全 文 ：普洱市入侵植物肿柄菊和本土植物总状山蚂蝗
叶表真菌多样性的研究
*
李 伟，何淑嫱
(西南林业大学 云南生物多样性研究院，云南 昆明 650224)
摘要:通过对普洱本土植物总状山蚂蝗和入侵植物肿柄菊叶表真菌混合基因组 DNA 的提取、18SrＲNA 片段的扩
增、克隆筛选及测序分析等方法，构建了 2 种植物叶表真菌的系统发育树。结果表明，肿柄菊和不同采集地的
总状山蚂蝗叶表均生活着一些属于刺盾炱亚纲和异担子菌亚纲的真菌种类。但相对于独立生长的总状山蚂蝗，
与肿柄菊共享小生境的总状山蚂蝗叶表共有真菌种类大多表现出下降的趋势。且肿柄菊和总状山蚂蝗叶表各自
生活着一些在种类和功能上均存在差异性的真菌种类，其中生活于肿柄菊叶表的海枣粉座菌可能通过对本土植
物的抑制作用来协助肿柄菊的入侵，因此未来研究应深入探索叶表微生物与植物入侵的关系以及相关作用的机
制。
关键词:肿柄菊;总状山蚂蝗;入侵植物;叶表真菌多样性;普洱市
中图分类号:S 451 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2014)01 － 0010 － 07
Phyllosphere Fungi Diversity of a Native Species Desmodium spicatum and
an Invasive Species Tithonia rotundifolia
LI Wei，HE Shu-qiang
(Yunnan Academy of Biodiversity，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China)
Abstract:Through DNA extraction，PCＲ amplification and DNA sequencing，the conservative 18S rＲNA se-
quences of phyllosphere fungi from leaves of Tithonia rotundifolia and Desmodium spicatum were analyzed． The re-
sults showed that both plant species shared some common fungi species from the subclass of Chaetothyriomycetes
and Heterobasidiomycete，although fungi diversity found on the leaves of Desmodium spicatum was far less when this
plant was near the invader plant Tithonia rotundifolia than away from it． Also，both plant species hosted some spe-
cies-specific fungi species． In particular，invader Tithonia rotundifolia hosted Graphiola phoenicis，a notorious fungi
species for its damage on plant growth and development，which might facilitate the invasion success of Tithonia ro-
tundifolia by inhibiting native plants． Our results thus showed that phyllosphere fungi were diverse in both richness
and function for invader plant Tithonia rotundifolia and native plant Desmodium spicatum，and future study should
