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神经药理学报
Acta Neuropharmacologica
第 1卷第 3期
2011年 6月
Vol. 1 No. 3
June. 2011
程月芳 王彩芳 李文杰 林 青 张 旗
郑州大学药学院，郑州，450001，中国
【摘要】 目的：探讨蜂斗菜素（petasin）对人神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH增殖抑制作用的机制。方法：采用罗
丹明 B（SRB）法检测蜂斗菜素对肿瘤细胞的增殖抑制作用；采用流式细胞术观察蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞周
期和凋亡的影响；采用 Hoechst 33258染色法观察蜂斗菜素对 SK-N-SH凋亡的影响；蛋白免疫印迹法（Western
Blotting） 检测蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞 ERK1/2蛋白磷酸化的影响。结果：蜂斗菜素对 SK-N-SH，SGC7901，
SPC-A-1，SMMC 7721，Ec9706，SK-N-BE（2）和 U251细胞有不同程度的抑制作用。蜂斗菜素使 SK-N-SH细胞的
周期阻滞于 G0/G1期，但不诱导其凋亡，且下调 ERK1/2蛋白的磷酸化水平。结论：蜂斗菜素是一种潜在的抗肿
瘤天然化合物，其机制为抑制细胞增殖，但不诱导其凋亡。其分子机制可能包括下调 ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
【关键词】 蜂斗菜素；SK-N-SH；细胞；增殖；ERK1/2
【中国分类号】 R961 【文献标识码】 A 文章编号：2095-1396（2011）03-0001-006
Antiproliferation Effects of Petasin on Human Neuroblastoma
SK-N-SH Cells
CHENG Yue-fang，WANG Cai-fang，LI Wen-jie，LIN Qing，ZHANG Qi
School of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou，450001，China
【ABSTRACT】 Objective：To study the antiproliferation effects of petasin on human neuroblastoma
SK-N-SH cells and the possible mechanisms involved. Methods：The inhibitory effects of petasin on
proliferation of tumor cells were detected by SRB assay；the effects of petasin on cell cycle arrest of SK-
N-SH were measured by flow cytometry；the effects of apoptosis were examined by Hoechst 33258 stain-
ing and flow cytometry and the phosphorylation of ERK1/2 of SK-N-SH was determined by western
blotting. Results：Compared to that of other cancer cell lines such as SGC7901，SPC-A-1，SMMC 7721，
Ec9706，SK-N-BE （2） and U251，the proliferation of SK-N-SH cells was strongly inhibited by petasin. Af-
ter treated with petasin，the cell cycle of SK-N-SH was arrested in G0/G1 phase，and there was no apopto-
sis detected either by Hoechst 33258 staining or by flow cytometry analysis. Finally，the phosphorylation
of ERK1/2 was decreased by pretreatment with petasin in a dose-dependent way. Conclusion：Petasin is a
potential anti-tumor of natural compounds，and shows the strong antiproliferation effect on SK-N-SH cells
without inducing apoptosis. The inhibition of ERK1/2 phosphorylation might be involved in the antiprolif-
eration effects of petasin.
