全 文 ：2005年 12月
2005, 27(4):1— 6
中国油料作物学报
Chinese journa l of oil crop sciences
播娘蒿与甘蓝型油菜的原生质体融合与植株再生
姜淑慧 , 管荣展* , 董海滨 , 杜文明
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,南京 210095)
摘要:以播娘蒿叶片和甘蓝型油菜子叶为材料提取原生质体。采用 PEG—高 pH、高钙附加 DM SO融合方法 ,
液体浅层静置培养 , 研究影响播娘蒿与甘蓝型油菜原生质体融合的因素 , 获得了再生植株。结果表明:4%纤维素
酶 +0. 5%离析酶 +5mm ol /L MES酶解 10h可获得高产率播娘蒿原生质体 , 1%纤维素酶 +0. 2%离析酶 +3mmo l /L
M ES酶解 14h可获得高产率油菜原生质体;30%PEG+0. 3m o l /L葡萄糖 +50mm ol /L CaC l2 2H2O +15%DMSO可
获得 10%的融合率;改良 B5培养基的原生质体培养效果最好;最佳分化培养基为 M S+4. 0mg /L 6 - BA+0. 3m g /L
NAA+5. 0mg /L AgNO 3;最佳生根培养基为 M S+0. 1m g /L IBA+0. 1mg /L NAA。
关键词:播娘蒿;双低油菜;属间体细胞杂交;融合条件
中图分类号:Q132. 1+1, S565. 4　文献标识码:A　 文章编号:1007— 9084(2005)04— 0001— 06
　　播娘蒿 (Descurainia soph ia)为十字花科 (Crucif-
erae)播娘蒿属野生植物。它适应性强 、抗逆性好 ,
种子含油量高 ,是重要的特用油料植物 ,特别是种子
中富含 38%以上的亚麻酸[ 1] ,被视为生产亚麻酸的
理想植物。但播娘蒿种子和植株中含有硫甙 ,且种
子小 ,产量低 ,为开发利用播娘蒿带来了障碍 。因
此 ,设想用双低甘蓝型油菜改良播娘蒿 ,使之具有更
好的生长势 、产量及更优的品质 ,提高利用价值 。原
生质体融合是实现这种改良的有效途径之一。
油菜的原生质体培养及融合开始于 20世纪 70
年代 ,到目前为止 ,栽培油菜的 3个种都从原生质体
培养获得了再生植株[ 2 ～ 9] , 并获得了很多融合杂
种 [ 10 ～ 13] 。尽管油菜原生质体培养及融合成功的事
例报道很多 ,但目前还未见油菜和播娘蒿原生质体
融合的报道 。本文研究播娘蒿和甘蓝型油菜原生质
体的融合 ,目的是合成新种质 、实现油菜优良性状向
播娘蒿的转移 ,从而改良驯化播娘蒿 ,使之成为高亚
麻酸 、高产的功能油料植物 。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
供试材料为当年采收的播娘蒿种子和双低甘蓝
型油菜 (华双 3号 )。
1. 2　质壁分离液 、清洗液 、酶解液和融合液的制备
用于质壁分离和原生质体清洗的溶液分别为
CPW - 13M质壁分离液和 CPW - 10M 、 CPW - 9M
清洗液 ,即 CPW溶液附加 13%和 10%、9%的甘露
醇 , pH值为 5. 8。 CPW溶液成份 27. 2mg /L H2PO 4、
101mg /L KNO3 、246mg /L M gSO4 7H2O、0. 16mg /L
