全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
收稿日期：2015－09－24
基金项目：国家自然科学基金项目（31301355）；华北理工大学大学生创新创业训练计划项目（X2015166）
作者简介：肖 月（1995－），女，天津人，在读本科生，（电话）15732037502（电子信箱）244439849＠qq．com；通信作者，徐传远（1978－），男，
山东长清人，副教授，博士，主要从事油菜分子细胞遗传研究，（电话）0315－3726527（电子信箱）chuanyuanxu＠gmail．com。
独行菜（Lepidium apetalum Willd.）为十字花科
独行菜属植物，在中国北方广为分布，为常见的田
间杂草。 独行菜的嫩叶可作野菜食用，种子为中药
“葶苈子”，有利尿、止咳、化痰的功效［1］，也可榨油用
于生物柴油的生产。 独行菜还具有广泛的环境适应
性，抗逆性强，生长期短，是油菜进行抗逆性及生育
期育种的优良遗传资源［2，3］。
绿原酸为植株光合作用的副产物，具有抗菌消
炎、抗病毒、清除自由基等功效 ［4，5］，是杜仲、金银花
等中草药的主要效应成分之一［6，7］。 近年来，在保健
食品以及美容护肤产品的研发中，绿原酸也往往作
为重要的功能成分进行添加［8，9］。绿原酸对癌细胞的
增殖具有一定的抑制作用［10，11］。因此，绿原酸的市场
应用前景十分广阔。 本研究在单因素试验的基础
上，采用响应面法对独行菜绿原酸的超声波辅助提
取工艺进行优化，以期为独行菜的进一步加工利用
提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
独行菜，采自唐山地区。
绿原酸标准品，中国国药集团化学试剂有限公
司；无水乙醇（分析纯），山东利尔康医疗科技股份
有限公司。
响应面法优化超声提取独行菜绿原酸的工艺
肖 月，王珊珊，秦玉杰，陈 彤，徐传远
（华北理工大学生命科学学院，河北 唐山 063000）
摘要： 以绿原酸提取得率为考察对象， 研究乙醇体积分数、 液料比及超声时间对独行菜 （Lepidium
apetalum Willd.）绿原酸提取得率的影响。 在单因素试验的基础上，根据 Box－Behnken 试验设计原理，应
用响应面法对独行菜绿原酸提取工艺进行优化。 结果表明，超声波法提取独行菜绿原酸的最佳工艺条件
为乙醇体积分数 79％，液料比 35∶1（mL∶g），超声时间 30 min；该条件下，绿原酸实际提取得率为 1．033％，
与模型预测值（1．029％）相近。
关键词：独行菜（Lepidium apetalum Willd.）；超声辅助；绿原酸；响应面法
中图分类号：TS202．3；S58 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）13－3450-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.045
Optimization of Ultrasonic－assisted Extraction for Chlorogenic Acid from
Lepidium apetalum Willd. by Response Surface Methodology
XIAO Yue， WANG Shan－shan， QIN Yu－jie， CHEN Tong， XU Chuan－yuan
（College of Life Sciences， North China University of Science and Technology， Tangshan 063000， Hebei， China）
Abstract： Ultrasonic－assisted extraction method was used to extract chlorogenic acid from Lepidium apetalum Willd． While
the extraction yield of chlorogenic acid used as the assessment index， ethanol concentration， solvent－to－solid ratio， and ultra-
sonic time were selected as independent variables． Based on the single factor experiment， response surface methodology was
applied with Box－Behnken design principle， to optimize extraction technology of chlorogenic acid from L． apetalum Willd． The
