；结合前期研
究发现［５］ｒｈＴＮＦＲ∶Ｆｃ治疗组及醋酸泼尼松均有效
下调血清致炎因子ＩＬ－１β、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α的表达（Ｐ
＜０．０１），上调抑炎因子ＩＬ－１０的表达（Ｐ＜０．０１），
这提示ｒｈＴＮＦＲ∶Ｆｃ及醋酸泼尼松可能是通过下调
ＩκＢα磷酸化水平，导致 ＮＦ－κＢ／Ｐ６５蛋白表达降低，
从而抑制ＮＦ－κＢ信号通路的活化，并下调血清致炎
因子水平，这可能是缓解ＲＡ炎症的机制之一，相比
长期使用激素的多种不良反应，ｒｈＴＮＦＲ∶Ｆｃ将是
临床治疗ＲＡ的更好选择之一。另外，陈镜宇等［１５］
研究也发现ｒｈＴＮＦＲ∶Ｆｃ体外给药能够抑制由
ＴＮＦ诱导的滑膜细胞增殖，并下调炎症因子ＩＬ－１β，
ＩＬ－６，ＩＬ－１７的分泌水平，认为其抑制滑膜细胞增殖
和分泌功能可能是治疗佐剂性关节炎大鼠的作用机
制。细胞信号转导通路是一个复杂的调节网络，多
条通路之间存在各种相互联系，相互协同，相互制
约，ｒｈＴＮＦＲ∶Ｆｃ对ＲＡ滑膜炎症的抑制作用，可能
还会通过其他的途径，有待于进一步研究。
（声明：本文研究经费均来源于课题组所申请
课题，不涉及利益冲突）
参考文献：
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［收稿日期］２０１５－０５－１８
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（编号：８１４０３１８８）；湖北省自然科学基金资助项目（编号：２０１３ＣＦＢ４５１）；湖北省民族药物现代化工程
技术研究中心（中南民族大学）开放课题（编号：２０１５ＺＹ００２）　［作者简介］李小军，男，讲师，电话：０２７－６７８４２３３２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｏｊｕｎｌｉｘｉａｏｊｕｎ＠
ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ　［通讯作者］唐和斌，研究方向：中药药理，电话：０２７－６７８４２３３２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｂｔａｎｇ２００６＠ｍａｉｌ．ｓｃｕｅｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
“一测多评”法测定平卧菊三七中绿原酸类成分
李小军１，２，张妹砣１，穆云妹１，李婷婷１，杨艳羚１，曾紫璇１，李玉桑１，唐和斌１，２　 （１．中南民族大学药学院药理学研
究室，湖北 武汉４３００７４，２．中南民族大学，湖北省民族药物现代化工程技术研究中心，湖北 武汉４３００７４）
［摘要］　目的：分离鉴定平卧菊三七乙醇提取物所含绿原酸类成分，并用一测多评法建立其质量标准。方法：用制备型高效
液相色谱法分离平卧菊三七中单体成分，利用液质联用、核磁共振法鉴定其结构。建立能准确测定其成分含量的 ＨＰＬＣ方
法，在此基础上，以绿原酸为对照，计算相对校正因子，建立“一测多评”法。结果：从平卧菊三七中分离纯化新绿原酸、绿原
·７００２·中国医院药学杂志２０１５年１１月第３５卷第２２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｎｏｖ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２２
酸、异绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ和异绿原酸Ｃ。相对校正因子的耐用性良好，一测多评法与外标法对比结果无显著差异。结论：
异绿原酸Ａ、Ｂ和Ｃ首次从本属植物中分离，所建立的含量测定方法可用于同时测定平卧菊三七提取物中５种绿原酸类成分。
［关键词］　平卧菊三七；一测多评；异绿原酸；绿原酸
［中图分类号］Ｒ９２７．２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１５）２２－２００７－０５　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１５．２２．０７
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｂｙ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｆｒｏｍＧｙｎｕ－
ｒａ　ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ（ｌｏｕｒ．）Ｍｅｒｒ
ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１，２，ＺＨＡＮＧ　Ｍｅｉ－ｔｕｏ１，ＭＵ　Ｙｕｎ－ｍｅｉ　１，ＬＩ　Ｔｉｎｇ－ｔｉｎｇ１，ＹＡＮＧ　Ｙａｎ－ｌｉｎｇ１，ＺＥＮＧ　Ｚｉ－ｘｕａｎ１，ＬＩ