K I、0. 025mg /L CuSO 4 5H2O、1 480mg /L CaC l2
2H2O。酶解液为纤维素酶和离析酶 ,附加 MES , pH
值为 5. 6。融合液为聚乙二醇(PEG ,MW8000)附加
0. 3mo l /L葡萄糖 、50mmo l /L的 CaC l2 2H2O , pH值
为 10. 5;另外 ,配制 50mmo l /L CaC l2 2H2O ,供清洗
PEG用 。
以上试剂和原生质体培养基与稀释培养基均经
0. 22μm微孔滤膜抽滤灭菌 ,扩增 、分化和生根培养
基高温高压灭菌。所有培养基 pH值均为 5. 8。
1. 3　播娘蒿和甘蓝型油菜无菌苗的获得
分别将播娘蒿和甘蓝型油菜的种子用 70%酒
精表面消毒 2 ～ 3m in,然后 0. 1% HgC l2溶液浸泡消
毒 15m in,无菌水冲洗 3 ～ 5次 ,接种到 MS培养基
上 ,置于组培室发芽 。待播娘蒿长出真叶后 ,取播娘
蒿无菌苗的叶片提取原生质体;待甘蓝型油菜长出
子叶后取其子叶提取原生质体。
1. 4　原生质体的制备与培养
播娘蒿原生质体的分离与纯化:取预先经 4℃
处理 2 ～ 3d的播娘蒿无菌苗叶片 ,切碎后加入 CPW
-13M溶液 , 质壁分离 1h;然后转入酶解液中于室
收稿日期:2005— 03— 28
基金项目:国家自然科学基金(30370902)
作者简介:姜淑慧(1981— ),女 ,内蒙古人 ,硕士生 ,主要从事油菜生物技术研究。
*通讯作者 , em ail:guan rzh@ njau. edu. cn。
温黑暗条件下 ,摇床上轻摇(30rpm)酶解;酶解后用
45μm孔尼龙网过滤酶解分离原生质体。将滤液移
至 10m l离心管中 , 500 rpm离心 5m in;吸除上清液 ,
加入 CPW - 10M溶液 ,离心清洗 5m in,弃上清 ,重复
2次;最后用原生质体培养基 (PJ1)离心清洗 1次即
可获得纯净的播娘蒿原生质体。 0. 1mm血球计数
板计数原生质体产量 , 0. 01% FAD(二乙酸荧光素 )
检验原生质体活力。原生质体活力 =(发黄绿色荧
光的原生质体数 /观察的原生质体总数)×100%
甘蓝型油菜原生质体的分离和纯化:操作步骤
与播娘蒿相同 , 所不同的是 , 质壁分离时间为
45m in,清洗原生质体为 CPW -9M 。
原生质体融合及清洗:将纯净的 1. 0 ×106 /mL
油菜原生质体和 1. 0×106 /mL播娘蒿原生质体 ,按
1∶1的比例在离心管中混匀(各约 0. 5mL),然后加
入融合液 (约 0. 5mL), 静置融合 。融合后 , 加入
50mmol /L C aC l2 2H 2O的清洗液 ,离心清洗 PEG;
离心后 ,吸上清液 ,然后用 PJ1离心清洗 1次 ,离心
速度 、离心时间同上。
原生质体培养:用原生质体培养基 PJ1悬浮融
合后的原生质体 ,根据油菜子叶原生质体内含物较
多 、颜色较深 ,播娘蒿叶片原生质体内含物较少 、颜
色较浅 ,能从形态上明显区别融合原生质体。用显
微操作仪挑取完全融合的原生质体 200个 ,悬浮在
20mL原生质体培养基中 ,进行液体浅层培养。前 3
周暗培养 ,每隔 5 ～ 7d添加 1次稀释培养基 (PJ2),
约加 0. 5mL。 3周后将培养物置于漫射光下进行培
养。
1. 5　愈伤组织分化与植株再生
当出现肉眼可见的愈伤组织时 ,将其转移至扩