【KEY WORDS】 petasin；SK-N-SH；cell；proliferation；ERK1/2
蜂斗菜素抑制人神经母细胞瘤细胞 SK-
N-SH 增殖作用机制研究
基金项目： 国家自然科学基金项目（No.30800328），河南省高校科技创新人才项目
作者简介： 程月芳，女，硕士研究生；研究方向：神经肿瘤药物；Tel：+86-371-67781908
通讯作者： 张旗，男，教授，硕士生导师；研究方向：神经精神药理学；Tel & Fax：+86-371-67781908，Email：zhangqipku@hotmail.com
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第 1卷第 3期
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Vol. 1 No. 3
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神经母细胞瘤（neuroblastoma）是一种节后交感神
经系统的胚胎性恶性肿瘤，为儿童最常见的颅外实体
肿瘤之一。该肿瘤有着极高的致死率，而现有的化疗药
物对其缺乏选择性，且毒副作用大。为此，发现并研究
新的抗神经母细胞瘤的药物不仅有重要的科学理论意
义，更具有重要的临床应用价值。
蜂斗菜是一种药食两用的植物，蜂斗菜素（petasin）
是蜂斗菜中的主要活性成分之一。一些研究表明蜂斗
菜素是蜂斗菜预防偏头痛的主要成分之一［1-2］，蜂斗菜
的提取物具有抗肿瘤活性［3］。我们研究了蜂斗菜素对
人神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH增殖的抑制作用及其作
用机制，为蜂斗菜素应用于神经母细胞瘤的预防和治
疗提供初步的实验依据。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
蜂斗菜素（纯度 >99%），郑州大学药学院提供，以
二甲基亚砜（DMSO；Amresco，ACS Grade）溶解配制成
100 mmol·L-1的原药贮存液，4℃保存。
DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium），
DMEM/F12（1∶1），RPMI 1640 培养基，青霉素、链霉
素均购自于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公
司；胎牛血清（无噬菌体，低内毒素）购自杭州四季青生
物工程材料有限公司；Tris碱，硫基罗丹明 B蛋白染料
（SRB），核糖核酸酶（RNase），碘化丙啶（PI）均购自于
美国 sigma公司；细胞凋亡 Hoechst 33258荧光检测试
剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；AnnexinV-
FITC试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司；抗β-actin
抗体 （兔抗人），抗 p-ERK 抗体（鼠抗人）购自 Santa
Cruz 公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 细胞系和细胞培养
人神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH，北京协和医科所
惠赠；人神经母细胞瘤细胞 SK-N-BE（2）、人胶质瘤细胞
U251由中科院细胞库（上海）提供；人肝癌细胞 SMMC
7721、人胃癌细胞 SGC7901、人食管癌细胞 Ec9706为
本实验室保存。
SK-N-SH，SMMC 7721 和 U251 均 在 DMEM 完
全培养基中培养，SK-N-BE（2） 在 DMEM/F12（1∶1）完
全培养基中培养，SGC7901 和 Ec9706 在 RPMI 1640
完全培养基中培养；完全培养基即补充有 10% （v/v）胎
牛血清、100 U·mL-1青霉素和 100 μg·mL-1链霉素的
DMEM，DMEM/F12（1∶1）或者 RPMI 1640 培养基。
培养箱中保持 37℃，5% CO2。
1.3 实验方法
1.3.1　细胞活性分析
细胞活性通过罗丹明 B（SRB）法［4-5］分析测定。取
对数生长期细胞，以 5×103个 /孔接种于 96 孔培养板中。
24 h后对照组和实验组分别加入空白培养基和不同浓度
的蜂斗菜素，溶剂对照为稀释浓度与最大浓度药物相同
的 DMSO，5% CO2，37℃孵育 72 h （SK-N-SH细胞分别作
用 24 h，48 h,72 h）。贴壁细胞每孔加预冷的 50 % TCA液
50 μL，4℃固定 1 h，去离子水洗 5遍。空气干燥后每孔加
50 μL 0.4 % SRB液室温避光染色 10~15 min，1% 醋酸液
洗 5遍。干燥后加入 150 μL 10 mmol·L-1非缓冲 Tris碱