Ｙｕ－ｓａｎｇ１，ＴＡＮＧ　Ｈｅ－ｂｉｎ１，２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎ－
ａｌｉｔｉｅｓ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕｈａｎ　４３００７４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｉｃ　Ｍｉｎｏｒｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｈｕｂｅｉ　Ｗｕｈａｎ　４３００７４，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｇｙｎｕｒａ　ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ（ｌｏｕｒ．）Ｍｅｒｒ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ（ＧＰＥＥ）ａｎｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒ－
ｍｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｂｙ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍａｒｋｅｒ（ＱＡＭＳ）．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ
ｏｆ　ＧＰＥＥ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＨＰＬＣ．Ｔｈｅｓｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｐｅｃｔｒａｌ　ｄａｔａ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．
Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ＧＰＥＥ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍｅｔｈｏｄ（ＥＳＭ）ａｎｄ　ＱＡＭＳ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒ－
ｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｎｅｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ
ａｃｉｄ　Ａ，Ｂ　ａｎｄ　Ｃ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ＧＰＥＥ．Ｒｕｇｇｅｄｎｅｓｓ　ｏｆ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗａｓ　ｇｏｏｄ．Ａｎｄ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＥＳＭ
ａｎｄ　ＱＡＭＳ　ｓｈｏｗｅｄ　ｎｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ａ，Ｂ　ａｎｄ　Ｃ　ｃａｎ　ｂｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｕｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｔｉｍｅ．
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＰＥＥ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｇｙｎｕｒａ　ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ（ｌｏｕｒ．）Ｍｅｒｒ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍａｒｋｅｒ（ＱＡＭＳ）；ｉｓ－
ｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ；ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ
　　 平卧菊三七 ［Ｇｙｎｕｒａ　ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ （Ｌｏｕｒ．）
Ｍｅｒｒ］，俗称帕崩板，菊科菊三七属多年生草本植
物［１］，药食兼用，具有广泛的药理作用，《傣医药》记
载帕崩板 “散瘀、消肿、活血生肌”，在我国周边的
