全 文 ：西北农业学报　２０１５，２４（８）：８４－９１
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１５．０８．０１４
网络出版日期：２０１５－０８－０４
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１５０８０４．１７１６．０１４．ｈｔｍｌ
橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达
收稿日期：２０１４－０８－０７　　修回日期：２０１４－１０－２２
基金项目：国家自然科学基金（３１３６００６０）。
第一作者：王秀珍，女，在读硕士，从事植物转基因的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｚ８３６３６５＠１６３．ｃｏｍ
通信作者：闫　洁，女，副教授，主要从事生物化学与分子生物学的教学与研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｅｙ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
王秀珍，赵丽娟，赵李婧，李永梅，袁彬青，闫　洁，祝建波
（新疆石河子大学 生命科学学院，新疆石河子　８３２０００）
摘　要　克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因，对其进行生物信息学分析，构建该基因的原核表达载
体，在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白，为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基
础。采用同源克隆法结合ＲＴ－ＰＣＲ技术获得目的基因，测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体ｐＥＴ－
３０ａ中，转化大肠杆菌ＢＬ２１并诱导表达。结果表明：该基因开放阅读框为９２７ｂｐ，编码３０８个氨基酸，推测
的蛋白分子质量为３４．９ｋｕ，理论等电点为８．７４；具有ｃｉｓ－异戊烯基转移酶的５个高度保守区，属于ｃｉｓ－ＩＰＰＳ
ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ蛋白家族；系统进化树表明，橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近；经ＩＰＴＧ
诱导和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测，所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见，利用 ＲＴ－ＰＣＲ
技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因，成功构建原核表达载体，并使其在大肠杆菌中得到表达。
关键词　橡胶草；顺式异戊烯转移酶；序列分析；原核表达
中图分类号　Ｑ７８　　　文献标志码　Ａ　　　　　文章编号　１００４－１３８９（２０１５）０８－００８４－０８
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
Ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＴａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ
ＷＡＮＧ　Ｘｉｕｚｈｅｎ，ＺＨＡＯ　Ｌｉｊｕａｎ，ＺＨＡＯ　Ｌｉｊｉｎｇ，ＬＩ　Ｙｏｎｇｍｅｉ，
ＹＵＡＮ　Ｂｉｎｑｉｎｇ，ＹＡＮ　Ｊｉｅ　ａｎｄ　ＺＨＵ　Ｊｉａｎｂｏ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８３２０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ
Ｒｏｄｉｎ，ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｔｈｅ　ｇｅｎｅ’ｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ．Ｔｈｅ
ＴｋＣＰＴ１　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ
ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ＴｋＣＰＴ１　ｗｅｒｅ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ－３０ａ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１
ｗｅｒｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｆｔｅｒ　ｉｔｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１．Ｔｈｅ