further explore the interactions between phyllosphere microbes and host plants as well as involving mechanisms．
Key words:Tithonia rotundifolia;Desmodium spicatum;invasive species;phyllosphere fungi diversity;Pu’er
外来入侵生物正在不断地对本土特有种及原生
生态系统构成严重威胁［1 ～ 3］，近年来，肿柄菊
(Tithonia rotundifolia)作为一种新的入侵植物，已
经开始在云南各地蔓延。肿柄菊原产于中美及墨西
第 43 卷 第 1 期
2014 年 2 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 43 No. 1
Feb. 2014
* 收稿日期:2013 － 10 － 14
基金项目:云南省教育厅科学研究基金理工类重点项目 (2012Z069)。
第一作者简介:李 伟 (1978 －)，男，云南昆明人，助理研究员，博士，主要从事植物和微生物群落研究。
DOI:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2014.01.012
哥等地，属于菊科肿柄属植物。由于肿柄菊具有较
强的繁殖能力，一旦传入到新的环境后就很容易形
成密集型单优势垄断种，从而严重威胁入侵地的本
土生物多样性水平与原生生态系统的稳定性［4］。
关于生物入侵的机制，以往的研究大多集中在
探讨入侵植物与本土动植物之间的相互关系 (比
如说竞争和捕食关系)。近年来，不少研究开始探
讨根际微生物的构成对外来入侵植物的影响，并且
揭示了一些普遍规律［5 ～ 9］。尽管植物根际是微生物
密集分布的一个重要场所，植物的叶表也分布着各
种不同的微生物。如同根际微生物一样，叶表微生
物 (Phyllosphere microbes)与植物之间同样存在着
较为复杂的相互关系［10 ～ 11］。比如一些叶表微生物
能产生吲哚-3-乙酸，从而可以调控植物的生长发
育或者增强植物的抗旱性。此外，叶表真菌分泌的
真菌生物碱能够影响植物叶片组织的化学构成，从
而帮助植物抵御来自植食天敌或者病原菌的危
害［12 ～ 16］。然而，相对于根际微生物方面的大量研
究而言，目前国内外关于叶表微生物方面的研究还
十分有限［11，16］。
叶表微生物生态学研究的一个难点在于，仅有
很小比例的叶表微生物可在实验室条件下进行培
养、分离和鉴定［17］。本项研究应用了一些分子微
生物生态学研究中的重要技术［18 ～ 19］，在无需培养
的情况下对入侵植物肿柄菊和本土植物总状山蚂蝗
(Desmodium spicatum)的叶表真菌群落多样性，特
别是对两种植物叶表特有真菌群落的种类和功能特
性进行了比较，并就叶表特有真菌对物种入侵的可
能影响作用展开了分析和讨论，为深入探讨叶表微
生物的构成及其对植物健康、植物保护、物种入侵
的影响作用等重要生态问题提供了必要的实验依
据。
1 材料和方法
1. 1 实验材料
本项实验所用的原始材料是从普洱地区采集的
本土植物总状山蚂蝗和入侵植物肿柄菊。样品的 2
个采集地均在普洱市，海拔 1 351 m，位于北纬
23°0097″，东经 101°0261″。其中采集地 1 同时生
长着本土植物总状山蚂蝗和入侵植物肿柄菊，而采
集地 2 只生长着本土植物总状山蚂蝗。在采集地 1
随机选取 10 株健康的肿柄菊植株，在采集地 1 和
2 分别随机选取 10 株健康的总状山蚂蝗植株，用
消毒的镊子收集其所有叶片，装入无菌采样袋内并
低温冷藏。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 叶表真菌 DNA提取和纯化
分别称量取自采集地 1 的肿柄菊、采集地 1 和
2 的总状山蚂蝗新鲜叶片 60 g。叶片样品先用无菌
水漂洗，再浸入洗涤缓冲液中 (0. 1M 磷酸缓冲