东南亚民族地区，它还用于降糖降脂［２］、抗肝癌［３］、
解脏毒和保护肠道［４－５］。民间常将嫩茎叶作蔬菜食、
作茶饮，作为新食品原料（原卫生部公告２０１２年第
８号），其在广东、江西等地有规模化的种植。已知
成分包括绿原酸［６］、咖啡酸［７］、黄酮、生物碱、萜烯、
香豆素类等［８－１０］。现有文献报道了其中绿原酸的提
取及纯化工艺，对于平卧菊三七中其他绿原酸类似
成分的研究尚未有涉及，且目前未见其质量标准的
相关报道。因此，我们分离制备各成分，同时建立
ＨＰＬＣ法测定各成分含量。
利用传统外标法测定多指标需要对照品的种类
多、数量大、价格昂贵，有文献提出一测多评的多指标
的质控模式［１１］，以常见便宜的标准品为内标，以其他
成分与标准品的相对校正因子（ｆｋ／ｓ），来计算其他成
分的量。本实验以绿原酸为参照物，建立其与其他成
分之间的ｆｋ／ｓ，并计算各成分的量，与采用外标法的
结果进行对比来验证一测多评的准确性和可靠性。
这为更真实评价平卧菊三七质量提供了全新模式。
１　材料
半制备型高效液相色谱仪（配有 Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００
Ｐｕｍｐ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ｃｏｌ－
ｕｍｎ　Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　Ｄｅｔｅｃ－
ｔｏｒ）；分析型高效液相色谱仪（配有 Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００
Ｐｕｍｐ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ｃｏｌ－
ｕｍｎ　Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　Ｄｅｔｅｃ－
ｔｏｒ）；ＭＥＴＴＬＥＲ　ＴＯ－ＬＥＤＯ 分析天平（ＡＢ２６５－Ｓ
型）；液质联用色谱仪（配有ＤＩＯＮＥＸ　Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００
Ｐｕｍｐ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ，Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００
Ｒｓｃｏｌｕｍｎ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｗａｖｅ－
ｌｅｎｇｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、ＬＣＱ－ＦＬＥＥＴ　Ｔｈｅｒｍｏ质谱仪）；核磁
共振波谱仪（ＡＶＡＮＣＥＳⅢ４０００）。
绿原酸对照品（批号１１０７５３－２００４１３，中国食品药
品 检 定 研 究 院）；新 绿 原 酸 对 照 品 （批 号
ＰＡ０８１９ＲＡ１３）、异绿原酸Ａ对照品（批号２０１３０８１６）、
异绿原酸Ｂ对照品（批号ＫＡ０４１０ＣＡ１４）、异绿原酸Ｃ
对照品（批号２０１３１２２８），均为上海源叶生物科技有限
公司产品；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
２　方法与结果
２．１　平卧菊三七主要成分分离纯化
２．１．１　平卧菊三七样品的制备　平卧菊三七产自
广东，由中科院武汉植物园张炳坤老师鉴定。取干
燥茎（０．５　ｋｇ）粉碎，每次加入５　Ｌ的８０％乙醇，
８５℃下回流提取１　ｈ，共提取３次，合并提取液并浓
缩干燥，干浸膏（密度１．４０　ｇ·Ｌ－１）得率为１８．５％。
·８００２· 中国医院药学杂志２０１５年１１月第３５卷第２２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｎｏｖ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２２
将浸膏溶于５０％的甲醇（０．１　ｇ·ｍｌ－１），用０．４５μｍ
微孔滤膜过滤，以供制备使用。
２．１．２　制备色谱与质谱条件　色谱条件：ＤＩＯＮＥＸ
ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００高效液相色谱仪，色谱柱为：ＷＡ－
ＴＥＲＳ　Ｃ１８－ＭＳ－Ⅱ色谱柱（１０　ｍｍ×２５０　ｍｍ，５μｍ）；
流动相为乙腈－０．１％三氟乙酸，梯度洗脱：０～４０
ｍｉｎ，５％～３８％ 乙腈，时间为４５　ｍｉｎ，体积流量３．０
ｍｌ·ｍｉｎ－１，进样量５００μｌ，检测波长３２６　ｎｍ，柱温：
３０℃。
质谱条件：ＤＩＯＮＥＸ　Ｃ１８色谱柱（２５０　ｎｍ×４．６
ｍｍ，５μｍ），流动相为乙腈－０．１％甲酸水溶液，梯度
洗脱：０～４０　ｍｉｎ，５％～３８％乙腈；体积流量１．０ｍｌ·
ｍｉｎ－１，分流：１∶４，进样量１０μｌ，检测波长３２６　ｎｍ，
