全 文 ：分子植物育种 , 2 0() 7 年 , 第 5 卷 ,第 6 期 ,第 7 65一 6 70 页
M o l e e u lar P lan t B er
e d in g
,
200 7
,
V o l
.
5
,
N o石 , 76 5一 67 0
研究报告
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e P o rt
播娘篙蛋白酶抑制剂基因 D 、刀2 转化油菜的研究
杜文明 管荣展 ` 王建飞 张红生 唐三元 董海滨
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 , 21 0 0 95
。 通讯作者 , 即助汕@句au .e du · cn
摘 要 通过播娘篙角果的 c D N A 文库克隆测序 , 得到 1个蛋白酶抑制剂基因序列 , 命名为 sD 刀2 。 该基因
编码一个含有 10 个氨基酸残基肤链 , 含有保守活性位点环“ CAP R正 P SF C ” 。 利用农杆菌介导 ,将 sD IZT 导
入甘蓝型油菜品系 N J54 2 4 中 。 P C R 和 RT 一 PC R 检测证明外源基因已导入到油菜基因组中 ,且能正常表达 。
酶活性分析表明 ,转基因油菜叶片蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性明显高于对照 。 初步抗
虫实验表明 , 喂食转基因油菜叶片的菜青虫幼虫生长缓慢 、 死亡率升高 。
关健词 sD IT Z基因 , 播娘篙 , 抗虫 , 油菜
Sut d ie s o n T r an s fo r l l l at i o n o f a S e ir n e P or t e in a s e I n h ib i t o r G e n e sD 7了2 fr o m
D e s e u而 n i a Sop h at in t o B r as s ic a n叩。 L ·
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t u ar l U n l v日 rs ity, N anj 吨 , 21 0 95
. C o r e spo n d in g
a u t h o r, 邵坦 n汕@ nj au .目 u . cn
A b s t r a c t A fu l l
一
l e n gt h e D N A e n e o d i n g a Por et i n a s e Ihn ib iotr 口D g e n e , de s ign at e d as D e s euar in i a s o Ph i a t乃甲s i n
In h lb iotr
一
2 (肠 7了2 ) , w as i s o laet d for m D . SoP h i a s i l iqu e e D N A l ib r田y . hT e e D N A e n e o d e s a P o lyP etP ide o f 10 0
am in o ac id er s idu
e s e o n at i n i n g a e o n s e vr e d r e ac it v e s iet o f
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DS 刀2 wa s int e gr aet d i n t o het r叩 e s e e d ge n o m e
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e x atr e t s s h o w e d h ihg 让由ib l t o yr ac it vi yt ot w ar d s t l冲 s i n an d e hym o tr y P s in . hi s e e -t fe e d i n g b i o as say er su lst sh ow e d
a而 ge n i a (凡 irS 呷 ae L · ) lvar ae er aer d w iht tr a n s g e in e P lant l evae s gr e w s low ly a n d w e er o f hi hg m o art l iyt art e .