optimum extraction conditions were volume fraction of ethanol 79％，ratio of solvent－to－solid 35∶1 （mL∶g） and ultrasonic time
30 min． Under these conditions，the actual extraction yield is 1．033％，coinciding perfectly with the predictive value of 1．029％．
Key words： Lepidium apetalum Willd.；ultrasonic－assisted；chlorogenic acid；response surface methodology
第 55卷第 8期
2016年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
A.，2016
2
1
1
Jan
13期
7
Vol． 5 No.13
Jul
第 13 期
1．2 仪器与设备
FA1204B 型电子天平，上海精科天美科学仪器
有限公司；DHG－9070A 型电热鼓风干燥箱，中仪国
科科技有限公司；不锈钢分选筛，浙江上虞市华丰
五金仪器有限公司；KQ－250DE 型数控超声波清洗
器，昆山市超声仪器有限公司；SHB－III 型循环水式
多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；752 型紫外
可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。
1．3 试验方法
1．3．1 独行菜绿原酸的提取工艺 独行菜洗净→
60 ℃烘干→粉碎、过筛→超声处理→抽滤→稀释→
测定。
1．3．2 绿原酸提取得率的测定 以绿原酸标准品绘
制标准曲线，得到线性回归方程 Y＝0．062 7x－0．001 6，
r2＝0．997 4。 绿原酸提取得率按照以下公式计算：
绿原酸提取得率＝C×N×V/m×100％。 式中，C
为绿原酸质量浓度 （μg ／ mL）；N 为样品溶液稀释倍
数 50；V为样品溶液体积 （mL）；M为试验样品质量
0．5 g。
1．3．3 试验设计 试验选取 3 个主要影响绿原酸
提取得率的因素，乙醇体积分数、液料比和超声时
间，首先进行单因素试验，在单因素试验的基础上，
采用 Box－Behnken 试验设计方案 ［12］，并利用响应面
法对超声辅助提取独行菜绿原酸的工艺条件进行
优化。
单因素试验：①乙醇体积分数 50％、60％、70％、
80％、90％、100％，液料比 20∶1（mL∶g，下同），超声时
间 20 min，粒度 100 目，超声温度 30 ℃，超声功率
250 W， 考察乙醇体积分数对独行菜绿原酸提取得
率的影响；②乙醇体积分数 80％，液料比 15∶1、20∶1、
25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，超声时间 20 min，粒度 100目，
超声温度 30 ℃，超声功率 250 W，考察液料比对绿
原酸提取得率的影响；③乙醇体积分数 80％，液料
比 30∶1， 超声时间 10、20、30、40、50、60 min， 粒度
100 目，超声温度 30 ℃，超声功率 250 W，考察超声
时间对绿原酸提取得率的影响。
根据 Box－Behnken 试验设计原理，结合单因素
试验结果，采用 3 因素 3 水平响应面法优化独行菜
绿原酸的提取工艺， 响应值为绿原酸的提取得率
（Y）。 试验因素与水平如表 1所示。
2 结果与分析
2．1 单因素试验结果
2．1．1 乙醇体积分数对绿原酸提取得率的影响 由
图 1 可知，乙醇体积分数为 80％时，独行菜绿原酸
提取得率最高。 可能是当乙醇体积分数小时提取能
力低，当乙醇体积分数大于 80％时，乙醇容易挥发
导致提取得率降低，因此选择乙醇体积分数为 80％。
2．1．2 液料比对绿原酸提取得率的影响 由图 2
可知，液料比为 30∶1 时，独行菜绿原酸提取得率最
高 。 液料比过小时 ，绿原酸不易溶出 ；而液料比
过大，绿原酸的总量过少。 所以最佳的提取液料比
为 30∶1。
2．1．3 超声时间对绿原酸提取得率的影响 由图 3
可知，超声时间为 40 min 时，独行菜绿原酸提取得
率最高；超声时间过短，绿原酸没有完全溶出；超声
时间过长，绿原酸可能会发生水解，从而影响绿原
酸的获取。 故超声时间选择 40 min 为宜，此时绿原
酸的提取得率为 1．018％。
2．2 独行菜绿原酸提取工艺的响应面优化