ＴｋＣＰＴ１　ｇｅｎｅｓ’ｓ　ＯＲＦ　ｏｆ　９２７ｂｐ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｅｓ　３０８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｈａｄ　ａｎ
ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　８．７４ａｎｄ　ａ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　３４．９ｋｕ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｆｉｖｅ　ｈｉｇｈ－
ｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ，ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｉｓ－ＩＰＰＳ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＴｋＣＰＴ１　ｈａｄ　ｎｅａｒｅｓｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓ－
ｆｅｒａｓｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓ　ｂｙ　ＩＰＴＧ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－
ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ
ｔｈｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｂｙ　ＩＰＴＧ　ｉｎ　ＢＬ２１．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ；Ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ
　　橡胶草（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ），属
于菊科莴苣族蒲公英属植物，其根中含２０％以上
的橡胶（多年生的干质量），是世界主要产胶植
物之一［１］。原产于哈萨克斯坦共和国天山山谷和
中国新疆特克斯河流域，苏联中亚地区和欧洲也
有分布，橡胶草适应性强，干旱、盐碱地等仍可良
好生长［２］。
橡胶草，由于是草本植物，进行组织培养比木
本植物容易。在组织培养的基础上，容易建立遗
传转化体系。从产胶的分子生物学来看，橡胶草
乳管组织中可产生与巴西橡胶树橡胶结构和性能
相当的天然橡胶，是一种具有很大发展前途的产
胶植物［３］。同时，其产胶生理过程与巴西橡胶树
相似，作为产胶模式植物，可进行胶乳相关基因和
植物产胶机制的研究。从研究植物的萜类代谢来
看，橡胶草更是研究的好材料。橡胶草作为天然
橡胶替代作物，在获得战略橡胶的同时，可以得到
清洁能源乙醇和保健品菊糖［４］。因此，橡胶草不
仅在植物生物技术研究领域具有深远的科学意
义，而且在工业应用上具有很高的经济价值。
橡胶主要通过依赖于甲羟戊酸的植物类异戊
二烯次生代谢途径合成，是一个酶促的顺１，４－异
戊二烯聚合到长链异戊二烯橡胶分子的过程［５］。
橡胶的合成处于类异戊二烯生物合成的中心途径
以外的侧枝途径［６］，在橡胶体外合成试验中，存在
起始物链长效应，即始物碳链越长，橡胶合成速度
越快［７］。而顺式－异戊烯基转移酶催化异戊烯基
二磷酸（ｉｓｏｐｒｅｎｙｌｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＩＰＰ）多聚化形成
长链橡胶，决定橡胶分子大小，产胶量及橡胶的理
化性质，位于橡胶生物合成的最后一步，是天然橡
胶合成中最重要的关键酶之一［８］。
近年来，国外在橡胶草分子生物学方面研究
进展迅速，而中国在这方面的研究中断时间较长。
国内对橡胶草的研究早期集中在橡胶提取工艺和
橡胶含量测定方法的比较［９－１４］，近期也开展了少
量橡胶草组培技术［１５］和基因克隆分析的研究［１６］。
鉴于国内外对橡胶草研究的差距及中国天然橡胶
生产和消费现状，以及顺式－异戊烯基转移酶在
橡胶合成途径中的重要作用，本研究从橡胶草中，
克隆得到顺式－异戊烯基转移酶基因，对其进行
生物信息学分析和原核表达，为研究该基因的功
能和植物体内橡胶生物合成分子机制奠定理论
基础。
１　材料与方法
１．１　材 料
１．１．１　试验材料　橡胶草植株于２０１３年７月采
自新疆石河子市蘑菇湖水库边，移栽至温室培养。
１．１．２　菌株与试剂　大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
ＤＨ５α、表达载体ｐＥＴ－３０ａ、表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）
均由石河子大学生命科学学院农业生物技术重点
实验室保存。植物总ＲＮＡ提取试剂盒购于艾德
莱生物公司，ｃＤＮＡ合成试剂盒和凝胶回收试剂
盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。Ｔ４
ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶购自ＴａＫａＲａ公司，