柱温３０℃；毛细管温度３２０℃，雾化器压力２０　Ｐａ，
源电压５　ｋＶ，总电流１００μＡ，干燥器温度３２０℃，干
燥气流速１０　Ｌ·ｍｉｎ－１，检测方式为 ＭＳｎ（ｎ＝１～３），
全扫描质谱。质量扫描范围ｍ／ｚ１００～６００。
２．１．３　分离纯化过程　在“２．２”色谱条件下进样，
色谱图见图１，收集１～９号峰的馏分，经过旋转蒸
发，冻干，得到９种棕色粉末，２号样品量＞５０　ｍｇ，３
号样品量为５　ｍｇ，４号样品５４　ｍｇ，５号样品３２　ｍｇ，
其他均低于１　ｍｇ。
１－新绿原酸；２－绿原酸；３－异绿原酸Ｂ；４－异绿原酸Ａ；５－异绿原酸Ｃ
１－ｎｅｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ；２－ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ；３－ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ｂ；
４－ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ａ；５－ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ｃ
图１　提取物 ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ　１　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔ
２．１．４　绿原酸类化合物结构鉴定　化合物３号、４
号、５号，均为浅棕色粉末，三者１　Ｈ－ＮＭＲ、１３　Ｃ－ＮＭＲ
峰信号极其相似，应为同分异构体，［Ｍ－Ｈ］﹣离子的
ｍ／ｚ为５１７，［Ｍ－Ｈ］﹣ 离子的 ＭＳ２丰度较大的离子
ｍ／ｚ为３５３，１９１，１７９和１３５，１　Ｈ－ＮＭＲ（４００　ＭＨｚ，
ｉｎ　ＣＨ３ＤＯ）中有２组反式烯烃信号［δ７．５０（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１６．０Ｈｚ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ），６．２５
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０ Ｈｚ），６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０
Ｈｚ）］，存在具有奎宁酸在１，３，５－三取代的苯环质
子所具有的特征信号［δ７．０４（２Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１．９
Ｈｚ），６．９９（２Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝８．１　Ｈｚ），６．７８（２Ｈ，ｂｒｄ，
Ｊ＝８．０，１．９　Ｈｚ）］；化合物４具有奎宁酸 Ｈ－３，Ｈ－５
在δ５．２１（２Ｈ，ｍ）特征信号，Ｈ－４在相对高场的
δ３．８４（１Ｈ，ｂｒｄ）特征质子信号，奎宁酸结构中两个
亚甲基的氢信号在高场位置δ２．１３（２Ｈ），２．１４
（２Ｈ）有特征信号。而化合物５具有奎宁酸 Ｈ－３，
Ｈ－４的特征信号在δ４．９８（２Ｈ），５．３３（２Ｈ），而 Ｈ－５
的质子信号在相对低场位置δ４．１８（１Ｈ，ｂｒｄ），结合
碳谱可推测二者皆为二咖啡奎宁酸类，推测化合物
分子式为Ｃ２５Ｈ２４Ｏ１２，计算不饱和度为１４。通过与
文献核磁数据对比［１２］，可知４号样为异绿原酸 Ａ
（３，５－二咖啡酰基奎宁酸），３号、４号、５号的碳谱、
氢谱、质谱图都极其类似，通过与标准品对照，可知
３号为异绿原酸Ｂ（３，４－二咖啡奎宁酸），５号样为异
绿原酸Ｃ（４，５－二咖啡奎宁酸）。
１号峰和２号峰，其 ＭＳ谱中，［Ｍ－Ｈ］－的ｍ／ｚ
为３５３，ＭＳ２谱中丰度较大的离子峰为ｍ／ｚ为１９１，
１６４，１３５，其中１９１为奎宁酸碎片离子峰，１６４为咖
啡酸碎片离子峰，１３５为咖啡酸脱一分子水后碎片
离子峰，两者为同分异构体，通过与标准品对比可判
断，较高的２号色谱峰为绿原酸，１号为新绿原酸；６
号与８号的ｍ／ｚ为３３７，ＭＳ２谱中丰度较大的离子
峰为ｍ／ｚ为１９１，推测结构可能为３－香豆酰奎宁酸
和４－香豆酰奎宁酸这两个同分异构体，７号的ｍ／ｚ
为３６７，ＭＳ２谱中丰度较大的离子峰为ｍ／ｚ为１９１，
推测结构为３－Ｏ－阿魏酰奎宁酸或５－Ｏ－阿魏酰奎宁
酸，９号的ｍ／ｚ为３８５，ＭＳ２谱中丰度较大的离子峰
为ｍ／ｚ为３３７，１６４，２６７，１１９，结构待下一步确定。
２．２　测定绿原酸等成分含量
２．２．１　分析色谱条件　ＤＩＯＮＥＸ　ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００高
效液相色谱仪；ＤＩＯＮＥＸ　Ｃ１８色谱柱（２５０　ｎｍ×４．６