液，pH 7. 0)，并使用超声波清洗仪 SB3200 振荡 7
min，收集缓冲液并于 14 000 rpm 离心 5 min 后保
留沉淀用于提取 DNA。提取的 DNA 产物通过 1 %
琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切取位置正确的片
断，采用小量胶回收试剂盒对所需片断进行纯化。
1. 2. 2 PCＲ扩增
首先采用引物 NS1 和 NS6 扩增大约 400 bp 的
18S rＲNA基因的保守序列，引物序列如下，(1)NS1:
(5-3)GTA GTC ATA TFC TTF TCT T; (2)NS6:
(5-3)GCA TCA CAG ACC TFT TTA TTF CCT C;
反应体系:离子水为 35. 75μL，10 × buffer为 5 μL，
MgCl2 (25 mm)为 5μL，dNTP为 1 μL，引物 1 为
1 μL，引物 2 为 1 μL，Taq酶为 0. 25 μL，模板 DNA
为 1 μL，以上样品总体积为 50 μL。反应程序:
94℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，
共 28 个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞。待 PCＲ 完
成后，采用 1. 0 %琼脂糖凝胶电泳检测提取结果。
然后以第 1 轮的扩增产物为模板，使用引物:
SSU-1196(5-3):TCT GGA CCT GGT GAG TTT CC，
SSU-1536(5-3) :ATT GCA ATG CYC TAT CCC CA
进行第 2 轮扩增，扩增大约 500 bp 的 18S rＲNA基
因的保守序列。扩增体系、程序和 PCＲ 产物的检
测方法同第 1 轮。
1. 2. 3 PCＲ后胶回收
将所得 PCＲ 产物通过 1 %琼脂糖凝胶电泳，
并于紫外灯下切取位置正确的片断，采用小量胶回
收试剂盒对所需片断进行回收。
1. 2. 4 转化
抗性板的制作:配制 1 000 mL LB 培养基，胰
化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g;以
NaOH调节 pH 值至 7. 0，定容到 1 000 mL，按液
体重量的 1. 5 %加琼脂，配制完毕后在 115℃高温
条件下灭菌 30 min，然后加入氨苄青霉素 AMP，
使培养基的终浓度达到 100 μg /mL。
11第 1 期 李 伟等:普洱市入侵植物肿柄菊和本土植物总状山蚂蝗叶表真菌多样性的研究
大肠杆菌 HB101感受态的制备:挑取培养 12 ～
16 h的 HB101 的单菌落，置于 5 mL 未加琼脂和
AMP的 LB液体培养基中培殖 4 h (37℃恒温条件)。
把 1 mL培养物转入 1. 5 mL的离心管中，12 000 rmp
离心 1 min，弃上清液并打散细胞，然后加入 0. 5
mL 4℃预冷的 0. 075 M的 CaCl2 并冰置 10 min，随
后 12 000 rmp离心 30 s，弃去上清液，并用移液枪
小心吸干残留的上清液，再加入 4℃ 预冷的
0. 075M CaCl2;分装入 1. 5 mL 的离心管中，使每
个管含有 200 μL，便于下一步实验时使用。
连接反应体系:10 × Ligation Buffer 1 μL，
PEG4000 1 μL，pMD18-T vecter 1 μL，纯化后 PCＲ
产物 4 μL，灭菌水 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL (样
品总体积 10 μL)。混匀，在 16℃下进行连接。
转化步骤:上述全部连接产物加入 200 μL 感
受态细胞并冰置 30 min，然后在 42℃下水浴 1. 5
min和冰浴 1. 5 min，然后立即加入 1 mL 的 LB 液
体培养液，在 37℃下恒温振荡培养 1 ～ 2 h。取 200