ｐＭＤ１９－Ｔ克隆载体、１０×Ｔａｑ　ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ、
Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ购自ＴＩＡＮＧＥＮ公
司。广谱彩虹预染蛋白 ｍａｒｋｅｒ购自北京康为世
纪生物科技有限公司。
１．２　方 法
１．２．１　新疆野生橡胶草总 ＲＮＡ的提取和ｃＤ－
ＮＡ的合成　参照ＥＡＳＹ　ｓｐｉｎ　Ｐｌｕｓ植物ＲＮＡ快
速提取试剂盒说明书提取新疆野生橡胶草叶片的
ＲＮＡ。ｃＤＮＡ的合成参照北京康为世纪生物科
技有限公司的ＳｕｐｅｒＲＴ　ｃＤＮＡ第１链合成试剂
盒中的说明书。
１．２．２　橡胶草ＣＰＴ１基因的克隆　 根据 Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ公布的橡胶草近源种短角蒲公英的３个顺
式－异戊烯基转移酶基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号分
别为：ＪＱ９９１９２５．１、ＪＱ９９１９２６．１、ＪＱ９９１９２７．１），
结合软件ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ５．０设计特异性引物。
Ｆ：５′－ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡ－
ＴＣＡＴＴＡＣ－３′，Ｒ：５′－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣ－
ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣ－３′
将已反转录成的新疆野生橡胶草ｃＤＮＡ为
模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ的反应体系参见Ｔａｑ
ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ说明书。ＰＣＲ 反应程序为：
９４℃ 预变性５ｍｉｎ，９４℃ 变性３０ｓ，５９℃退火
３０ｓ，７２℃ 延伸１ｍｉｎ，３０个循环；最后７２℃延
伸７ｍｉｎ；４℃保存。ＰＣＲ产物经１０ｇ／Ｌ的琼脂
·５８·８期 王秀珍等：橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达
糖凝胶电泳分离后，参照康为世纪凝胶回收纯化
试剂盒说明书回收目的条带，将回收的目的片段
与克隆载体ｐＭＤ１９－Ｔ　Ｖｏｃｔｅｒ连接，将连接产物
转化ＤＨ５α感受态细胞，挑取阳性克隆进行ＰＣＲ
鉴定，小量提取质粒经酶切鉴定正确后交由北京
华大基因公司进行测序。
１．２．３　橡胶草ＣＰＴ１ 基因序列分析和进化树构
建　利用 ＮＣＢＩ网站的 ＯＲＦ　Ｆｉｎｄｅｒ工具（ｈｔ－
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｏｒｆ／），
确定该基因的开放阅读框。利用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ工具（
ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）进行亲水
性／疏水性分析。用 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎｓ （ｈｔ－
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／
ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）预测蛋白的保守域。蛋白理化性质预
测用ＰｒｏｔＰａｒａｍ （ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ－
ｐａｒａｍ／）网站分析。利用 ＮＣＢＩ网站的 Ｂｌａｓｔｘ
（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）工具进行其
他物种的同源氨基酸搜索，利用ＤＮＡＭＡＮ软件
对同 源 氨 基 酸 进 行 多 重 比 对，Ｃｌｕｓｔａｌｘ 和
ＭＥＧＡ４．１软件构建系统进化树。
１．２．４　原核表达载体的构建　将ＰＥＴ－３０ａ（＋）
质粒和ｐＭＤ１９－Ｔ－ＴｋＣＰＴ１ 质粒分别用ＥｃｏＲⅠ
和ＸｈｏⅠ双酶切，双酶切反应体系为２０μＬ，其中
质粒１０μＬ，１０×Ｔ　Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ、ＥｃｏＲⅠ１μＬ、
ＸｈｏⅠ１μＬ，加灭菌蒸馏水至２０μＬ；反应条件为
３７℃、４ｈ。胶回收 ＰＥＴ－３０ａ（＋）载体片段和
ＴｋＣＰＴ１ 基因片段，之后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶于１６
℃连接过夜，将连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）
感受态细胞，在卡那霉素抗性的 ＬＢ平板上挑取
重组质粒，通过ＰＣＲ、双酶切筛选阳性克隆，并对
阳性克 隆 测 序 验 证 。构 建 成 功 的 表 达 质
粒 命 名 为ｐＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１ ，将测序正确的质