ｍｍ，５μｍ），流动相为乙腈－０．１％磷酸水溶液，梯度
洗脱：０～６５　ｍｉｎ，９％～２７％乙腈；时间为７０　ｍｉｎ，体
积流量１．０ｍｌ·ｍｉｎ－１，进样量１０μｌ，检测波长３２６
ｎｍ，柱温３０℃。
２．２．２　进样前准备
（１）样品制备：精密称取浸膏２５０　ｍｇ，于１０　ｍｌ
量瓶中，加５０％甲醇，于超声仪中超声３０　ｍｉｎ，放
冷，加５０％甲醇至刻度摇匀。过０．４５μｍ滤膜，即
得样品。
（２）标准品含水量测定：Ⅷ采用中国药典２０１０
年版附录Ⅷ Ｍ水分测定法第一法Ａ测得其中平卧
菊三七浸膏、绿原酸、新绿原酸、异绿原酸Ａ、异绿原
酸Ｂ、异绿原酸 Ｃ 含水量分别为９．４６％，６％，
５．８５％，１１．９４％，１３．５３％，６．１２％。
（３）混合对照品溶液制备：分别称取新绿原
酸、绿原酸、异绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异绿原酸Ｃ对
照品３．３０，６．１２，５．９６，６．５６，７．８８　ｍｇ于１０　ｍｌ量瓶
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中，加入５０％甲醇溶液，溶解并稀释至刻度，摇匀，
制成扣除含水量后质量浓度为０．３１，０．５７，０．５８，
０．６３，０．７４　ｍｇ·ｍｌ－１的混合对照品溶液，过０．４５μｍ
微孔滤膜备用。
２．２．３　系统适应性试验　在“２．２．１”项色谱条件分
析，混合对照品溶液及样品溶液 ＨＰＬＣ图谱见图２。
绿原酸、异绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异绿原酸Ｃ之间
相邻色谱峰的分离度均大于１．５，拖尾因子在１．００～
１．２０，理论塔板数按各色谱峰计均在１０　０００以上，
新绿原酸因极性过大，分离效果稍差，但因其含量相
对其他成分极少，故未进一步优化。
１－新绿原酸；２－绿原酸；３－异绿原酸Ｂ；４－异绿原酸Ａ；５－异绿原酸Ｃ
１－ｎｅｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ；２－ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ；３－ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ｂ；
４－ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ａ；５－ｉｓｏｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ｃ
图２　混合对照品（Ａ）及样品（Ｂ）的 ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ　２　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｍｉｘｅｄ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（Ａ）
ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅ（Ｂ）
２．２．４　线性关系考察　取混合对照品溶液２．０，
１．０，０．８，０．６，０．４，０．２，０．１　ｍｌ，稀释１０倍，０．４５μｍ
滤膜过滤后，在“２．２．１”项 ＨＰＬＣ条件测定，记录各
自色谱峰面积。将对照品的质量浓度设为纵坐标
（Ｙ），对照品的峰面积设为横坐标（Ｘ），建立标准曲
线方程，线性关系分析结果见表１。由表１可知，平
卧菊三七对照品在一定的质量浓度范围内其线性关
系良好。
表１　线性关系分析结果
Ｔａｂ　１　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｌｉｎｅａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ
成分 回归方程 Ｒ２值 线性范围／ｍｇ·ｍｌ－１
新绿原酸 Ｙ＝０．００２　５　Ｘ－０．０００　３　０．９９９　９　 ０．００３　１～０．０６２
绿原酸 Ｙ＝０．００２　１　Ｘ－０．０００　６　０．９９９　７　 ０．００５　７～０．２３０
异绿原酸ＡＹ＝０．００１　８　Ｘ＋０．００３　８　０．９９９　５　 ０．００５　８～０．２３４
异绿原酸Ｂ　Ｙ＝０．００１　９　Ｘ＋０．００４　４　０．９９９　４　 ０．００６　３～０．２５２
异绿原酸Ｃ　Ｙ＝０．００１　６　Ｘ＋０．００３　６　０．９９９　３　 ０．００７　４～０．２９６
２．２．５　精密度试验　精密量取混合对照品溶液，在
“２．２．１”项分析色谱条件下，重复进样６次，每次进
样１０μｌ，计算对照品峰面积，新绿原酸、绿原酸、异
绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异绿原酸Ｃ峰面积的ＲＳＤ