增培养基 (PJ3),弱散射光下培养 ,以利愈伤组织迅
速长大。原生质体培养 、稀释 、扩增培养基的激素配
比见表 1。
待愈伤组织长至约 5mm时 ,将其转移到分化培
养基 ,光照下培养。当分化出小苗后 ,将小苗连同愈
伤组织一起转至 MS基本培养基中生长 。待再生苗
长至 2 ～ 3 cm时 ,切下小苗移入生根培养基中生根。
分化和生根培养基的配比情况见表 2。
2　结果与分析
2. 1　酶解条件对原生质体产量的影响
单独使用纤维素酶和离析酶 ,原生质体的产率
均不高;二者配合使用 ,获得了较高的产率(表 3)。
4%纤维素酶 +0. 5%离析酶 +5mmo l /LMES酶解
表 1　培养基的激素配比
Tab le 1　　Culture med ia w ith d ifferen t p lan t grow th regu lators
处理
T reatm en t
6 -BA
/(m g /L)
2, 4 -D
/(mg /L)
NAA
/(m g /L)
葡萄糖
G lucose
/(m ol /L)
谷氨酰胺
G lu tam ine
/(g /L)
水解酪蛋白
H yd rolyzed casein
/(g /L)
MES
/(mm ol /L)
蔗糖
Sucrose
/﹪
琼脂
Agar
/(g /L)
Ⅰ PJ1 0. 5 1. 0 0. 1 0. 4 0. 4 5 10
PJ2 1. 0 0. 1 0. 1 0. 1 0. 4 5 3
PJ3 0. 5 0. 5 0. 1 0. 4 0. 25 3 7
Ⅱ PJ1 0. 5 1. 0 0. 1 2 0. 7
PJ2 1. 0 0. 5 0. 1 0. 7
PJ3 1. 0 0. 5 0. 1 0. 25 3 7
表 2　分化和生根培养基的配比情况
Tab le 2　　R egenera tion and rootingm ed ium w ith d ifferen t p lan t grow th regu lators
处理
T reatm en t
6 - BA
/(mg /L)
IBA
/(m g /L)
NAA
/(m g /L)
AgNO 3
/(m g /L)
GA 3
/(mg /L)
水解酪蛋白
H yd rolyzed casein
/(g /L)
蔗糖
Sucrose
/(g /L)
琼脂
Agar
/(g /L)
分化培养基 Ⅰ 3 0. 15 2. 5 1 0. 25 30 5. 6
Regenerationm ed ium Ⅱ 4 0. 05 5. 0 0. 6 0. 25 30 5. 6
Ⅲ 4 0. 3 5. 0 0. 25 30 5. 6
Ⅳ 1. 5 0. 1 6. 0 0. 25 30 5. 6
Ⅴ 3 0. 2 6. 0 0. 25 30 5. 6
Ⅵ 4 0. 4 6. 0 0. 25 30 5. 6
生根培养基 Ⅰ 0 0 30 5. 6
Rooting m ed ium Ⅱ 0. 2 30 5. 6
Ⅲ 0. 2 30 5. 6
Ⅳ 0. 1 0. 1 30 5. 6
2 中国油料作物学报　2005, 27(4)
表 3　酶浓度和酶解时间对播娘蒿和甘蓝型油菜原生质体产量的影响
Tab le 3　　Effec t of enzym e trea tm en t on protop last yield ofD. sophiaW eb and B. napus L.