液（pH 10.5），515 nm波长处全波长酶标仪（Spectra Mr型；
美国 DYNEX公司）测定每孔的 OD值。SPSS 15.0计算
IC50，并计算各组的生长抑制率 [GI（生长抑制率） =（1- 药
物组 OD值 /溶剂对照组 OD值）×100%]。
1.3.2　流式细胞术测细胞周期和凋亡
取对数生长期的 SK-N-SH细胞，以 1×105个 /孔
接种于 6孔板中。培养 24 h贴壁后，对照组和实验组
分别加入培养基和蜂斗菜素。药物分别作用 24 h或
48 h 后，收集细胞，用 PBS 洗涤 2 次，70% 的冰乙醇
1 mL固定细胞，4℃过夜。然后用冰 PBS洗涤 3次，加入
0.1% Triton X-100 100 μL，室温 20 min，加入 20 mg·L-1
RNase 100 μL 降解 RNA，室温放置 20~30 min，再加
入 20 mg·L-1 PI 50 μL，标记 5 min后，流式细胞仪（BD
FACSCalibur）检测细胞周期分布情况。
细胞凋亡的检测方法：药物作用 72 h后，收集细胞，
PBS洗涤 2次。调整细胞浓度为（0.5~1）×109·L-1，取 195 μL
细胞悬液，加入 5 μL Annexin V-FITC染色 3 min；加入
10 μL浓度为 20 mg·L-1的 PI室温避光孵育 10 min；加
入 300 μL缓冲液，PBS定容至 1 mL后流式细胞仪检测
细胞凋亡，并利用 Cell Quest软件分析细胞凋亡。
1.3.3　Hoechst 33258荧光染色观察细胞核的变化
取对数生长期的 SK-N-SH 细胞，以 1×105 个 /
孔接种于 6 孔板中（内置洁净灭菌的盖玻片）。培养
24 h后，对照组和实验组分别加入培养基和蜂斗菜素
（0.4~1.6 μmol·L-1），作用 72 h。吸去培养液，加入 4%
中性甲醛固定液 1 mL，4℃固定细胞 10 min；吸去固定
液，PBS 洗两遍；以 Hoechst 33258 室温染色 10 min。
荧光显微镜（尼康 80i；激发波长为 340 nm）下观察细
胞形态并采集图像。随机取 5个视野区域，Nikon NIS-
Elements Basic Research软件测细胞凋亡率。
1.3.4　蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测
分别收集 6 孔板中 0~1.6 μmol·L-1 蜂斗菜素作
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用 30 min的 SK-N-SH细胞，加入细胞裂解液（每个样品
100 μL RIPA，1 μL PMSF，1 μL磷酸酶抑制剂）冰浴裂
解 30 min。4℃，12 000 r·min-1离心 15 min，取上清。Bicin
choninic acid（BCA）法测定蛋白含量，10% SDS-PAGE凝
胶电泳分离蛋白后，转移至 PVDF膜，5%的脱脂奶粉
封闭 2 h，一抗（1∶500，鼠抗人 pERK抗体） 4℃过夜。
TBST漂洗，加入二抗（1∶8000，辣根过氧化物酶标记的
羊抗兔或鼠抗兔抗体）孵育 1 h，再次漂洗后用增强化学
发光法（ECL）进行显色。并用 Image pro plus 6.0软件比
较条带的积分光密度（Integrated optical density，IOD）。
1.4　统计学方法
结果以均数±标准差（x-±s）表示，IC50 值均为 3
次以上实验结果的平均值。利用 SPSS 15.0统计软件
进行单因素方差分析（One-Way ANVOA）及 LSD组间
多重比较检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　蜂斗菜素对肿瘤细胞的增殖抑制作用
SRB法结果显示 (Tab.1)，蜂斗菜素对人胶质瘤
F i g . 1 Petas in inhibited
SK-N-SH cell proliferation on
concentration and time dependent
SK-N-SH cells were treated
wi th d i ffe ren t concent ra t ion of
petasin for 24 h， 48 h， 72 h. Cyto-
toxicity was measured by the SRB
assay. Pictures （100×magnification）
of cells were taken by inverted micro-
scope. A： Control； B： 0.4 μmol·L-1；
C： 0.8 μmol·L-1； D： 1.6 μmol·L-1；
E： The line chart of inhibitory ratio，
24 h（──）， 48 h（┈┈）， 72 h（---）.
The results were shown as mean ±
standard deviation （x-±s，n = 6）.