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o r ds 肠刀2 ge en , eD : 。 u而 n 她 S叩h奴 hi se ct er is atn ce , R a p e se ed (B srQ o ic a n甲 us L )
丝氨酸蛋白酶抑制剂主要分布于十字花科 、 禾 到蛋白酶抑制剂基因 M IT es Z , 已经证明 M IT es Z 对鳞
本科 、 豆科的种子和茄科的块茎中 , 按照结构特点将 翅目害虫具有抗性 ( de eL o et al . , 1998 ; 2 0 01 ) ;甘蓝型
其至少分为八类 (oK iwa et .al , 19 9 7) 。 丝氨酸蛋白酶 油菜中也分离得到蛋 白酶抑制剂基 因 R IT , 它与
抑制剂的生理功能主要有以下方面 : 在休眠期调控 M IT ` 2 都具有抑制蛋白酶活性的功能 ;在拟南芥中 ,
种子的内源蛋白 , 维持蛋白代谢 , 作为储藏蛋白 , 抑 也 已经鉴 定 了 7 个 蛋 白酶 抑 制剂 ( lC au s s a n d
制寄生虫和害虫蛋白水解酶活性 。 蛋白酶抑制剂是 M ict he n 一ol ds , 2 004) 。 十字花科植物的蛋白酶抑制剂
植物抵御草食性害虫的主要策略之一 , 蛋白酶抑制 基因 , 在生物学特性和结构上不 同于其他科物种蛋
剂抗虫机理是抑制昆虫幼虫肠道 内的蛋白消化酶 , 白酶抑制剂的特征 , 故将其命名为 M sl 基因家族 (de
破坏肠道的皮膜内层 。 昆虫因缺乏消化蛋白酶将导 eL o et .al , 200 6) 。
致发育延迟和高死亡率 (C ec i et .al , 2 003 ) 。 因此蛋白 本研究中 , 首次克隆得到了一个蛋 白酶抑制剂
酶抑制剂基因的遗传转化研究受到了学者们的重 基因 。 为明确其功能 , 将其导入甘蓝型油菜中 , 进行
视 。 在十字花科植物中 , 最早野生植物白芥中分离得 了基因表达和酶活性分析 , 初步明确了播娘篙蛋白
基金项 目:作物遗传与种质创新国家重点实验室资助 (Z W 20 02 O01 )
分子植物育种
M o le c ul ar P lant B er
e din g
酶抑制剂基因的功能 。
1 材料和方法
L l 植物材料
播娘篙 e(D s o u而 n她 oSr ih a) 种植于南京农业大学江浦试验田 , 收集其成熟期末期的角果 , 液氮冷
冻 ,保存于 一80 ℃中 , 以备下步工作使用 。 双低油菜
品系 NJ 54 2 4 作为转基因材料 。
1 .2 sD Z’2I 甚因的克隆
利用 S M A[ 丑 T加 技术构建了播娘篙角果的 c D -
N A 文库 (董海滨等 , 2 0 ;5 D on g et .al , 2006 ) , 通过大
量文库 克隆测序 , 得 到 D sT IZ 基 因 。 分别使用
D N A s s i st 2
.
0 和 S ign a l P 2 . 0 (h tP : / g en o m e . e b s . d ut .
dk) 软件进行核普酸序列分析和信号肤预测 。 分别使
用 C l u s at l X 件 e sr ion 1 . 8 )和 T er e v iew 件e sr i o n 1 . 6 )
软件多重氨基酸序列比对和用于系统发生树分析 。
13 转化油菜
构建植物转化载体 p c A M旧 IA 13 l0 es D S IZT , 含有筛选标记潮霉素基因 , 以 C a M V 35 为启动子 。 按照
本实验室的油菜转基因方法 (D u et al , 20 07) 获得转化
体 ,然后对转基因油菜进行 P C R检测 。
用 P C R 检测 sD IZT 的引物为 : P , (5’ 一G A T G C C -
T A T G A C A A T G A A G T一 3 ) 幼 d P: (5 一G A T G C C T A T -
G A c A A T G A A G T一 3 )
,扩增产物为 34 如 。 Pc R 程序
为: 9 4 ℃预变性 5 m in ; 9 4 ℃变性 30 5 , 54 ℃退火 1 m in,
72℃延伸 1 m in , 30 个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 ~
。 同
时检测潮霉素基因 , 扩增程序为 : 94 ℃预变性 5 ~ ;
9 4 ,C变性 4 0 5 , 5 4 ,C 退火 4 0 5 , 7 2 oC 延伸 1 m in , 3 5