供试材料
M ateria l
处理
Tream en t
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ
播娘蒿 纤维素酶 C ellu lase /% 3 0 4 4 5 5 6 6
D. soph ia 离析酶 Macerozym e /% 0 3 0. 2 0. 5 0. 2 0. 5 0. 2 0. 5
MES /(mm ol /L) 5 5 5 5 5 5 5 5
酶解时间 Incubation time /h 20 20 10 10 14 14 16 16
产量 Protop last yield /(个 /gFW) <104 <104 5×105 106 105 <105 5×104 3×104
甘蓝型油菜 纤维素酶 C ellu lase /% 0 0. 2 0. 8 0. 8 1. 0 1. 0 1. 2 1. 2
B. napus 离析酶 Macerozym e /% 0. 2 0 0 0. 2 0. 1 0. 2 0. 1 0. 2
MES /(mm ol /L) 3 3 3 3 3 3 3 3
酶解时间 Incubation time /h 16 16 16 14 14 14 16 16
产量 Protop last yield /(个 /gFW) <104 <104 105 1. 5×105 5×105 106 5×105 2×105
10h(即表 3中的处理Ⅳ)是获得高产量播娘蒿叶片
原生质体的最佳处理;1%纤维素酶 +0. 2%离析酶
+3mmo l /LMES酶解 14h(即 Ⅵ 号 )适合油菜高产
量原生质体的分离。从所有处理中 ,可以发现纤维
素酶在酶解过程中起关键作用 ,但与离析酶配合使
用 ,原生质体产率得到了明显的提高 。同时 ,酶浓度
和酶解时间对于获得高产率的原生质体也很重要 ,
时间太短酶浓度太低 ,酶解不充分 , 影响产率和质
量;但时间太长浓度太大 ,产率下降 ,原生质体质量
和存活力也随之下降 ,出现大量的破碎现象 ,处理
Ⅶ 、Ⅷ都出现了此种现象 。酶种类 、酶浓度 、酶解时
间是影响原生质体高产优质的主要因素。本实验将
纤维素酶和离析酶配合使用 ,分离出较高产率的原
生质体 。当其中的一种酶单独使用时 ,均不能获得
此效果 。
2. 2　不同 PEG浓度以及 DMSO对融合率的影响
本实验在采用 PEG—高 pH、高钙的化学融合方
法的基础上 ,又附加了 DMSO。 PEG和 DMSO浓度
处理的设置情况见表 4和表 5。在未加入 DMSO之
前 ,融合率随着 PEG浓度的增加而提高 ,但高于
30%以后 ,融合率开始下降 。这是因为 PEG浓度太
高 ,使原生质体高度聚在一起 ,减少了异质原生质体
的融合机率 。 30% PEG +0. 3mo l /L 葡萄糖 +
50mmo l /L CaC l2 2H2O(即表 4中的Ⅴ号处理 )获
得了 8. 0%的最高融合率。为了提高融合率 ,在此
最优处理中加入了 DMSO ,当其浓度分别为 0、5%、
10%时 ,其融合率分别为 8. 0%、8. 5%和 9. 3%,当
DMSO浓度为 15%时 ,融合率提高到 10. 0%。由此
可见 , DMSO能够明显地提高融合率;但高于 15%,
又呈下降趋势 (融合率为 8. 7%)。所有处理的结果
显示:30%PEG +0. 3mo l /L 葡萄糖 +50mmo l /L
C aC l2 2H 2O附加 15%的 DMSO为最佳处理。
2. 3　不同培养基 、不同处理对原生质体培养的影响
利用 B5[ 14] 、Km8p[ 15] 、MS三种培养基进行融合
后的原生质体培养 ,并对 B5培养基作了改良 ,即将
B5中的有机成分用 Km8p培养基的有机成分代替。
结果表明 ,在激素水平相同的条件下 ,用改良 B5培
养基比 Km8p和 MS培养基培养的原生质体分裂时
间早 ,褐化程度轻 ,而且诱导愈伤组织的出愈率也高
于其他两种培养基 。 3种培养基中 , MS培养基的培
养效果最差。同时 ,激素水平不同 ,培养效果也不
同 , 3种培养基中处理 I的培养效果均明显优于处
理Ⅱ (表 5)。
表 4　PEG浓度对融合率的影响
Tab le 4　　E ffect ofPEG concen tration on fusion frequency
处理
T reatm en t
PEG浓度
PEG con cen tration /%
葡萄糖
G lucose /(mo l /L)
CaC l2 2H2O
/(mmo l /L)
融合时间
Fusion t im e /m in
融合率
Fusion requency /%
Ⅰ 10 0. 3 50 20 0. 2
Ⅱ 15 0. 3 50 20 1. 5
Ⅲ 20 0. 3 50 20 4. 2