A
C
B
D
E
细胞 U251，人肝癌细胞 SMMC7721，人胃癌细胞
SGC7901，人食管癌细胞 Ec9706和人神经母细胞瘤细
胞 SK-N-BE（2），SK-N-SH均有一定的抑制作用。其对
SK-N-SH细胞的抑制作用最强。
Tab.1 The antiproliferation effects of petasin on the
cancer cell lines
cell lines IC50（μmol·L-1）
Human hepatocellular carcimoma cell lines
SMMC 7721
18.7
Human gastric cancer cell 1ines SGC7901 59.3
Human esophageal epithelia cell 1ines Ec9706 48.7
Human astroglioma cell lines U251 78.3
Human neuroblastoma cell lines SK-N-SH 0.8
Human neuroblastoma cell lines SK-N-BE（2） 60.2
Cells were treated with different concentration of petasin for
72 h，then the SRB assay was used to measure cell numbers（n=3）.
2.2　蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞的抑制作用呈时间和
浓度依赖性
蜂斗菜素处理 SK-N-SH细胞 72 h后，倒置显微镜
下观察细胞，其形态学未发现明显改变（Fig.1A-D），我
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们进一步的实验发现蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞增殖抑
制作用呈明显的浓度及时间依赖性（Fig.1E），蜂斗菜素对
SK-N-SH细胞作用不同时间后的半数抑制率（IC50）分别
为 2.4，1.4，0.8 μmol·L-1。
2.3 蜂斗菜素使人神经母细胞瘤 SK-N-SH细胞周期
阻滞于 G0/G1期
蜂斗菜素影响 SK-N-SH细胞的周期分布（Fig.2），蜂
斗菜素作用24 h后，导致SK-N-SH细胞G0/G1期升高（与
对照组相比 0.8，1.6 μmol·L-1组分别升高 2.4%，6.5%），
S期下降（与对照组相比 0.8，1.6 μmol·L-1组分别下降了
0.8%，9.2%）。蜂斗菜素作用 48 h后，SK-N-SH细胞的
G0/G1期升高更明显（与对照组相比 0.8，1.6 μmol·L-1
组分别升高 6.2%，8.9%），S期下降（与对照组相比 0.8，
1.6 μmol·L-1组都下降了 4.3%）。上述结果表明蜂斗菜
Fig. 2 Effects of petasin on SK-N-SH cell cycle
SK-N-SH cells were treated with vehicle or 0.8 μmol·L-1，1.6 μmol·L-1 petasin for 24 h，48 h. Then cells were
collected and the cell cycle was measured by flow cytometry. A： Cell cycle analysis by flow cytometry； B： Histogram
of cell cycle：vehicle （white bars），0.8 μmol·L-1 （grey bars），1.6 μmol·L-1 （black bars）.
素将 SK-N-SH细胞周期阻滞于 G0/G1期。
2.4　Hoechst 33258染色观察 SK-N-SH细胞形态
诱导细胞凋亡，抑制细胞的增殖是化疗药作用肿
瘤细胞的一个可能的作用机制。我们通过 SK-N-SH细
胞的 Hoechst 33258荧光染色实验发现，对照组和不同
浓度蜂斗菜素组细胞核均呈正常均匀微弱的蓝色荧光
（Fig.3），说明蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞凋亡的影响与
对照组相比无明显影响。
2.5　流式细胞仪检测蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞凋亡
的影响
为了进一步证实蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞凋亡的
影响，我们以顺铂为诱导 SK-N-SH细胞凋亡的阳性药
物，利用流式细胞仪对 SK-N-SH细胞进行了凋亡检测。
结果显示蜂斗菜素（0.8 μmol·L-1）作用 72 h后 SK-N-SH
A
B
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Fig.3 The effect of petasin on
SK-N-SH cells apoptosis by Hoechst
33258 fluorescence staining
SK-N-SH cells were treated with
vehicle，or 0.4 μmol·L-1，0.8 μmol·L-1
and 1.6 μmol·L-1 of petasin for 72 h.
