全 文 ：第 11 卷 第 3 期
2 0 1 3 年 9 月
生 物 信 息 学
Chinese Journal of Bioinformatics
Vol． 11 No． 3
Sep．，2013
收稿日期:2012 － 11 － 02;修回日期:2012 － 11 － 26.
基金项目:国家天然橡胶产业体系 (CAＲS-34-GW7)和中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项 (1630022011021)资助。
作者简介:仇键，男，博士，研究方向:植物分子生物学;E-mail:qiujian_online@ sina． com．
* 通讯作者:校现周，男，研究员，博士生导师，研究方向:橡胶树采胶生理;E-mail:xiaoxianzhou80@ 163． com．
doi:10. 3969 / j． issn． 1672 － 5565． 2013． 03． 09
橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克隆及分析
仇 键，刘实忠，张志平，魏 芳，杨文凤，罗世巧，校现周*
(中国热带农业科学院橡胶研究所，农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 儋州 571737)
摘 要:利用电子克隆方法获得两条橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因 (IDI)的 cDNA序列和编码区基因组序列，分别命名为
TkIDI1 和 TkIDI2，并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行系统进化、亚细胞定位、活性位点、高级结构等方面的预
测和分析。结果显示，TkIDI1 的 cDNA序列长度为 980 bp，包含一个 696 bp 的开放读码框 (OＲF)，编码 232 个氨基酸，预测定
位于内质网或叶绿体上;TkIDI2 的 cDNA序列长度为 1 038 bp，包含一个 843 bp的 OＲF，编码 281 个氨基酸，预测定位于线粒
体或叶绿体;而他们的截短转录本蛋白定位于胞质中，且都具有过氧化物酶体定位信号。结构分析表明 TkIDI1 和 TkIDI2 与
植物 IDI蛋白同源，活性位点保守，高级结构与其他植物的 IDI均具有高度的相似性。
关键词:橡胶草;异戊烯焦磷酸异构酶;电子克隆;生物信息学分析
中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:1672 － 5565(2013)－ 03 － 209 － 07
In silicon cloning and bioinformatic analysis of isopentenyl diphosphate
isomerase genes in Taraxacum kok-saghyz
QIU Jian，LIU Shi-zhong，ZHANG Zhi-ping，
WEI Fang，YANG Wen-feng，LOU Shi-qiao，XIAO Xian-zhou*
(Key Laboratory of Biology and Genetic Ｒesources of Ｒubber Tree，
Ministry of Agriculture P． Ｒ． China;Ｒubber Ｒesearch Institute，CATAS，Danzhou 571737，China)
Abstract:Two isopentenyl diphosphate isomerase genes (TkIDI1 and TkIDI2)were obtained successfully from Ta-
raxacum kok-saghyz using in silicon cloning technique． Some characters of the IDI gene and encoded protein se-
quences were predicted and analyzed by the bioinformatics methods in the following aspects，such as phylogenetic
tree，signal peptide，localization sites in cells，location of active sites，secondary and tertiary structure． Ｒesults