2．2．1 回归模型的建立及方差分析 响应面试验
设计及结果见表 2。 采用 Design－Expert 8．0．6 软件
表 1 Box-Behnken 试验设计的因素与水平
水平
-1
0
1
乙醇体积分数（A）//%
70
80
90
超声时间（B）//min
30
40
50
液料比（C）
25∶1
30∶1
35∶1
因素
图 1 乙醇体积分数对独行菜绿原酸提取得率的影响
50 60 70 80 90 100
乙醇体积分数//%
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
绿
原
酸
提
取
得
率
//%
图 2 液料比对独行菜绿原酸提取得率的影响
15∶1 20∶1 25∶1 30∶1 35∶1 40∶1
液料比//mL/g
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
绿
原
酸
提
取
得
率
//%
图 3 超声时间对独行菜绿原酸提取得率的影响
10 20 30 40 50 60
超声时间//min
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
绿
原
酸
提
取
得
率
//%
肖 月等：响应面法优化超声提取独行菜绿原酸的工艺 3451
湖 北 农 业 科 学 2016 年
对表 2 中的数据进行多元回归拟合，并通过逐步回
归法去掉不显著项，得到回归模型。 其多元回归方
程为Y＝－7．262 00＋0．142 47A＋0．041 92B＋0．113 00C－
0．000 37AC ＋0．000 84BC －0．000 82A2 －0．000 22B2 －
0．000 77C2。
由表 3 可知，该回归模型 P＝0．003 3＜0．01，表现
为极显著，R2＝0．895 1， 调整后 R2＝0．790 2； 失拟项
P＝0．147 6，为不显著，均说明该回归模型拟合情况
较好，可以用该回归模型来分析并预测独行菜绿原
酸的最佳提取工艺条件。 影响独行菜绿原酸提取得
率的各因素一次项均不显著，按影响大小排序依次
为液料比（C）、超声时间（B）、乙醇体积分数（A）。 二
次项中 A2影响最为突出，表现为极显著。 回归模型
中的交互项 BC影响显著，存在明显的相互作用。
2．2．2 响应面分析 根据拟合回归方程得到交互
项的响应面图， 以考察其对绿原酸提取得率的影
响。 由图 4 可以看出，在乙醇体积分数为 80％时绿
原酸提取得率最高； 乙醇体积分数增加或减少，绿
原酸提取得率都会降低。 在乙醇体积分数为 70％
时，随着液料比增大，绿原酸提取得率缓慢增加；乙
醇体积分数为 90％时，随着液料比增大，绿原酸提
取得率却表现为先增加后减少的趋势。
由图 5 可以看出，超声时间和液料比二者的交
互作用使响应面表现为向下弯曲的斜面。 在超声时
间较短时， 液料比的增加会提高绿原酸的提取得
率；而随着提取时间的增加，液料比增加使绿原酸
提取得率降低。 在斜面的顶端可以得到绿原酸提取
得率的最大值。
通过软件的优化分析，得到独行菜绿原酸提取
最佳工艺条件为乙醇体积分数 78．74％、 超声时间
30．00 min、液料比 35∶1。 在此条件下，独行菜绿原酸
的最高提取得率为 1．029％。 考虑实际可操作性，将
上述最佳条件更改为乙醇体积分数 79％、超声时间
30．00 min、液料比 35∶1，并进行试验验证。 经 3次随
机重复试验， 独行菜绿原酸提取得率的平均值为
1．033％，与预测值（1.029%）相近。
表 2 Box-Behnken 试验设计方案及结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
A
0
0
-1
1
1
1
0
0
0
-1
0
0
-1
1
0
-1
0
B
0
1
0
-1
1
0
1
0
-1
-1
0
0
1
0
0
0
-1
C
0
1
1
0
0
1
-1
0
1
0
0
0
0
-1
0
-1
-1
绿原酸提取得率（Y）//%
0.993
0.938
0.957
0.917
0.915
0.875
0.981
0.982
1.025
0.903
1.026
0.994
0.857
0.881
1.015
0.889
0.900
表 3 回归方程方差分析结果
变差来源
模型
A
B
C
AC
BC
A2
B2
C2
残差
失拟项
纯误差
总计
平方和
0.045
4.050×10-5
3.645×10-4
2.592×10-3
1.369×10-3
7.056×10-3
0.028
1.992×10-3
1.560×10-3
5.325×10-3
4.035×10-3
1.290×10-3
0.051
自由度
8
1
1
1
1
1
1
1