Ⅳ 25 0. 3 50 20 6. 1
Ⅴ 30 0. 3 50 20 8. 0
Ⅵ 35 0. 3 50 20 6. 5
3姜淑慧等:播娘蒿与甘蓝型油菜的原生质体融合与植株再生
表 5　改良 B5 、M S、 Km8p培养基及不同激素处理对原生质体培养的影响
Tab le 5　　The effect of cu lturem ed ia and grow th regu lator on protop last cu lture
培养基 M edia B5 Km 8p MS
处理 T reatment Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ
第一次分裂时间 T im e to cell d ivision /d 2. 1 3. 3 3. 5 4. 4 6. 0 7. 0
褐化程度 B rown degree + ++ +++
　　　　　　注:“ +”表示褐化程度最轻 , “ ++”表示褐化程度相对较轻 , “ +++”表示褐化程度最重
　　　　　　Note:“ +, ++, +++”deno te the degree of calli b row n ing:ligh t, m iddle and serious, respectively
2. 4　分化培养基和生根培养基对植株再生的影响
MS基本培养基用于愈伤组织的分化与生根 。
实验共获得 19棵再生苗 (再生过程见图 1的 A -
F)。分化培养基的 6个处理中 ,最佳配比为 MS +
4. 0mg /L 6 -BA +0. 3mg /L NAA +5. 0mg /L AgNO3
(即表 2中的 Ⅲ号处理 ),获得了 5棵再生苗 ,其他
处理共获得 14棵再生苗。 19棵再生苗接种在生根
培养基中 ,其中在Ⅳ号培养基即 MS +0. 1mg /L IBA
+0. 1mg /L NAA生根的植株根系多而粗壮 ,为最佳
的配比 ,其他处理生根少且纤细 。这表明 AgNO 3能
提高愈伤组织的分化频率 , IBA与 NAA配合使用
具有更好的生根效果 ,结果与前人的结论一致 。
2. 5　原生质体融合杂种植株的移栽和性状初步观
察
待再生植株长出约 10 ～ 15条次生根时移栽 。
先打开封口膜 ,在培养室敞口 3 ～ 5d ,然后取出再生
植株 ,用水洗去根部附着的培养基 ,移栽到小花盆
中 ,经 2 ～ 3个星期的锻炼后 ,移至大田 。
移至大田的 19株杂种植株 ,在经历了温度等自
然环境和自身适应后 , 8株死亡 、9株能正常生长开
花。杂种植株全部表现为生长缓慢 、植株矮小 ,平均
植株高度 87. 5cm ,一次分枝 8. 5个;其叶型与甘蓝
型油菜相近 ,但叶缘裂痕较深似播娘蒿 (图 1G);花
蕾呈播娘蒿花蕾 ,颜色为紫色 ,为播娘蒿花蕾的 2倍
(图 1H);平均每角果结实 2 ～ 4粒 ,种子有的圆滑 ,
有的干瘪 ,大小也不整齐。因组培苗受到培养基中
激素的影响 ,加上 3月份移入大田时温度已经较高 ,
有关性状没有得到充分发育 ,其性状和形态观察还
有待于在下一年度进一步鉴定 ,以明确材料的利用
价值 。
A. 正在融合的原生质体;B. 融合的原生质体;C. 形成细胞团;D. 扩增培养形成的愈伤组织;
E. 愈伤组织分化出小苗;F. 再生植株;G. 杂种和播娘蒿叶片;H. 杂种花蕾
A. Fu sing protop last;B. Fused protop last;C. Sm all cell colon ies;D. C alli grow ed on the am p li ficationm ed ium;
E. Shoot regenerated from en larged ca lli;F. Regenerated p lan tlet;G. Leaves ofD. sophia and hyb rid;H. Buds of hyb rid
图 1　融合播娘蒿和甘蓝型油菜原生质体植株再生及杂种植株
F ig. 1　　P lan t regeneration from fused protop lasts be tw eenD. soph ia and B. napus Land hybr id
3　讨论
甘蓝型油菜和播娘蒿的原生质体融合 ,尚未有
人涉足 ,所以很有意义 。本研究建立了播娘蒿与甘
蓝型油菜的原生质体融合技术体系 ,探索了影响融
合 、培养的因素 ,获得了杂种植株 ,为改良驯化播娘
蒿奠定了基础 。
4 中国油料作物学报　2005, 27(4)
MS是最初广泛用于原生质体培养的培养基 ,近
些年来应用较多的是 Km8p培养基。本实验除了应
用这两种培养基外 ,还使用了改良的 B5培养基 。
因原生质体细胞壁的再生 、细胞分裂以及愈伤组织