showed that TkIDI1 (980 bp)contains a complete OＲF (696 bp)encoding 232 amino acid and was predicted to
locate at endoplasmic reticulum or chloroplast;TkIDI2 (1 038 bp)contains a complete OＲF (843 bp)encoding
281 amino acid and was predicted to locate at mitochondrion or chloroplast;their truncated transcript productions
were the cytoplasm located and presented PTS1 predicted as peroxisomal targeting． Protein structure prediction sug-
gested that TkIDIs (TkIDI1and TkIDI2)are highly homologous to other IDIs originate from various plants，and ex-
hibit similar location of active sites and protein structure．
Keywords:Taraxacum Kok-saghyz;Isopentenyl Diphosphate Isomerase(IDI);In Silicon Cloning;Bioinformatics Analysis
橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Ｒodin)又名俄罗
斯蒲公英，属菊科蒲公英属大角蒲公英组，其多年生
植株的根中天然橡胶含量高达 20%左右，与巴西橡
胶树、银胶菊并称为全球三大产胶植物［1］。天然橡
胶是产胶植物乳管类萜代谢产物(Isoprenoid) ，为类
异戊二烯 C5 单元的长链高分子聚合物，目前广泛
应用的巴西橡胶的聚合单元为 800 ～ 2 000个类异
戊二烯，橡胶草橡胶聚合长度略大［1 － 2］。核磁共振
分析表明异戊烯焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，
IPP)及其同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸(Dimeth-
ylallyl diphosphate，DMAPP)是天然橡胶的生物合成
的基本组成单元［3 － 5］，在植物体内 DMAPP是 IPP的
活化状态，它失去一个无活性的磷酸基团后与 IPP
缩合成聚异戊烯链或其他次生代谢产物。Phillips
等人(2008)对异戊二烯合成途径研究发现，IPP 和
DMAPP两者的摩尔比不同，合成的萜类物质的种类
也不同。当两者比例为 1∶ 1 时合成单萜类物质;为
2∶ 1 时合成倍半萜或固醇类化合物;为 3∶ 1 时合成
二萜、类胡萝卜素、叶绿醇、聚戊烯醇或更长链的多
萜类化合物［6］，暗示 IPP 和 DMAPP 比值的调节是
类异戊二烯聚合长度调控的重要因素之一。
异戊烯焦磷酸异构酶(Isopentenyl diphosphate
isomerase，IDI;EC 5． 3． 3． 2)可催化 IPP 和 DMAPP
之间可逆的转化，是调节植物体内 IPP 和 DMAPP 的
比值的关键酶［7］。异戊烯焦磷酸异构酶几乎参与了
所有类萜产物的生物合成，被认识是类萜代谢的关键
限速酶。目前已报道异戊二烯焦磷酸异构酶分为两
类:I型 IDI发现较早，存在于大多数物种中，蛋白单
体是一紧密的球形蛋白，在二价阳离子作用下发挥功
能;II型 IDI为近几年发现，主要存在于一些革兰氏
阳性菌、蓝藻和古生菌中，为 TIM桶状黄素蛋白，不仅
需阳离子，还需 FMN和 NAD(P)H辅助［8］。目前，已
有 50余种植物的 IDI 基因被克隆，如拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、西红柿
(Solanum lycopersicum)、橡胶树(Hevea brasiliensis)、
长春花(Catharanthus roseus)等［9 － 13］。