粒转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞。
１．２．５　重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析　把经鉴定含有重组质粒ｐＥＴ－
３０ａ－ＴｋＣＰＴ１ 的大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）接种于５０
ｍＬ　ＬＢ含 Ｋａｎ的ＬＢ液体培养基中，３７℃、２２０
ｒ／ｍｉｎ过夜培养后取０．５ｍＬ加入到５０ｍＬ含
Ｋａｎ的ＬＢ液体培养基中，３７℃、２２０ｒ／ｍｉｎ继续
振荡培养至ＯＤ６００为０．４～０．６时，加入ＩＰＴＧ使
终浓度达到０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，以不加ＩＰＴＧ为对照，
分别诱导表达１～６ｈ。诱导完成后，将经诱导表
达的菌液转入５０ｍＬ离心管中，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心
１０ｍｉｎ，收集菌体。弃上清，加入５ｍＬ磷酸缓冲
液，超声波破碎后离心去除破碎菌体，收集上清
液。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳参照文献［１７］的
方法进行。
２　结果与分析
２．１　橡胶草ＣＰＴ１的克隆
以新疆野生橡胶草叶片ｃＤＮＡ为模板，利用
特异性引物进行过ＰＣＲ扩增，得到目的条带（图
１）。将目的片段回收、连接克隆载体ｐＭＤ１９－Ｔ
连接，将连接产物转化ＤＨ５α感受态细胞，挑取阳
性克隆扩大培养，经菌液ＰＣＲ和双酶切鉴定正确
后测序。测序结果经 ＤＮＡＭＡＮ 软件分析，
ＴｋＣＰＴ１ 包含１个长９２７ｂｐ的完整开放阅读框。
比较ＴｋＣＰＴ１ 与短角蒲公英的３个顺式－异戊烯
基转移酶基因序列，发现其与ＴｂＣＰＴ１的一致性
最高，达到９８．１７％；与ＴｂＣＰＴ２、ＴｂＣＰＴ３的一
致性分别为９７．６３％，９６．９８％。比较ＴｋＣＰＴ１ 和
ＴｂＣＰＴ１的 ＯＲＦ序列，发现二者存在１７处碱基
差异，编码产物的氨基酸序列存在７个差异，氨
基酸序列一致性达９７．９６％。
２．２　橡胶草ＣＰＴ１基因的生物信息学分析
２．２．１　橡胶草ＣＰＴ１基因的序列分析　利用
ＯＲＦ　Ｆｉｎｄｅｒ工具分析显示，所克隆的ＴｋＣＰＴ１ 包
含１个９２７ｂｐ的完整开放阅读框，推导 ＯＲＦ编
码３０８个氨基酸（图２）。
　　Ｍ．ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒⅢ；１～６．ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物　ＲＴ－ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴｋＣＰＴ１　ｇｅｎｅ
图１　ＴｋＣＰＴ１ 基因的扩增
Ｆｉｇ．１　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＰＴ１ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ
Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ
２．２．２　蛋白质理化性质分析　利用ＥｘＰＡＳｙ在
线分析软件对推导的 ＴｋＣＰＴ１氨基酸序列进行
理化特性分析：橡胶草ＣＰＴ１蛋白质的分子式为
Ｃ１５７０Ｈ２４５１Ｏ４４７Ｓ１４；分子质量为３４．９０９　１ｋｕ；理论
·６８· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
等电点为８．７４，不稳定系数为３３．７２，属于稳定蛋
白，含 量 较 高 的 氨 基 酸 主 要 有 Ｌｅｕ（２８ 个，
９．１％）、Ｖａｌ（２４个，７．８％）、Ｇｌｙ（２３个，７．５％）、
Ａｓｎ（２２个，７．１％）；负电荷氨基酸残基（Ａｓｐ＋
Ｇｌｕ）的数目共有３１个，正电荷氨基酸残基（Ａｒｇ
＋Ｌｙｓ）的数目共有 ３５ 个，总平均亲水性为
－０．１７３。
＊终止密码子　Ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ
图２　ＴｋＣＰＴ１ 基因的ｃＤＮＡ序列及其推导的蛋白质氨基酸序列
Ｆｉｇ．２　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ｓｅｑｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＣＰＴ１ｆｒｏｍＴａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ
　　采用在线ＰｒｏｔＳｃａｌｅ软件对橡胶草ＣＰＴ１蛋
白进行亲水性／疏水性预测。由图３可知，多肽链
第８２位氨基酸最高分值为２．３２２，疏水性最强；
而在多肽链第１０９位氨基酸最低分值为－２．８１１，
亲水性最强。亲水氨基酸分布比较均匀，而且亲
水氨基酸数量比疏水性多，该蛋白为亲水性蛋白。
２．２．３　ＴｋＣＰＴ１蛋白二级结构和三级结构预测
分析　采用ＳＯＰＭＡ方法对 ＴｋＣＰＴ１蛋白的二
级结构进行预测，结果显示该蛋白由４５．７８％的