形成需要丰富的有机成分 ,本实验对 B5培养基进
行了改良 ,即将 B5中的有机成分用 Km8p培养基的
有机成分代替 ,取得了较好的培养效果 。因为 B5
培养基营养丰实 、无机盐浓度较低 ,适合原生质体培
养 ,再加上 Km8p培养基的有机成分 ,使得培养基能
够满足原生质体的营养要求 ,所以取得了较好的培
养效果 。 kao等 [ 16]比较了包括 B5和 Km8p培养基
在内的 8种培养基有机成分对原生质体培养的影
响 ,结果表明:Km8p有机成分配比对于甘蓝型油菜
原生质体的培养效果最好;周骥明等 [ 17]将 Km8p有
机成分添加到 MS培养基中 ,取得了诸葛菜下胚轴
原生质体培养的较好效果 。这充分说明有机成分及
培养基的选择对于原生质体培养是非常重要的 。
本实验采用了 PEG -DMSO的融合方法 ,明显
提高了融合率。这与在 PEG诱导液中加入 DMSO
可提高融合频率的结论 [ 18 ～ 22]是一致的 。与应用较
多的 PEG—高 pH、高钙法相比 ,该法不仅提高了融
合率 ,而且操作简单 ,处理量大 。由此可以认为 DM-
SO的使用对于提高融合率是必要的 。
播娘蒿是高亚麻酸油料植物[ 23] ,它具有抗酸耐
盐碱 、耐寒耐瘠薄的特性 ,不仅如此 ,我们还发现它
具有抗虫性 ,已经克隆了有关抗性基因 (待发表)。
本研究获得的材料 ,其应用价值还需进一步评估 ,至
少可以作为中间材料利用有性杂交手段向两个物种
分别转移有利基因 ,即将播娘蒿的抗性基因转移到
油菜中 ,或者将油菜较好的农艺性状转移到播娘蒿
中 。
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Production of asymm etric hybrids betweenDescura in ia sophia
and Brassica napus L utiliz ing an effic ient protoplast- fusion system
JIANG Shu - hu i, GUAN Rong - zhan, DONG H ai -b in , DU Wen -m ing
(Na tionalKey Lab of Crop Genetics and Germpa lsm Enhancement,
Nanjing Agricultura lUniversity, Nanjing 210095China)
Abstract:H igh y ield o f protoplast iso lation w as achieved from leaves ofD. sophia and co ty ledons o fB. napus
L. The iso la ted p ro toplastsw ere used fo r the estab lishment o f an efficient protoplast - fusion system betw een the tw o
cruciferous species. The best enzyme combination for iso lating pro toplast from D. sophia and B. napus was 4%
Ce llu lase +0. 5%Macerozyme+5mmol /LMES and 1%Cellulase +0. 2%M acerozyme+3mmo l /LMES, respec-
tive ly. U sing PEG -DMSO method, fusion pe rcen tage o f 10. 0% was obtained. M odified B5mediaw as the best for
the cu lture o f fused ce lls among the three liquid media B5, Km8p andM S. The bestmedia for shoo t regeneration
from calli w asM S+4. 0mg /L 6 - BA +0. 3mg /L NAA +5. 0mg /L AgNO3 , and the best roo ting media w asM S +
0. 1mg /L IBA +0. 1mg /L NAA.
Keys words:Descura in ia soph iaWeb;Cano la;Brassica napus L. ;Intergene ric somatic hyb ridization;Fusion
condition
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6 中国油料作物学报　2005, 27(4)