本研究以拟南芥 IDI 基因为探针，搜索到多条
橡胶草的 EST 序列，在此基础上利用电子克隆方法
识别获得了两条橡胶草 IDI 基因序列，并对该基因
及其编码蛋白进行了生物信息学分析，将为 IDI 在
长链天然橡胶生物合成中作用的研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 橡胶草 IDI 基因的电子克隆，开放阅读框的确
定及基因功能预测
以拟南芥 IDI 基因(AY065053)为探针，通过
BLASTN程序搜索 GenBank 的橡胶草的 EST 数据
库。利用 Vector NTI Suite 9 软件中的 Contig Express
程序对搜索到的与 AY065053 序列相似性较高的
EST序列进行拼接。以新获得的序列重叠群为探针
重复进行上述步骤，直至不能获得延伸为止。用
OＲF Finder对拼接序列进行开放阅读框的查找和翻
译，并将该氨基酸序列应用 BLASTP 程序搜索 Gen-
Bank的 Non-redundant protein sequences (nr)数据
库，根据搜索到的同源蛋白序列的注释信息判定该
EST重叠群编码产物的功能。
1． 2 橡胶草 IDI基因的 OＲF克隆和序列验证
采用 TＲIzol试剂提取橡胶草全株的总 ＲNA，并
按照反转录试剂盒 PrimeScript  ＲT reagent Kit
(TaKaＲa)说明书合成 cDNA第一链，反转录产物保
存于 － 80℃备用。依据电子克隆的橡胶草 IDI 基因
序列，设计包含完整 OＲF的扩增引物 IDI1-F:5-tc-
ctccttgcattagcttca-3，IDI1-Ｒ:5-tcaccttgaatggatggttaa-
3以及 IDI2-F:5-aaccattgctaccatgatctc-3，IDI2-Ｒ:
5-cacgtaaagaaaaacaggaga-3，PCＲ扩增片段经凝胶回
收插入 pMD19-T载体后，转入大肠杆菌 DH5α 后测
序。PCＲ 反应程序为:95℃，5 min ;95℃，30s;
55℃，30s;72℃，60s;32 个循环;72℃，8min。
1． 3 橡胶草 IDI 基因的基因组序列克隆和编码区
基因结构分析
以 CTAB法提取的橡胶草叶片基因组 DNA 为
模板，采用上述引物扩展相应的 IDI 基因的基因组
序列，将扩增片段经凝胶回收插入 pMD19-T 载体
后，转入大肠杆菌 DH5α后测序。对 IDI基因的 cD-
NA序列和基因组序列进行多序列比对，分析其编
码区基因结构。
1． 4 橡胶草 IDI基因的生物信息学分析
核酸及氨基酸序列的同源性比对和多序列比对
用 Blast和 Clustal W 完成;系统进化树采用 MEGA
5． 0 软件 Neighbor-Joining 方法建立，重复 1 000 次
的自展(Bootstrap)检验计算各分支置信值。采用
PSOＲT，Predotar、MitoProt、ChloroP、TargetP 和 Tar-
getSP-PTSI在线程序对橡胶草 IDI 基因编码产物进
行亚细胞定位分析;蛋白质二级及三级结构的预测
利用 SOPMA和 SWISS-MODEL在线工具完成。
2 结果分析
2． 1 橡胶草 IDI基因的 EST检索和拼接
以拟南芥 IDI 基因的 cDNA 序列为探针，Blast
检索 NCBI 的橡胶草 EST 库，获得 5 条与之高度同
源的 EST 序列，以检索到的 EST 为探针序列，再次
进行 blast 检索，直到不能获得新的 EST 序列为止，
最终共检索到 13 条与拟南芥 IDI 基因高度同源的
EST序列。对上述 13 条不同的 EST进行拼接，获得
2 个重叠群，其中 10 个 EST拼接成重叠群 congtig1，
长度 980 bp;3 个 EST 拼接成重叠群 congtig2，长度
为 1 038 bp (见图 1)。
012 生 物 信 息 学 第 11 卷
图 1 橡胶草 IDI基因的 EST序列拼接示意图
Fig． 1 The joint map of TkIDIs EST sequence
图 2 不同类群的异戊烯焦磷酸异构酶的进化树分析
Fig． 2 Phylogenetic tree of plant species based on amino acid sequences of IDI proteins
2． 2 橡胶草 IDI 基因的 EST 重叠群的开放阅读框
分析和序列验证