个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 m i n 。 引物为 : P , ( 5一 A T -
G A A A T C A CG C C A T G T A G T一 3’ )和 几 (5 一 A C T A T C -
c T c oc
A A G A C c T
一 3’ )。 为进一步检测转基因油
菜 sD Z’I 2 基因的表达情况 , 提取 P CR 检测阳性的转
基因植株的总 R N A 进行半定量 RT 一P C R 分析 (T an g
et .al
,
20 07 )
。 采用北京天为公司的 T ir比0 1试剂提取油
菜叶片的总 RN A , 用 P r o me ga 公司的反转录试剂盒
合成 c D N A 。 sD 刀 2 基因扩增引物如上所示 。 以 E F一 I a
作为对照 , 正义引物和反义 引物如下 : 5’ 一 A G A C -
C A C C A A G T A C T A C T G C A C一 3’ 和 5’ 一 C C A C -
C A A T C 飞, T G T A C A CA T CC 一 3 ’ 。
L 4 sD 万’I 2 的转化体改活性实验
将转基因植株和对照的叶片在液氮 中磨成粉
末 ,在提取缓冲液中 4 ℃浸提 l h 。 4 ,C T , 12 o o o x g ,
离心 30 m in 弃去沉淀 , 保留悬浮液 (柳武革和薛庆
中 , 200 3) 。 以牛血清蛋白作为对照 ,测定总蛋白含量 。
通过不同量的 sD 夕72 和胰蛋白酶 、 糜蛋白酶进行反
应测定 sD IZT 的活性 。 分别以 B A pN A 和 B TE E 为底
物 , 测定胰蛋白酶和糜蛋白酶剩余活性来分析 sD 刀 2
的活性 。 不同浓度的 sD IZT 和胰蛋白酶或糜蛋白酶在 37 ℃下反应 10 m in , 加入反应底物 。 测定在 41 0
(或 2 5 6 ) mn 下吸光值 , 分析酶活性变化 (B a e o n e t a l
· ,
19 9 5 )
。 每个实验重复 3 次 。
L S 初步抗虫性实验
为了检测转基因植株是否有抗虫性 , 取幼嫩叶
片和 5 只菜青虫幼虫放到培养皿中 , 重复 4 次 。 培养
7 天 , 统计死亡情况和存活幼虫的重量 。 对照实验中 ,
选取同期生长的野生型植株系统部位叶片 。
1.6 农艺性状观察
T
, 代植株种植于南京农业大学江浦试验站 , 经过
PC R 检测 , 调查转基因和野生型植株主要农艺性状 。
2 结果分析
.2 1 sD Z’2I 的序列分析
筛选播娘篙角果 c D N A 文库 , 得到一条全长 cD -
N A 序列 ,命名为 sD 刀 2 。 sD 刀2 c D N A 核昔酸序列全
长为 4 2 b p , 3 , 端含有 p ol y( A )序列 , 夕端呈现 m RN A
典型的帽子结构 。 含有完整 303 bP 的开放阅读框
(O盯 ) , 编码 10 个氨基酸残基组成的肤链 , 分子量
为 1 . 26 kD , 理论等点电为 .6 26 。 sD IT Z编码的蛋白
与十字花科蛋白酶抑制剂基因编码的氨基酸序列进
行同源性比较 (图 l) , 与 M sl 家族的 A ” , 2 、 M-IT 2、
R IT 3相似性分别为 69 % 、 63 %和 59 % 。 肠 2犯 编码蛋
白 N 端 2 9 个氨基酸含有一簇疏水性残基 , 为信号
肤 , 它与 M T I一 2 前体 N 末端存在调控分泌到内质网
的信号肤是一致的仅o lp i e e l l a e t a l . , 2 0 0 0 ) 。 含有的保
守氨基酸序列“ C A卫R l 于 T ( s) F C ” , 该序列为反应活
性位点环 (图 l) 。 含有的 8 个半胧氨酸 , 形成蛋白正
确折叠所必需的 4 个二硫键 , 这与白芥 、 油菜 、 拟南
芥蛋白酶抑制剂结论一致 帐。 iw a et .al , 19 9 ;7 C ec il -
iha et .al
,
19 4)
。 因此 ,从序列特征看 , sD IZT 是蛋白酶抑制剂基因 。 利用邻接法对十字花科蛋白酶抑制
剂基因的氨基酸序列进行系统发生分析 (图 2) 。 系统
发生分析表明 , sD IT Z基因编码的氨基酸序列在进化
上与拟南芥的 A T T IZ 、 A T T 13 和 A T T 16 距离较近 。
播娘篙蛋白酶抑制剂基因 D sI TZ转化油菜的研究