α－螺旋 （α－ｈｅｌｉｘ）、２０．７８％ 的 β－股 （β－ｓｔｒａｎｄ）、
３３．４４％的无规则卷曲构成。利用ＰＳＩＰＲＥＤ 在
线软件分析表明，该蛋白质共有１１个α－螺旋，６
个β－股和１８个无规则卷曲。通过ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤ－
ＥＬ在线软件，预测其三级结构（图４），可以看出
结果与二级结构预测基本一致，从而进一步验证
结构的正确性。
２．２．４　橡胶草ＣＰＴ１结构域与氨基酸同源性分
析　用ＣＤＤ软件分析该蛋白的保守结构域，结果
表明，ＣＰＴ１与十一异戊烯基二磷酸合酶（ｕｎｄｅ－
ｃａｐｒｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＵＰＰＳ）都是异戊
烯基二磷酸合酶 （ｉｓｏｐｒｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎ－
ｔｈａｓｅ，ＩＰＰＳ），它们的功能是催化ＩＰＰ与其异构
体二甲基烯丙基二磷酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｙｌｄｉｐｈｏｓ－
ｐｈａｔｅ，ＤＭＡＰＰ）缩合反应得到牻牛儿基二磷酸
（ｇｅｒａｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＧＰＰ），并在此基础上陆续
加入ＩＰＰ单位而得到不同异戊烯类化合物。这
类酶的通俗名称为异戊烯基转移酶（ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓ－
ｆｅｒａｓｅ）。ＩＰＰＳ又可分为催化合成反式双键的反
式异戊烯基转移酶（Ｅ－ＩＰＰＳ）和催化合成顺式双
键的顺式异戊烯基转移酶（Ｚ－ＩＰＰＳ）。ＣＰＴ１属于
Ｃｉｓ（Ｚ）－Ｉｓｏｐｒｅｎｙｌ　Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ （ｃｉｓ－
ＩＰＰＳ）超级家族（图 ５）。在原核生物中，ｃｉｓ－
ＩＰＰＳ，ＵＰＰ合酶在细菌细胞壁肽聚糖的生物合成
中催化载体脂质ＵＰＰ的形成。类似地，在真核生
物中，ｃｉｓ－ＩＰＰＳ，ＵＰＰ合酶在异戊二烯糖基载体脂
质中催化多萜醇基磷酸的形成。
通过 ＢｌａｓｔＰ进行同源性搜索，应用 ＤＮＡ－
ＭＡＮ软件进行氨基酸序列比对分析。多重比较
结果显示橡胶草ＣＰＴ１基因编码的蛋白与短角蒲
公 英（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）ＴｂＣＰＴ　１
·７８·８期 王秀珍等：橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达
图３　ＴｋＣＰＴ１ 基因编码蛋白的氨基酸序列疏水性／亲水性预测
Ｆｉｇ．３　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＴｋＣＰＴ１ｆｒｏｍＴａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ
（ＡＧＥ８９４０３．１）、ＴｂＣＰＴ２（ＡＧＥ８９４０４．１）和 Ｔｂ－
ＣＰＴ３（ＡＧＥ８９４０５．１）的氨基酸序列一致性分别
为９７．９６％、９７．０８％和９６．１０％；与橡胶树（Ｈｅｖ－
ｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）Ｈｐｔ１（ＡＡＭ９２８８０．１）和 Ｈｐｔ２
（ＡＡＭ９２８８１．１）的氨基酸序列一致性分别为
５１％和５０％；与碧桃（Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ）ＰＲＵＰＥ＿
ｐｐａ００９４９５ｍｇ（ＸＰ＿００７２００５３５．１）和油菜（Ｂｒａｓ－
ｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）ＢｎａＡ１０ｇ１３２８０Ｄ（ＣＤＹ３１５４３．１）的氨
基酸序列一致性分别为５３．７２％和４４．３４％。橡
胶草ＣＰＴ１具有所有的ｃｉｓ－ＩＰＰＳ家族都具有５个
高度保守区域（图６），这些序列的出现有重要功
能：Ⅰ区（Ｐ－ＬＯＯＰ结构）是一个磷酸结合环，其功
能是结合和转换法呢基二磷酸（ｆａｒｎｅｓｙｌｄｉｐｈｏｓ－
ｐｈａｔｅ，ＦＰＰ）的磷酸基团；Ⅲ区识别ＩＰＰ的正确定
位以及催化活性，并且在橡胶链延伸过程中需要
Ⅲ区和Ⅴ区。
２．２．５　橡胶草ＣＰＴ１的系统进化树分析　应用
ＣｌｕｓｔａｌＸ　２和ＭＥＧＡ　４．１软件对１　４个物种氨基
图４　ＴｋＣＰＴ１蛋白三级结构同源建模
Ｆｉｇ．４　３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＴｋＣＰＴ１ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ｂｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｂａｓｅｄ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ
图５　ＴｋＣＰＴ１保守结构域的预测结果