根据 congtig1 和 congtig2 的序列设计引物，运用
ＲT-PCＲ方法从橡胶草 cDNA 中分别扩增出两条 1
000 bp 左右的特异条带。特异条带克隆测序后，比
对发现获得的序列与两个重叠群一致，验证了 EST
序列重叠群拼接的正确。对获得的两条序列进行
OＲF预测，结果显示 congtig1 序列包含一个 696 bp
的开放阅读框(44 ～ 871 位碱基) ，该开放阅读框编
码 232 个氨基酸的蛋白，本文中命名为 TkIDI1(Gen-
Bank登录号 KC416647) ;congtig2 序列包含一个 843
bp的开放阅读框(20 ～ 860 位碱基) ，该开放阅读框
编码 281 个氨基酸的蛋白，命名为 TkIDI2(GenBank
登录号 KC416648)。两个开放阅读框的起始密码子
侧翼序列符合 KOZAK规则［14］。
2． 3 橡胶草 TkIDI基因的生物信息学分析
将翻译的氨基酸序列对 GenBank 的 Non-redun-
dant protein sequences(nr)数据库进行 BLASTP 搜
索。结果表明，TkIDI1 和 TkIDI2 的氨基酸序列与同
科的莴苣(Lactuca sativa)、甜菊(Stevia rebaudiana)、
万寿菊(Tagetes erecta)和菊花(Chrysanthemum x
morifolium)等物种的 IDI蛋白的一致达到 90%以上，
可见不同物种的 IDI 基因及其编码的蛋白序列间具
有高度的同源性。采用 MAGE5． 0 对不同来源的 IDI
进行进化树分析，结果显示 36 个 IDI被分成 5 类群，
分别为植物、动物、真菌、古细菌和细菌(见图 2)。
112第 3 期 仇 健，等:橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克隆及分析
在进化遗传学上，亲缘越近的物种在 IDIs 的分子系
统进化树上距离较近，比如大戟科蓖麻和橡胶树、
禾本科的玉米和水稻以及菊科的橡胶草、莴苣和菊
花，这也反映了该分子系统进化树分析的结果可靠。
对比同一物种的两个 IDI 家族可以看出，拟南芥、橡
胶树的两个 IDI家族进化上比较靠近，但番茄、水稻
的两个 IDI距离比较远，橡胶草也具有相同的现象，
推测 IDI的进化速度可能存在差异。
所有 IDI 序列来自于 GenBank 的非冗余蛋白质
Nr蛋白数据库;相同符号标示为同一物种的两个
IDI家族成员;各分支数值代表置信度(%)。
采用 Clustal W 将橡胶草 IDI 与其他几种植物
IDI氨基酸序列进行多序列比对分析，结果显示:植
物 IDI的 N端区域没有同源性，该区域主要为信号
肽序列;在这个区域后是高度同源的区域，即 NU-
DIX(nucleoside diphosphate linked moiety X)水解酶
功能区。参照人和大肠杆菌 IDI 活性位点分析橡胶
草 IDI功能特点，其中 TkIDI1 的镁离子结合位点为
C120 和 E159，锌离子结合位点为 H83、H85、H122、
E180 和 E182，而 D52、Q55 和 L58 对其蛋白 N 端的
稳定具有重要作用。TkIDI2 的镁离子结合位点为
C125 和 E164，锌离子结合位点为 H88、H90、H127、
E185 和 E187，蛋白 N端 D57、Q60 和 L63 具有稳定
蛋白结构作用。总体上看，植物的 IDI 在功能位点
上是非常保守的(见图 3)。
图 3 橡胶草与其他植物 IDI 氨基酸序列比较
Fig． 3 Comparion of homologous amino acid sequences of TkIDI proteins among Taraxacum kok-saghyz and other plant species
注:mTP表示为线粒体定位信号肽，cTP为叶绿体定位信号肽，PTS1 为过氧化物酶体定位信号;α1-7 以及 η1-5 为 α-螺旋，β1-10 为 β-转角，T为
不规则卷曲;★为锌离子结合位点，●为镁离子结合位点，▲具有稳定蛋白结构作用;AF188062，AF188063 (莴苣) ;BAF98286，BAF98287 (巴
西橡胶树) ;ABX55779，ACS34993 (西红柿) ;NP_001055547，NP_001059919 (水稻) ;NP_186927，NP_197148 (拟南芥)。