1
8
4
4
16
均方
5.679×10-3
4.050×10-5
3.645×10-4
2.592×10-3
1.369×10-3
7.056×10-3
0.028
1.992×10-3
1.560×10-3
6.656×10-4
1.009×10-3
3.225×10-4
F
8.53
0.061
0.55
3.89
2.06
10.60
42.79
2.99
2.34
3.13
P
0.003 3
0.811 4
0.480 4
0.083 9
0.189 4
0.011 6
0.000 2
0.121 9
0.164 3
0.147 6
注：“*”表示显著（P＜0．05）；“**”表示极显著（P＜0．01）。
显著性
**
*
**
35.00∶1
1.05
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80绿
原
酸
提
取
得
率
//%
图 4 乙醇体积分数和液料比对绿原酸提取得率影响的
响应面
33.00∶1
31.00∶1
29.00∶1
27.00∶1
25.00∶1
C：液料比//mL/g
90.00
85.00
80.00
75.00
70.00
A：乙醇体积分数//%
图 5 超声时间和液料比对绿原酸提取得率影响的响应面
35.00∶1
1.05
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80绿
原
酸
提
取
得
率
//%
33.00∶1
31.00∶1
29.00∶1
27.00∶1
25.00∶1
C：液料比//mL/g
50.00
45.00
40.00
35.00
30.00
B：超声时间//min
（下转第 3455页）
3452
第 13 期
量差异不显著（P＞0．05），而雅露和芽茶、雅露与须茶
间差异显著（P＜0．05），芽茶和须茶之间 GABA 含量
差异不显著（P＞0．05）。
3 小结与讨论
高等植物中 GABA主要由 L－谷氨酸脱羧而来，
这一反应由 L－谷氨酸脱羧酶催化，L－谷氨酸可自身
激活 L－谷氨酸脱羧酶的活性［10］，植物体内谷氨酸含
量对 GABA的积累起着重要调节作用。从试验结果可
以看出藤茶中 GABA 的含量为 0．532～0．727 mg ／ g，
明显高于文献报道到普通茶中 GAGA的含量（0．02～
0．22 mg ／ g），这与藤茶中谷氨酸的含量明显高于普通
茶中的谷氨酸含量吻合，较高的谷氨酸含量可能有
利于谷氨酸脱羧酶活性的提高，促进 GABA的积累。
供试 5 种藤茶成品均为凤雅藤茶生物有限公
司 2014 年 6～8 月生产， 其中雅露和雅曲为藤茶老
叶精制而成，雅曲包装精美；凤珠藤茶为老叶烘焙
加工成珠状茶，包装精美；芽茶和须茶为藤茶高档
茶，为新芽加工而成，芽须原料严格甄选，精致烘
焙，包装考究。 试验结果显示雅露 GABA含量最低，
为 0．532 mg ／ g， 而须茶 GABA 含量最高， 为 0．727
mg ／ g；方差分析也表明老叶加工的雅露、雅曲和凤
珠 3 种藤茶成品间 GABA 含量没有显著差异，新芽
须加工而成的芽茶和须茶间 GABA 含量亦没有显
著差异；而雅露和雅曲为代表的老叶茶与芽茶和须
茶之间 GABA含量达到显著差异（P＜0．05）。 表明藤
茶幼嫩叶片中的 GABA 含量相对于老化的叶片更
高；这点也可能影响到产品的定位，随着藤茶档次
的提高，GABA含量递增。 冀宪领等 ［11］也有报道，桑
树幼嫩的叶片中的 GABA 含量相对于老化的叶片
更高，这点上与藤茶一致。
另一方面，新鲜藤茶中 GABA 含量比烘干藤茶
中 GABA 高，提示藤茶在烘焙过程中部分 GABA 可
能被降解，进而导致 GABA 含量下降，所以宜选用
新鲜藤茶叶片来提取 GABA。 在藤茶成品加工过程
中通过优化控制烘焙过程，在不影响藤茶成品生产
前提条件下最大限度降低 GABA 的损耗，以及通过
诸如厌氧处理调控 L－谷氨酸脱羧酶活性增加藤茶
成品中 GABA含量，有待进一步研究。
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3 小结
本研究采用超声辅助法提取独行菜绿原酸，通
过单因素试验考察了乙醇体积分数、超声时间和料
液比对绿原酸提取得率的影响。通过响应面法得到最
佳提取条件为乙醇体积分数 79％、超声时间 30 min、
液料比 35∶1， 在此条件下 ， 绿原酸提取得率为
1．033％。 经响应面分析优化后的绿原酸提取得率比
单因素试验的最高值 1．018％提高了 0．015个百分点。
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范 霞等：藤茶 γ－氨基丁酸含量测定方法研究 3455