μL培养物涂 AMP 抗性平板，在 37℃下恒温培养
12 h。
转化后 PCＲ:待 AMP抗性平板长出单菌落后，
挑取白色的单菌落。每个单菌落加到盛有 1 mL LB
液体培养基 (加有 AMP)的 1. 5 mL离心管中，并
在 37℃条件下恒温振荡培养 4 h，或在室温下培养
12 h以上，直至培养物呈现浑浊状态。然后直接
取培养菌液进行 PCＲ检测。
采用质粒的引物 M13-M4 和 M13-ＲV，相关序
列为:M13-M4(5-3)GTT TTC CCA GTC ACG AC;
M13-ＲV (5-3)CAG GAA ACA GCT ATG AC。
循环条件如下:94℃ 4 min;94℃ 30 s、60℃
30 s 、72℃ 30 s (30 cyc);72℃ 7 min;4℃ ∞。
待 PCＲ 完成后，采用 1. 0 %琼脂糖凝胶电泳检测
提取结果。
1. 2. 5 测序
将 18S rＲNA基因扩增产物送上海申速生物技
术公司进行序列测定。
1. 2. 6 物种多样性分析
用 DNASTAＲ、CHＲOMAL 2 个软件对测序结
果进行人工校对，利用 ＲDP 对人工校对过的序列
进行假序列的排除，去除假序列后剩下的序列再通
过 NCBI搜索其最相似的序列，以初步确定序列的
系统分类结果，并由此作出遗传距离树。植物叶表
提取的 DNA 保守片段序列与 NCBI 数据库中已知
的所有真菌种类保守片段相比较，从而得以从与所
测片段序列最相似的数据库序列所对应的生物信息
来推断样品中的真菌群落构成。
2 结果与分析
2. 1 叶表面真菌 18S rＲNA的获取
以肿柄菊或总状山蚂蝗叶表微生物混合 DNA基
因组为模板，NS1和 NS6为引物进行 PCＲ扩增，成
功扩增出大小在 500 bp 左右的目标带。琼脂糖凝胶
(1. 0 %)电泳检测结果见图 1a，其中第 1 ～ 3 条带
分别代表以采集地 1 的肿柄菊、采集地 1 的总状山
蚂蝗和采集地 2的总状山蚂蝗叶表真菌 18S rＲNA扩
增的产物，而 M 条带为 Mark (DNA Make DL-
2000)。转化过程完成后琼脂糖凝胶 (1. 0 %)电泳
检测扩增结果见图 1b，其中第 1 ～ 14 条带均为 PCＲ
扩增产物 (图中目标带只是许多样品中的一部分)，
而 M条带为 Mark (DNA Make DL-2000)。
图 1 叶表 18S rＲNA直接扩增结果和 M13 引物扩增后电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of 18S rＲNA PCＲ amplification products and electrophoresis of
DNA fragment amplified by MB gene primers
21 西 部 林 业 科 学 2014 年
图 2 基于 18S rＲNA序列分析构建的系统发育树
注:该系统树上标注了绝对值大于 50 %的数据支持率，并且各代表序列后标注的是代表序列所代表的各个种中
3 个样品叶表真菌的克隆数 (▲为采集地 1 肿柄菊，◇为采集地 1 总状山蚂蟥，□为采集地 2 总状山蚂蟥
Fig. 2 Phylogenetic tree inferred from 18S rＲNA
31第 1 期 李 伟等:普洱市入侵植物肿柄菊和本土植物总状山蚂蝗叶表真菌多样性的研究
2. 2 Dotur软件分析结果
由于 OTU (operational taxonomic units)的概念
已经被广泛应用在微生物多样性的研究领域，本项
实验同样通过引入 OTU 的概念来分析样品中的真
菌多样性，并根据惯例将序列相似性大于 97 % 的
定义为同 1 个 OTU 操作分类单位。因此，每个
OTU操作分类单位对应 1 个特定 18S rＲNA 序列，
即对应于 1 个不同的真菌菌种。另外，分析中采用
的 Dotur软件，是基于 OTU操作分类单位的常用微
生物多样性分析软件。经 Dotur 软件分析，将所有