Notes:mTP:Mitochondrial targeting signal peptide，cTP:Chloroplast localization signal pepeide，pTSl:Peroxidase localization signal peptide;α1-7andη1-5:
α-spiral，β1-10:β-corners，T:Irregular Curl;★:Zinc ion binding site，●:Magnesium ion binding site，▲:Arobe in stabilzing protein structure;
AF188062;AF188063(Lettuce) ;BAF98286，BAF98287(Herea brasiliensis)ABX55779，ACS34993(Tomato) ;Np － 00105547，NP － 001059919(Ｒice) ;
NP － 186927;NP － 197148(Arabiolopsis PTSA thaliana) ;
212 生 物 信 息 学 第 11 卷
蛋白质在细胞中的定位与蛋白执行的功能密切
相关。在植物中，IDI家族成员及其异构体不仅存在
于细胞质，同时在线粒体、过氧化物体［15］和质体［12］
都有发现，这与 IDI 蛋白 N 端的含有的定位信号相
关。采用 PSOＲT，Predotar、MitoProt、ChloroP、TargetP
和 TargetSP-PTSI程序对橡胶草 IDI 基因编码产物进
行亚细胞定位预测(见表 1)。结果显示，橡胶草
TkIDI1 基因编码产物 N端含有 20 aa 的信号肽序列
和 42 aa的叶绿体定位信号，可能定位于内质网和叶
绿体中;TkIDI2 基因编码产物同样具有质体定位信
号，预测 N端的 36 aa为叶绿体定位信号，53 aa为线
粒体定位信号 (见图 3) ，该蛋白可能定位于叶绿体
基质和线粒体中。此外，两个基因的短片段转录本
编码产物 (小分子异构体)均预测为胞质定位。上
述橡胶草 IDI基因编码产物的 C 端均存在过氧化物
酶体定位信号 PTS1(见图 3) ，表明他们都可被引导
并组装到过氧化物体上。
表 1 橡胶草 IDI基因编码产物的亚细胞定位分析
Table 1 Predicting subcellular localization of deduced TkIDI protein
蛋白名 PSOＲT Predotar MitoProt ChloroP TargetP TargetSP-PTSI
TkIDI1 分泌(0． 820* ) 内质网(0． 99* ) 0． 2615* (1-36 aa#) 0． 518* (1-42 aa#) 信号肽(0．98* ，1-20 aa#) 0． 45※(264-275 aa#)
TkIDI1t 胞质(0． 450* ) 普遍存在(0． 99* ) 0． 1690* 否 其他(0． 961* )
TkIDI2
叶绿体基质(0． 558* )
线粒体(0． 436* )
质体(0． 63* )
普遍存在(0． 36* )
0． 366* (1-53 aa#) 0． 570(1-36 aa#) 叶绿体(0． 919* ) 0． 41※(269-280 aa#)
TkIDI2t 胞质(0． 450* ) 普遍存在(0． 99* ) 0． 242* 否 其他(0． 956* )
注:TkIDI1t和 TkIDI2t分别表示为 TkIDI1 和 TkIDI2 的截短转录本编码产物;* 为 Score;#为信号序列位置;※为 E-value。
Notes:TkIDI1t and TkID2t:Truncated transcript product coding TkID1 and TkzD2;* :Score;#:position signal sequence;* :E-value．
橡胶草 IDI氨基酸序列的二维结构预测结果显
示，TkIDI1 由 51． 09% 的 α-螺旋、12． 68% 的 β-折
叠、30． 07%的不规则卷曲和 6． 16%的 β-转角组成;
T1IDI2 由 41． 64% 的 α-螺旋、10． 68% 的 β-折叠、
44． 84%的不规则卷曲和 2． 85%的 β-转角组成(见
图 4)。SWISS-MODEL 在线同源建模方法构建的
TkIDI分子模型显示:橡胶草的两个 IDI 单体除个
别转角不同外，总体结构非常相似，均由 9 个螺旋、7
个不同大小的折叠和一些转角构成，这与已研究清
楚的人和大肠杆菌的 IDI 蛋白的高级结构一致，都