Ｆｉｇ．５　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ＣＰＴ１ｆｒｏｍＴａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ
·８８· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
酸序列建立系统发育树，结果表明橡胶草ＣＰＴ１
与短角蒲公英和橡胶树的顺式异戊烯基转移酶具
有较近的亲缘关系，与短角蒲公英ＴｂＣＰＴ１蛋白
亲缘关系最近并在同一分支上（图７）。
２．３　原核表达载体的构建及鉴定
重组质粒ｐＭＤ１９－ＴｋＣＰＴ１ 用ＥｃｏＲⅠ／Ｘｈｏ
Ⅰ酶切，定向插入经ＥｃｏＲⅠ／ＸｈｏⅠ酶切的原核
表达载体ｐＥＴ－３０ａ（＋）中，构建表达质粒ｐＥＴ－
３０ａ－ＴｋＣＰＴ１ ，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，挑
取阳性克隆进行菌液ＰＣＲ，提取阳性质粒进行
ＥｃｏＲⅠ／ＸｈｏⅠ酶切鉴定（图８），鉴定结果表明
ＴｋＣＰＴ１ 基因已成功克隆入ｐＥＴ－３０ａ（＋）原核表
达载体中，说明成功构建表达质粒。
Ｉ～Ｖ．顺式异戊烯基转移酶的５个保守区　Ｔｈｅ　ｆｉｖｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ
图６　ＴｋＣＰＴ１氨基酸与其他物种氨基酸序列比对
Ｆｉｇ．６　Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ
ｆｒｏｍＴａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅｓ
标尺上面的数字代表遗传距离　Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｕｌｅｒ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅｓ
图７　橡胶草与其他科属植物ＣＰＴ基因氨基酸的系统树
Ｆｉｇ．７　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ＣＰＴｇｅｎｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
·９８·８期 王秀珍等：橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达
　　Ｍ．ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒⅢ；１～２．ＰＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１ 质粒经ＥｃｏＲ
和ＸｈｏⅠ双酶切结果　Ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥｃｏＲⅠ／ＸｈｏⅠ；３．阳性质
粒对照　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ
图８　ＰＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１ 质粒酶切鉴定
Ｆｉｇ．８　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１　ｐｌａｓｍｉｄ
ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｕｔ
２．４　ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳
经ＩＰＴＧ诱导后提取菌体总蛋白进行ＳＤＳ－
聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图９所示，随着时间
的延长，大小约为３４．９ｋｕ的蛋白的含量增加，在
６ｈ时表达量最高。说明ＴｋＣＰＴ１ 基因在大肠杆
菌中成功表达。
　　Ｍ．蛋白 ｍａｒｋｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒ；１～６．
ＩＰＴＧ诱导表达１～６ｈ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１ ；ＣＫ．对照
　Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ　ｐＥＴ－３０ａ－ＴｋＣＰＴ１
图９　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测ＴｋＣＰＴ１蛋白表达
Ｆｉｇ．９　ＴｋＣＰＴ１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
３　结论与讨论
植物萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的
一大类植物天然产物，橡胶是含有多于８个异戊
二烯单位的多贴类化合物。在橡胶合成过程中，
ＣＰＴ是一种与橡胶粒子紧密结合的膜蛋白，催化
ＩＰＰ掺入到聚异戊烯链上形成长链橡胶，直接决
定橡胶分子的大小。目前，顺式－异戊烯基转移酶
基因在红褐肉座菌、大肠杆菌、克氏锥虫、拟南芥、
酿酒酵母和人类等中被克隆出来。Ａｓａｗａｔｒｅｒａ－
ｔａｎａｋｕｌ等［１８］从橡胶树胶乳中分离到的ＨＲＴ１