分别为３．２１％，０．０６％，０．１８％，０．１４％，０．０８％。
２．２．６　稳定性试验　取待测样品，在“２．２．１”项
ＨＰＬＣ条件下测定，在０，２，４，６，１２，２４　ｈ分别进样，
测得新绿原酸、绿原酸、异绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异
绿原酸 Ｃ峰面积的 ＲＳＤ 分别为５．５１％，０．３０％，
０．３５％，１．７５％，０．７３％，表明样品在２４　ｈ内稳定。
２．２．７　重复性试验　取同一批次（２０１２－６－２１）平卧
菊三七浸膏约５００　ｍｇ，平行称定６份，按“２．２．２”项
下方法操作，制备样品溶液６份，在“２．２．１”项色谱
条件下进行测定，分别测得新绿原酸、绿原酸、异绿
原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异绿原酸Ｃ质量分数的ＲＳＤ
分别为３．７８％，１．４０％，２．７６％，２．１１％，２．０７％。
２．２．８　加样回收率试验　取已测定的平卧菊三七
（２０１２－６－２１）浸膏，精密称定，每份加入一定量的新
绿原酸、绿原酸、异绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异绿原酸
Ｃ对照品，按“２．２．２”项下方法操作，制备样品溶液
９份，在“２．２．１”项色谱条件下进行操作，结果平均
回 收 率 为１０９．９％，１０１．４％，９３．９％，１０４．２％，
１０５．９％；ＲＳＤ 为１．１２％，０．５９％，１．０３％，１．２２％，
１．０１％。
２．２．９　样品含量测定　取３个不同批号的平卧菊
三七浸膏，分别精密称定３份，按“２．２．２”项下方法
操作，制备样品溶液９份，在“２．２．１”项 ＨＰＬＣ条件
下测定，计算样品中５种成分３个批次的质量分数，
结果见表２。
表２　平卧菊三七中５种成分含量测定结果
Ｔａｂ　２　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　５　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｇｙｎｕｒａ　ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ
批号
新绿原酸
／μｇ·ｍｇ－１
绿原酸
／μｇ·ｍｇ－１
异绿原酸Ａ
／μｇ·ｍｇ－１
异绿原酸Ｂ
／μｇ·ｍｇ－１
异绿原酸Ｃ
／μｇ·ｍｇ－１
２０１２－９－６　 ０．１３　 ２．７９　 ２．５０　 ０．４９　 １．１５
２０１２－６－２１　 ０．１２　 ２．６９　 ３．１０　 ０．５３　 １．３１
２０１２－６－１４　 ０．１２　 ２．７５　 ２．６６　 ０．５０　 １．２２
２．３　一测多评法方法学考察
２．３．１　相对校正因子的计算　参照文献［１３］方法，
以多个质量浓度点来计算相对校正因子（ｆｋ／ｓ），计算
方程为：ｆｋ／ｓ＝（Ｃｓ×Ａｋ）／（Ｃｋ×Ａｓ），待测成分质量
浓度计算方程为：Ｃｋ′＝（Ｃｓ×Ａｋ′）／（ｆｋ／ｓ×Ａｓ），其中
Ａｓ为参照物１色谱峰的面积，Ｃｓ为参照物１的浓度，
Ｃｋ为参照物２的浓度，Ａｋ′为待测组分色谱峰峰面
积，Ｃｋ′为待测组分质量浓度，Ａｋ为参照物２色谱峰
的峰面积，结果如表３。
表３　以绿原酸为内标物的ｆｋ／ｓ
Ｔａｂ　３　ｆｋ／ｓｗｉｔｈ　ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ　ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
质量浓度
／ｍｇ·ｍｌ－１
异绿原酸Ｃ异绿原酸Ａ异绿原酸Ｂ 新绿原酸
０．０３４　 １．１９　 １．０１　 ０．９７　 ０．９１
０．０４６　 １．２４　 １．０８　 １．０６　 ０．９１
０．０５８　 １．１３　 １．０６　 １．０３　 ０．９５
０．０６９　 １．２４　 １．０９　 １．０５　 ０．９２
０．２３０　 １．２６　 １．１１　 １．１０　 ０．９８
平均值 １．２１　 １．０７　 １．０４　 ０．９３
ＲＳＤ／％ ４．２４　 ３．５６　 ４．３８　 ３．１６
２．３．２　ｆｋ／ｓ重复性考察　本研究在２个实验室不同
·０１０２· 中国医院药学杂志２０１５年１１月第３５卷第２２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｎｏｖ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２２
ＨＰＬＣ系统：ＤＩＯＮＥＸ　ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００，
及不同的色谱柱ＤＩＯＮＥＸ　Ｃ１８、ＷＡＴＥＲＳ　Ｃ１８对ｆｋ／ｓ
进行考察，其ＲＳＤ＜３．１２％。这表明本研究所建立
的分析条件具有良好的重复性。
２．３．３　待测组分色谱峰的定位