为紧密球形的 α /β 蛋白［16］。与拟南芥［9］、巴西橡
胶树［13］等植物预测的 IDI比较(预测结果未显示) ，
IDI在高级结构上没有明显变化，预示其可能具有
相同的功能。
图 4 橡胶草两个 IDI成员三维结构预测的比较
Fig 4 Predicted tertiary structure of Taraxacum kok-saghyz IDI1 and IDI2 protein
2． 4 橡胶草 TkIDI编码区基因组结构分析
使用 ＲT-PCＲ 特异引物从橡胶基因组中克隆到
TkIDI1和 TkIDI2编码区的基因组序列，长度分别为 2
941和 1 460 bp，均包含 6个外显子和5个内含子。由
于信号肽长度差异，6个外显子中，除第一个外显子长
度不一致(TkIDI1为 188 bp，其中 132 bp编码信号肽;
TkIDI2为 203 bp，其中 147 bp编码信号肽) ，其余 5个
外显子长度一致，分别为 56、92、104、137 和 251 bp。
TkIDI1和 TkIDI2内含子长度则差异较大，TkIDI1 的 5
个内含子都要大于 TkIDI2(见图 5)。总体上，橡胶草
IDI基因组序列的组成结构与拟南芥，水稻(Oryza sa-
tiva)等植物 IDI基因组结构相似。
312第 3 期 仇 健，等:橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克隆及分析
图 5 橡胶草两个 IDI成员编码区的基因组结构示意图
Fig 5 Genomic structures of Taraxacum kok-saghyz IDI1 and IDI2
3 讨论
萜类是植物中一类重要的次生代谢物，具有重
要的生理生态作用及经济价值。IDI 直接影响萜类
合成 5 碳前体库代谢流的流向，是下游代谢途径的
总开关［2］。研究发现大部分的植物都含有两个或两
个以上的 IDI基因，且存在截短转录本现象，如拟南
芥、烟草、番茄、长春花等。IDI家族成员蛋白活性类
似，但具有不同的亚细胞定位，例如拟南芥 IDI1 定
位于质体，IDI2 定位于线粒体，而他们的短转录片段
则分布于胞质［6］。本文通过电子克隆获得橡胶草两
个 IDI成员 TkIDI1 和 TkIDI2 的完整编码序列，序列
分析和亚细胞定位预测显示，TkIDI1 和 TkIDI2 同样
具有不同亚细胞定位信号，暗示他们可能独立参与
了各细胞区间的异戊二烯代谢。
通常情况下，同一物种的两个 IDI 基因的同一
性要高于不同物种来源的 IDI 基因，例如拟南芥的
两个 IDI成员的同一性为 92%，与其他植物 IDI基因
的同一在 84% ～ 90%之间。本研究中，两个橡胶草
TkIDI1 和 TkIDI2 的同一性仅为 85%，TkIDI1 与同属
植物甜菊和万寿菊的同一性超过 93%，与茄科植物
烟草和西红柿也达到 90%，而 TkIDI2 除了与同属莴
苣达 90%，与其他植物的同一性均低于 70%，造成
了进化树中橡胶草 TkIDI2 与其他 IDI基因的距离较
远，形成独立的分支。TkIDI1 与菊科和茄科植物 IDI
距离较近，表明该基因在菊亚纲植物中具有高度同
源，符合克朗奎斯特分类系统［17］(Croinquist Sys-
tem)。从基因组序列来看，除内含子长度外，橡胶草
TkIDI1 和 TkIDI2 的内含子数目、外现子分布和长度
等编码区结构相同，与拟南芥两个 IDI 的基因组结
构基本一致，表明 IDI 基因组结构较保守，但与拟南
芥 IDI和 TkIDI1 比较，TkIDI2 的 5 个内含子长度都
明显较小，较短的内含子是否与其独特的进化特性
相关还有待进一步确认。
通过对巴西橡胶树、橡胶草和银胶菊等产胶植
物的研究，人们对天然橡胶生物合成途径有了一定
的认识。天然橡胶生物合成发生在产胶植物乳管胞
质中 5 碳单体异戊二烯聚合的过程。5 碳前体 IPP
主要来源于胞质的 MVA途径，在 IDI 或 TPT 的催化
下生成 DMPP、GPP 以及 FPP 等丙烯焦磷酸(allylic
pyrophosphates)作为聚合的起始物［5］，Tangpakdee 等
通过分析不同生长橡胶树胶乳的分子量，推测胶树
IPP异构酶活性降低，减少了 DMPP的转化是促进大
分子合成的原因［18］，由此可见，IDI 活性与天然橡胶
的分子量也存在密切的关系。
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