的克隆分成了 32 个 OTU类别，即 32 个真菌菌种。
2. 3 系统发育树
生成系统树后，树中线段的长短代表了各个相
似序列以及各个克隆之间差异的大小，见图 2。通
过查阅各个相似序列所属的亚纲，和比较各个克隆
在树上与这些相似序列的关系远近，可以将部分克
隆归入各个亚纲。
从系统发育树中可知，与所测序列 5W438 相
似度最高的数据库系列对应刺盾炱亚纲纲下的
Coniosporium，而这种真菌广泛存在于肿柄菊和总
状山蚂蝗样品叶表。因为从采集地 2 总状山蚂蝗样
品叶表提取的 5W464 序列无法在数据库中找到与
之相似性最近的序列，也就无从知道其所代表的真
菌种类;采集地 1 肿柄菊和采集地 2 总状山蚂蝗样
品叶表提取的 5W465 序列与茶渍亚纲的 Davidiella
tassiana有着最高的相似度，而从采集地 2 总状山
蚂蝗样品叶表提取的 5W455 序列与圆盘菌亚纲的
Tetracladium marchalianum 有着最高的相似度;此
外，2W385 序列仅发现于肿柄菊样品叶表，其对
应外担子菌亚纲的 Graphiola phoenicis，而 2T71 序
列也仅发现于肿柄菊样品叶表，该序列对应小纺锤
菌亚纲的 Helicogloea variabilis。因此，这两种真菌
都可能是肿柄菊叶表特有种;6W526 序列发现于
采集地 1 总状山蚂蝗样品叶表，该序列对应异担子
菌亚纲的 Udeniomyces puniceus;5W451 序列发现于
采集地 2 的总状山蚂蝗样品叶表，该序列对应异担
子菌亚纲的 Trimorphomyces papilionaceus;2W382 序
列发现于采集地 1 肿柄菊样品叶表，其同样对应于
真菌 Trimorphomyces papilionaceus，这表明 Trimor-
phomyces papilionaceus极有可能是肿柄菊和总状山
蚂蝗叶表的共有种。
2. 4 肿柄菊和总状山蚂蝗叶表真菌类群的多样性
通过 NCBI序列比对，采集地 1 肿柄菊、采集
地 1 总状山蚂蝗和采集地 2 总状山蚂蝗样品叶表的
真菌系统分类结果见表 1。
表 1 肿柄菊和总状山蚂蝗叶表亚纲种类及比例
Tab. 1 Type and percentage of subclasses on Desmodium spicatum and Tithonia rotundifolia
门 亚纲 /物种
采集地 1
肿柄菊
▲(33)
所占百
分比 /%
采集地 2
总状山蚂
蝗◇(16)
所占百
分比 /%
采集地 3
总状山蚂
蝗□(28)
所占百
分比 /%
子囊菌门
Ascomycota
刺盾炱亚纲
Coniosporium 16 48. 5 3 18. 8 8 28. 6
茶渍亚纲
Gyalecta ulmi 8 24. 2 0 0 10 35. 7
圆盘菌亚纲
Dactylella oviparasitica 0 0 0 0 3 10. 7
外担子菌亚纲
Graphiola phoenicis 6 18. 2 0 0 0 0
担子菌门
Basidiomycota
异担子菌亚纲
Udeniomyces puniceus
Trimorphomyces papilionaceus
2 6. 1 1 6. 2 6 21. 4
小纺锤菌亚纲
Helicogloea variabilis 1 3. 0 0 0 0 0
同担子菌亚纲
Psathyrella gracilis 0 0 12 75 1 3. 6
注:表中的百分比反映的是各个植物样品中各亚纲克隆数在总克隆数中的比例，并以此来判定各个植物样品中叶表真菌的主要种群。
41 西 部 林 业 科 学 2014 年
由表 1 可知，采集地 1 的肿柄菊与采集地 2 的
总状山蚂蝗各自包含了相对较多的 5 个不同亚纲的
真菌种类，而在采集地 1 与肿柄菊混生的的总状山
蚂蝗只包含了 3 个亚纲的真菌种类。采集地 1 肿柄
菊叶表特有的 2 个亚纲的真菌为外担子菌亚纲和小
纺锤菌亚纲，并没有出现在任何总状山蚂蝗样品叶