76 7
S u td in e s oTa rn sf on r la t in o ofa S en刀 eP r oten ia e sI n h ib it r oGn e eS DZ’ Z I n it oB心 s c ia
图 l播娘篙蛋白酶抑制剂与其他十字花科植物蛋白酶抑制剂氨基酸序列比对结果
注 :蛋白酶抑制剂分别来自播娘篙 S ( D跳 ), 白芥 (M刀一Z p er eusr o r , P 26 7s o ; M T I一 2 , A A B 24 34 o ) , 油菜 (盯11 , e习科 30 5 ;盯 13 ,
e AJ 4 3 o 7 )
, 拟南芥(A T l l , e ^ 0 152 05 : A T T IZ , e A o 15 23 9 : ^ T T I3 , e A o l 53 18 ; A T T “ , e ^ G 15 19o ; AT I 6 , e ^ G 1524 2 ) ; 划线区
域为活性位点
F i g 叮 e 1 A l ign m ent o f ht e de du e e d D s T IZ Por te in iw ht er l a et d Por te in a s e ihn ib iot sr for m M S I fa m ily m e m b e sr
No :et p or et in as
e i曲 ibi ot sr ~ for
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她 5印h ia (肠刀 2 ) , S in aP is al ab 心怀乃卜2 Per c uz’s or, 2P 6 78 0 an d M刀 se Z, A A B 24 34 0) ,
Basr
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a n即 。 (R T l l an d 3 , C A J科 30 5 an d C A 4J 4 30 7 ) , A abr id卯占 is ht 以~ (AT l l
,
2
,
3
,
4 an d 6 ; C A G 1520 8
,
C A G 1523 9
,
C A G 15 3 18
,
C A G 15 190 an d C A G 1524 2 ) : T h e er ac iVt e s iet fo o P i s o v e -r lin e d
八J T 14
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A T T I3
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一 2
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图 2 肠 2TI 与十字花科蛋白酶抑制剂系统发生树 (蛋白酶抑
制剂基因同图 l)
r ig 叮e 2 N e ig h b o -r Jo in in g P h y lo g e n e it e tre e o f DS TIZ w iht
s e v e r .
a l M S I m e m b e rs (P
r o t e in a s e in l l ib i to r g e n e s are
s a t n e a s F ig u r e l )
.2 2 转基因再生植株的获得和鉴定
按照油菜转基因试验要求 , 经 4 个月组织培养
(图 3) , 从最初的 12 4 6 个转化外植体筛选得到 13 株
再生植株 。 以质粒为阳性对照 , 分别用 如 t 和 sD IZT
基因引物对 13 株再生植株进行 P C R 检测 。 阳性转
基因油菜中检测到了与 目标基因 彻 t 和 肠 2IT 大小
一致的条带 (图 4) , 得到 7 个转基因株 , 转化率为
0
.
5 6%
。
为了检测 sD 刀2 在不同 P C R 阳性植株的表达情
图 3 转基因油菜植株再生
注 : A : 筛选培养基上的外植体 ; :B 抗性小苗 ; :C 生根苗 ; D : 移
栽的再生苗
Fi g 叮 e 3 eR g e n ear it o n o f tr a n s g e in e P 1a n st in ar ep eS 以如
N o et : A : ExP l a n t s o n se le e it o n m e d i切 rn
.