和ＨＲＴ２ ，２个ｃＤＮＡ核苷酸相似性为９２％，氨
基酸相似性为８７％，且与大肠杆菌、酿酒酵母、拟
南芥等的氨基酸相似性都不小于３０％。罗明武
等［１９］从橡胶树胶乳特异表达基因差减文库筛选
到的ＣＰＴ基因，编码２９０个氨基酸，分子量约为
３２．９ｋＤａ，等电点为７．２，含有ｃｉｓ－异戊烯基链转
移酶的５个高度保守区。Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ等［２０］通过细
菌ＵＰＰＳ的Ｘ射线衍射图分析该酶的三维结构
后，发现Ｚ－ＩＰＰＳ是以同型二聚体的形式存在，每
个亚基由α－螺旋以及二聚体内部中心部位的１０
个β－折叠构成。橡胶草ＣＰＴ１蛋白的三维结构预
测和氨基酸序列比对表明，该蛋白与其他物种
ＣＰＴ的结构基本相符，这进一步说明橡胶草
ＣＰＴ１是一个在萜类生物合成途径中起作用的功
能蛋白。
到目前为止，人们对ｃｉｓ－ＩＰＰＳ的链长决定机
制还不十分清楚，一些报道说自然状态下ｃｉｓ－
ＩＰＰＳ产物链长特异性受环境因素的影响，可能与
酶自身空间结构有关［２１］。由于橡胶生物合成机
理的复杂性，对于顺１，４－异戊二烯聚合成橡胶分
子的详细过程还知之甚，橡胶生物合成可能存在
共同的机制，不同植物橡胶生物合成分子机理及
橡胶分子质量大小决定机制的研究结果可相互借
鉴与印证［２２］。因此，掌握橡胶草ＣＰＴ１的功能以
及进一步鉴定与ＣＰＴ１互作的蛋白将有助于更好
的了解和调控橡胶的生物合成。
本研究利用 ＲＴ－ＰＣＲ 从橡胶草中成功克隆
得到１个顺式异戊烯基转移酶基因，与已报道的
其他植物的同一基因相比，编码区基本一致。序
列分析表明，该基因具有顺式异戊烯基转移酶的
５个高度保守的区域。将ＴｋＣＰＴ１ 基因与原核
表达载体ｐＥＴ－３０ａ构建融合表达载体，并成功地
在大肠杆菌ＢＬ２１中实现表达，为橡胶草ＣＰＴ１
蛋白功能研究提供理论基础。
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·０９· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
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ｎｅｓｅ）．
［１１］　ＬＩ　Ｚｅｎｇｇｕｉ（李增贵），ＣＨＥＮＧ　Ｂｏ（程　溥）．Ａｌｋａｌｉｎｅ－
Ｈｅａｔｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｔａ－
ｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ －Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ　Ｒｏｏｔｓ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ
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Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［１２］　ＬＩＮ　Ｚｈｏｎｇｘｉａｎ（林仲贤）．Ａｌｋａｌｉｎｅ－Ｈｅａｔｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　Ｄｅ－
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ
Ｒｏｄｉｎ－Ｏｎｒ　ｏｒ　Ｔｗｏ　Ｙｅａｒｓ　Ｆｒｅｓｈ　ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｗｏｒｌｄ
（化学世界），１９５４，９（５）：２１３－２１４（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
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ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｅｔｉｎ（科学通报），１９５１，２（３）：２６０－２６５（ｉｎ　Ｃｈｉ－
ｎｅｓｅ）．
［１４］　ＬＵＯ　Ｓｈｉｗｅｉ（罗士苇），ＷＵ　Ｘｉａｎｇｙｕ（吴相钰），ＦＥＮＧ　Ｗｕ
（冯　午）．Ｓｉｍｐｌｅ　ａｓｓａｙ　ｒｕｂｂｅｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－
ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｅｔｉｎ（科学通报），
１９５１，２（７）：７４３－７４４（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［１５］　ＬＵＯ　Ｃｈｅｎｇｈｕａ（罗成华），ＹＡＮ　Ｊｉｅ（闫　洁），ＺＨＵ　Ｊｉａｎｂｏ
（祝建波）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓ－
ｔｅｍ　ｏｆ　Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ　Ｒｏｄｉｎ［Ｊ］．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｈｏｒｔｉ－