表。同担子菌亚纲是采集地 1 和 2 的总状山蚂蝗叶
表真菌所属的亚纲，而肿柄菊样品的叶表却没有发
现任何属于该亚纲的真菌。此外，采集地 2 总状山
蚂蝗所特有纲为圆盘菌亚纲，并没有出现在采集地
1 的任何植物样品叶表。最后，异担子菌亚纲和刺
盾炱亚纲下的真菌种类在肿柄菊和总状山蚂蝗的叶
表分布具有交叉性。
3 结语
采集地 1 的肿柄菊、总状山蚂蝗以及采集地 2
的总状山蚂蝗叶表共同生活着一些属于刺盾炱亚纲
和异担子菌亚纲的真菌种类。然而，相对于采集地
2 的总状山蚂蝗，采集地 1 的总状山蚂蝗叶表共有
真菌种类出现了下降的趋势。因为宿主植物为叶表
真菌的生长发育提供了重要的养分来源，一旦宿主
植物的生理状况发生了改变，这些变化可能会在很
大程度上影响宿主植物叶表真菌的多样性水平。在
采集地 1 与入侵植物肿柄菊混生的总状山蚂蝗，其
生长发育很可能受到肿柄菊的抑制作用，故而其健
康程度会低于那些在采集地 2 生长且未受肿柄菊影
响的总状山蚂蝗。因此，这些共有真菌的多样性水
平，也许可以用来指示本土植物总状山蚂蝗的健康
状况，进而可以反映入侵植物肿柄菊对本土植物总
状山蚂蝗的影响程度。
采集地 1 的肿柄菊和采集地 2 的总状山蚂蝗样
品叶表各自生活着一些特有真菌种类。其中采集地
1 的肿柄菊叶表生活着来自外担子菌亚纲和小纺锤
菌亚纲的真菌种类，而采集地 2 的总状山蚂蝗叶表
生活着来自圆盘菌亚纲的真菌种类。一方面，这些
真菌在不同来源的植物叶表特定分布的性质可能反
映了它们选择宿主的严格性和专一性。另一方面，
这些真菌的分布格局可能反映了叶表真菌之间较强
的种间竞争关系。
对入侵植物叶表特有真菌种类的研究与探索，
也许能够帮助解释一些易被忽略的植物入侵机制。
比如在采集地 1 肿柄菊叶表生活的海枣粉座菌
(Graphiola phoenicis)是假黑粉病的病原菌种类，
其可能会对本土植物总状山蚂蝗带来十分不利的影
响。虽然本项实验中海枣粉座菌仅发现于肿柄菊的
样品表面，但并不意味着入侵植物肿柄菊处于不利
地位。事实上，肿柄菊可能与海枣粉座菌在长期的
进化过程中形成了协同进化关系，因而肿柄菊自身
可能免于海枣粉座菌的负面影响作用，而海枣粉座
菌可能会对本土植物的正常生长产生抑制作用，从
而大大提高了肿柄菊成功入侵的机会。另外，由于
本项实验中收集的是本土植物总状山蚂蝗的健康叶
片，在这些叶片上没有发现海枣粉座菌，并不代表
着总状山蚂蝗就已经幸免于该病原菌的影响作用。
因此，对总状山蚂蝗非健康态叶表真菌多样性进行
检测，更系统地了解海枣粉座菌在总状山蚂蝗的叶
表分布状况，是下一步重点研究的内容。
与生长在采集地 2 的总状山蚂蝗相比，在采集
地 1 与入侵植物肿柄菊混生的总状山蚂蝗叶表反而
支持更多的归属于同担子菌亚纲的真菌种类，可能
因为同担子菌亚纲包含了很多依赖气生孢子繁殖的
大型菌类 (如 Psathyrella gracilis)。由于这些大型
菌类对环境湿度的要求较为严格，它们大多生长在
潮湿的腐木附近。考虑到叶表环境水分的相对缺
少，这些真菌很可能不是总状山蚂蝗叶表的特有
种，而是其子实体产生的气生孢子通过风力传播到
总状山蚂蝗叶表。因此，本项研究中所观察到的现
象很可能反映了这些真菌子实体在采样地 1 和采样
地 2 的数量分布差异性，而与总状山蚂蝗自身的生
理状态并没有太大的关系。另外，同担子菌亚纲的
真菌种类并没有出现在肿柄菊叶表，这可能是因为
植株相对较高的肿柄菊的叶表湿润度普遍较低
(完全接受阳光照射)，而不适合这类真菌生长有
关。处在肿柄菊荫蔽下的总状山蚂蝗叶表湿润度可
能相对较高，从而可以支持这类真菌的生长。
因此，植物叶表真菌可能通过直接或间接的方
式影响整个植物生态系统。未来的研究应对入侵植
物叶表微生物多样性、植物叶表化学构成、入侵植
物落叶降解速度以及土壤微生物多样性等诸多方面
进行更加全面细致的调查和分析，从而深入探索叶
表微生物与植物入侵的关系以及相关作用机制。
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61 西 部 林 业 科 学 2014 年