B : eR
s i s at nt s h o ost ; C
:
oR
o itn g se e d lin g ; D : 。妞 n sP lan 招 d lt a n s g e n l c Pl an t
况 ,提取油菜叶片的总 RN A ,进行半定量 R T 一P C R 分
析 , 如图 5 所示 , 在转基因植株中可扩增到目的条
分子植物育种
M o leu e lr aP ln t aB e r
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- , 卜 - D s T IZ 一 5
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20 40 6() 80 A
D S刀2
图 4 转基因油菜的 CP R 检测
注 : A 和 :B 潮霉素磷酸转移酶基因和 肠刀2 基因的 P C R 检
测 ; M : DU 000 m四rk e r ; :P 阳性对照 ; W T : 野生型油菜 ; 肠n e
1~7 : 转基因油菜
Fi创re 4 CP R 叻 a 】y s e s o f 加劝 5 9周山 e ay Pe s e d P laD ts
N o te : A 叨 d B s h o w e d CP R de te e it o n re sul ts fo r h y gr o m y c in
p h o SP ho 加劝 s fe r出蜡 , sD l了2 g e o e , er 叮” c it v e ;ly M : D L 2 0() 0 m ar k -
;er :P po is it ve c o n 。。 ;1 W
I】, : iw ld t y P e ar P e se ed ; La n e l一:7 tr a n s -
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D s T IZ 、 b l
D s T IZ
一
2
D S T 12
一
5
V『r竺028460 20 40 60 80带 ,但转录水平存在差异 ;而对照中没有扩增带 。 因此 , sD 刀2 能够在转基因油菜基因中正常表达 。 D ST IZD S l l 2ǎ或合一^蓄蔺,及的月巴艺今口日分ǎ米à刘鹅架露谧扭瞩钱
23 醉活性分析
十字花科丝氨酸蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶和
(或 ) 糜蛋白酶具有相似的专一抑制活性 。 为了检测
sD 刀 2 编码产物活性 , 提取转基因植株 sD IT Z一2 和
sD 刀2 一5 的蛋白分析其对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑
制活性 (图 6) 。 如图 6 所示 , 转基因植株 sD IZT 一2 叶片
对 胰 蛋 白酶和 糜蛋 白酶 的抑制 活性分 别达 到
69
.
66%和 55 . 20% ,
分别是对照的 3 . 1 和 1 . 97 倍 ; sD Z’I 2 一万分别达
到 59 .0 5%和 58 . 95 % , 是对照的 .2 64 和 2 . 10 倍 。 可以
看出 , 随着 sD IT Z 量的增加胰蛋白酶和糜蛋白酶活
性明显降低 , 说明转基因植株对胰蛋白酶和糜蛋 白
酶的抑制活性远高于对照 。 该实验结果证明 sD IZT
图 6 sD IT Z的抑制活性分析
注 : :A sD IZT 对胰蛋白酶的抑制活性分析 ; :B sD IZT 对糜蛋白
酶的抑制活性分析
F ig 灯 e 6 】n h ib iot yr ac it vi yt an lys i
s o f sD IZT
No et
: A an d B er Per
s e n st sD IZT in hi biot yr 朗 it vi yt ot w 田吐s
b。
~
p哪比 iat c lt 岁P s in an d c h yln o t巧甲s in
图 S T 。代转基因油菜 sD IZT 表达的 RT . p C R 检测
注 : M : D 2L 0 0( l m 出t e r ; :P 阳性对照 ; w l , : 野生型油菜 ; La n e
1一:7 转基因油菜
iF g u r e S RT
一
PC R
an
ly se s of 恤g如c r a pe se ed lP an st in OT
9 . . 柱。
攻oet : M : D L 2 0加 m田业e r ; :P po is ivt e c on otr l ; W T : w i ld tyP e
. p e晰;d L 劝e l ~ :7 切切 s g en l c ar pe se ed
表达产物具有丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 。
.2 4 抗虫性分析
初步抗虫性分析结果如图 7 所示 。 使用转基因
植株 sD IZT 一2 、 sD IZT 一5 和 sD IZT 一7 叶片喂养的菜青
虫幼虫生长缓慢 ,死亡率升高。 7 天后 ,对照虫重是喂
食转基因植株 sD IT Z一2 、 sD IZT 一5 和 sD IT Z一7 的 1
.
58
、
1
.