ｃｕｌｔｕｒｅ（北方园艺），２０１２（７）：１１５－１１９（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．
［１６］　ＡＮ　Ｆｅｎｇ（安　锋），ＬＩＮ　Ｗｅｉｆｕ（林位夫），ＸＩＥ　Ｇｕｉｓｈｕｉ（谢
贵水），ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ
Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｃｒｏｐｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｃｒｏｐｓ（热带作物学报），２０１２，３３（６）：１１３４－１１４１
（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［１７］　Ｐｅｎｇ　Ｙ，Ｈｕａｎｇ　Ｑ，Ｚｈａｎｇ　Ｒ　Ｈ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ＤＣ－４ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｄｏｕｃｈｉ，ａ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｆｏｏｄ［Ｊ］．Ｃｏｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏ－ｃｈｅｍ
Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００３，１３４（１）：４５－５２．
［１８］　Ａｓａｗａｔｒｅｒａｔａｎａｋｕｌ　Ｋ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｗ，Ｗｉｔｉｔｓｕｗａｎｎａｋｕｌ　Ｄ，ｅｔ
ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｈｅｖｅａ　ｂｒａ－
ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ．Ａ　ｋｅｙ　ｆａｃｔｏｒ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｎａｔｕｒａｌ　ｒｕｂｂｅｒ　ｂｉｏ－
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００３，２７０（２３）：４６７１－４６８０．
［１９］　ＬＵＯ　Ｍｉｎｇｗｕ（罗明武），ＤＥＮＧ　Ｌｉｕｈｏｎｇ（邓柳红），ＹＩ　Ｘｉ－
ａｏｐｉｎｇ（易小平），ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＡ
Ｎｏｖｅｌ　Ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｂｏｔａｎｙ（热带亚热
带植物学报），２００９，１７（３）：２２３－２２８（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇ－
ｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）．
［２０］　Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｗ，Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃ－
ｔｕｒｅｏｆ　ｃｉｓ－ｐｒｅｎｙｌ　ｃｈａｉｎ　ｅｌｏｎｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ，ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌ
ｄｉｐｈｏｓ－ｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００１，
９８（５）：４３３７－４３４２．
［２１］　Ｗａｎｇ　Ｋ　Ｃ，Ｏｈｎｕｍａ　Ｓ．Ｉｓｏｐｒｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅｓ
［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，２０００，１５２９（１／３）：３３－４８．
［２２］　ＤＡＩ　Ｌｏｎｇｊｕｎ（代龙军），ＺＥＮＧ　Ｒｉｚｈｏｎｇ（曾日中）．Ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｒｕｂｂｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｕｂｂｅｒ－
Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ（植物生理
学报），２０１３，４９（１０）：１０００－１００８（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ
ａｂｓｔｒａｃｔ）．
·１９·８期 王秀珍等：橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达