（１）利用相对保留时间（ＲＴ）差定性：知道内标
峰的保留时间，加上相对保留时间差，再根据峰形判
断，即能够正确判断出目标峰的准确位置。根据何
兵［１１］的文献报道，利用绿原酸与最后一个高峰（异
绿原酸Ｃ），两点校正，推导其校正方程，以ＤＩＯＮＥＸ
Ｃ１８、ＷＡＴＥＲＳ　Ｃ１８色谱条件下绿原酸保留时间、异
绿原酸Ｃ保留时间为自变量，其他色谱柱在相同条
件下实测的绿原酸保留时间和异绿原酸Ｃ保留时
间为因变量，建立校正方程。再将其他各成分（新绿
原酸、异绿原酸 Ａ和异绿原酸Ｂ）的实测保留时间
代入前述校正方程，即可算出该色谱条件中各成分
的理论保留时间，将之与实测色谱峰对比即可并判
断对应色谱峰的归属。
（２）一测多评法、外标法含量测定结果对比：
混合对照品和样品溶液在“２．２．１”项 ＨＰＬＣ条件下
进样１０μｌ，采用外标法以及一测多评法计算平卧菊
三七中５种绿原酸类成分（新绿原酸、绿原酸、异绿
原酸Ａ、异绿原酸Ｂ、异绿原酸Ｃ）的含量。２种手段
测得的各成分含量基本一致，结果见表４。由此可
见，一测多评在平卧菊三七的多指标成分质量评价
中应用是可行的，由于一测多评法的准确度与物质
的含量相关，且待测峰与参照峰的距离也能影响测
定的准确度，由于异绿原酸Ｂ含量较低，且距离参
照峰绿原酸较远，因此其一测多评结果与真实值略
有差异。
表４　２种方法中４个组分测定含量的结果（μｇ·ｍｇ
－１）
Ｔａｂ　４　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　４　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｂｙ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ （μｇ·
ｍｇ－１）
批号 方法 异绿原酸 Ａ 异绿原酸Ｂ 异绿原酸Ｃ 新绿原酸
２０１２／６／２０ 外标法 ２．４６　 ０．４９　 １．１３　 ０．１２
一测多评法 ２．４７　 ０．３２　 １．０４　 ０．１２
２０１２／６／２１ 外标法 ２．８９　 ０．５１　 １．２３　 ０．１２
一测多评法 ２．９５　 ０．３５　 １．１６　 ０．１２
２０１２／６／１４ 外标法 ２．６２　 ０．４９　 １．１９　 ０．１２
一测多评法 ２．６２　 ０．３１　 １．１１　 ０．１２
３　讨论
在制备体系中，我们对比了乙腈－水和乙腈
－０．１％磷酸水溶液系统，结果采用乙腈－０．１％三氟
乙酸水溶液洗脱系统在高浓度进样情况下，洗脱分
离效果最好，理论塔板数最高，节省了制备时间及成
本；在分析体系中，乙腈－０．１％三氟乙酸水溶液洗脱
体系在调节乙腈比例，洗脱时间及流速，都未能使异
绿原酸Ａ、异绿原酸Ｂ与异绿原酸Ｃ之间有效分
离，而使用乙腈－０．１％磷酸水溶液洗脱体系，在延长
系统时间，微调乙腈比例，使得难分离的同分异构体
分离度高。同时比较了超纯水、９８％甲醇、５０％甲醇
三种提取溶媒，结果５０％的甲醇效果更优。
单独测定药材中某一成分含量耗时、耗力、效率
低、成本高，已不能满足中药材质量研究的需求，同
时测定多种成分含量的方法成为质量控制的有效方
法之一，本实验室所建立的条件为绿原酸类及其相
似成分的分离提供了参考。
随着平卧菊三七的应用逐步增多，仅控制其中
绿原酸的含量显然不能真实地评价药物的内在质
量，而采用一测多评法，在一定线性范围内，成分的
量与检测器响应成正比，通过使用一种常见对照品
同时测定其他４种组分的含量，能全面而真实地评
价平卧菊三七的质量。
参考文献：
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［９］　蒋娟娟，徐德然，濮社班，等．菊三七地下部分的化学成分
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［１０］李淼，王永香，孟谨，等．ＨＰＬＣ法测定金银花中新绿原酸等
８种成分的量［Ｊ］．中草药，２０１４，４５（７）：１００６－１０１０．
［１１］何兵，刘艳，杨世艳，等．ＨＰＬＣ一测多评法同时测定双青咽
喉片中１０种成分［Ｊ］．中草药，２０１３，４４（８）：９７４－９８１．
［１２］陆兔林，石上梅，蔡宝昌，等．基于一测多评的中药多成分定
量研究进展［Ｊ］．中草药，２０１２，４３（１２）：２５２５－２５２９．
［１３］王智民，高慧敏，付雪涛，等．“一测多评”法中药质量评价模
式方法学研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００６，３２（２３）：１９２５－１９２８．
［收稿日期］２０１５－０３－３０
·１１０２·中国医院药学杂志２０１５年１１月第３５卷第２２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｎｏｖ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２２