78 和 1 . 57 倍 。 但是 , 喂食转基因植株菜青虫的死亡
率却是对照的 3 . 1、 2 . 1和 .2 5 倍 。 表明菜青虫幼虫代
谢和生长等受到 sD 刀2 表达产物的抑制 , sD 刀2 的表
达量较高 , 可以有效地抑制菜青虫幼虫肠道内胰蛋
白酶和糜蛋白酶的活性 。
.2 5 农艺性状
调查 T ,代 sD ,’I 2一 5转基因家系经过 PC R 检测
15 5个植株 ,得到阳性植株 112 个 , 野生型 43 个 , 表
明该家系符合 3 : 1 的分离比例 。 抽样调查了 27 个
P C R 检测阳性株的农艺性状 ; 阴性株调查了 17 个 。
结果表明(表 l) , 转基因植株和对照的各性状平均值
存在一定的差异 , 说明 sD 刀2 对油菜植株农艺性状
播娘篙蛋白酶抑制剂基因 肠刀 2转化油菜的研究
S加 d ies o nT仆口 s o f n na i to no faS e i r五 e功 b b j o i t rGe e ns D刀 2 i nto B心 s c ia
图 7抗虫性鉴定结果
F ig叮 e7 Bios asy a e rs us l to fms is ta e e no t别 t rog e nla
有一定的影响 。 t测验表明转基因与野生型植株在主
花序有效角果数 、每果粒数 、 全株角果数和千粒重之
间存在显著差异 , 转基因与野生型植株间在其它性状
上差异不显著 。其它家系的表现与 sD 刀2 一5 家系类似 。
3 讨论
油菜是中国主要油料作物 , 种植面积和产量约
占全世界的 13/ (hZ an g et al . , 2 0 06) 。 菜青虫等害虫危
害造成油菜显著减产 。 蛋白酶抑制剂是植物抵御虫
害系统的重要组成部分体。 iw a et al . , 1 997) , 且己证
明蛋白酶抑制剂转基因植株对一些害虫具有有效的
抗性 。 因此 , 油菜转蛋白酶抑制剂基因是一个提高抗
虫性的有效策略 。 sD IT Z转基因油菜对胰蛋白酶和糜
蛋 白酶的抑制能力明显高于对照 , 表明肠全刀 表达
产物具有丝氨酸蛋白酶抑制活性 (图 6) 。 虽然油菜含
有蛋白酶抑制剂 ,但是其表达水平较低 (de eL o et .al ,
20 01 ; G i
r ar d et al
. ,
19 8)
。 菜青虫幼虫喂食转基因油
菜后死亡率升高和幼虫生长缓慢 , 表明转基因油菜
具有一定的抗虫性 。 转基因纯合家系中蛋白酶抑制
剂的表达量会增加 , 会有更好的抗虫效果 。
参考文献
表 1 sD IT Z一5 家系转基因油菜与对应野生型的主要农艺性状
T a b le 1 A g 旧 n o而 e 住妞i st o f ot 劝 s g en i e an d iw ld ytP e P lan st in
sD IT Z一 S T 、 血m i ly
性状 转基因植株 对照植株
T ar i t T口口 s g e n l c Plant W il d ytP e P lant
株高 14 8 . 07士 19 . 34 1 57 . 2 1土 18 . 46
P l助 t h e ihg t (. )
第一次有效分枝数 7 . 93土 2 . 6 3 8 . 36土3 . 18
P d m娜 b加nI c b p er p lant
主花序有效长度 3 8 . 4 3土 11 . 07 4 2 . 14土9 . 6 1
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~
加 n毗 s -
c en c e (an )
主花序有效角果数 5 1. 0 0土 19 . 47 * 65 . 93士 18 . 07
N o
.
o f s iil q u e on ma in in
-
n o r e SC e D Ce
结果密度 1 . 3 5土 0 . 37 1. 57土0 · 2 5
S il i q u e d e sn i yt
第一次有效分枝部位 4 6 . 20士 12 . 70 54 . 79土 14 . 2 5
而加团甲 b . 口 c h he ihg t (an )
每果粒数 2 1. 05土 0 . 2 7 * 2 2 . 19土0 . 2 6
S e e ds ep r is il q u e s
茎粗 1. 4 1土 0 3 9 1, 46 土0 4 9
S te m id 山口e ter (an )
角果长度 6 . 7 8土0 . 73 6 . 9 3土0 . 35
玫n g th o f s i li q叨e (an )
全株有效果数 2 8 1 . 54 土2 5 . 8 6 * 3 89 . 24土 57 , 4
T o at l s il q uS pe r P】an t
千粒重 4 . 1 1土0 . 54 * 4 . 59切 . 4 6
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注 : * : 显著差异
N o te : . 的均 d for is 脚if c ant di 们免re n 沈比伽傲咖 39画 c P laD ts叨d 初ld tyl, e at 0 . 05 le v e l
B ac on .J R
. ,
W an i a加nI ga .s C .D .R , An J
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