Then cells were stained with Hoechst
33258. Pictures （200×magnification） of
cells were taken by fluorescence micros-
copy （Nikon 80i）. A：Control； B： 0.4
μmol·L-1 petasin； C： 0.8 μmol·L-1
petasin； D：1.6 μmol·L-1 petasin；
E：Statistical results of apoptosis cells
in different groups. The results were
shown as mean±standard deviation
（x-±s，n = 5；P>0.05 vs control）.
A
C
B
D
E
Fig. 4 The effect of petasin on SK-N-SH cells apoptosis by flow cytometry
Cells were treated with vehicle，0.8 μmol·L-1 petasin or 5 μmol·L-1 cisplatin for 72 h，respectively. Then cells were
collected to detect apoptosis by flow cytometry. A： Apoptosis analysis by flow cytometry； B： Statistical results of apopto-
sis in different groups. The results were shown as mean ±standard deviation （x-±s，n=3；* P < 0.05 vs control）.
A
B
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细胞的凋亡与对照组相比无明显变化（P>0.05）；而顺铂
（5 μmol·L-1）在相同条件下则明显的诱导了 SK-N-SH细
胞的凋亡（与对照组相比 P<0.05，见 Fig.4），这证实了
Hoechst 33258荧光染色实验的结果，蜂斗菜素对 SK-N-
SH细胞的凋亡无明显影响。
2.6　蜂斗菜素对 ERK1/2磷酸化的影响
为了进一步研究蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞增殖抑制
作用的机制，我们检测了 ERK1/2蛋白的磷酸化水平。从
Fig.5中可以看出，1.6 μmol·L-1的蜂斗菜素作用 SK-N-SH
细胞后，ERK1/2蛋白的磷酸化水平明显下调（P<0.05）。
相对特异性。进一步对蜂斗菜素的作用机制进行分析，
发现蜂斗菜素使 SK-N-SH细胞周期阻滞在 G0/G1期
（Fig.2）。在细胞增殖周期中，G0/G1期、S期和 G2/M期
之间存在着影响细胞周期进行的调控点，而药物可能通
过影响这些调控点来影响细胞的增殖，不同的药物可影
响细胞周期的不同阶段［6-7］。蜂斗菜素对细胞周期的阻
滞可能是其对 SK-N-SH细胞增殖抑制作用的机制之一。
抗肿瘤化合物可通过诱导细胞凋亡起到抗肿瘤作
用［8］。我们以顺铂为诱导 SK-N-SH细胞凋亡的阳性
对照药物，分析了蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞凋亡的影
响［9］，结果表明顺铂诱导了 SK-N-SH细胞的凋亡，而蜂
斗菜素在相同条件下并没有诱导 SK-N-SH细胞发生凋
亡。另外，Hoechst 33258荧光染色实验也表明了蜂斗
菜素没有诱导 SK-N-SH细胞凋亡。这说明蜂斗菜素并
非是通过诱导细胞凋亡来抑制 SK-N-SH细胞增殖的。
细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated pro-
tein kinases，ERK）是丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-
activated protein kinase，MAPK）家族的一个重要成员，
参与细胞增殖，分化，凋亡和细胞存活等多种生物学反
应。许多刺激因子，如表皮生长因子（epidermal growth
factor，EGF）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、
蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）的激活物及 Src家族
成员等，均可激活 ERK途径的 Ras蛋白，从而启动 ERK
通路。磷酸化激活的 ERKl/2由胞质转位到核内，进而介
导 Elk-1，ATF，NF-κB，Ap-1，c-fos和 c-Jun的转录。理论
上，干预 Ras/Raf /MEK/ERK任何一种激酶都有可能阻止
肿瘤的生长，因此，参与 ERK信号通道的各级分子都有
可能成为治疗肿瘤的潜在靶目标［10-13］。本实验发现蜂斗
菜素下调了SK-N-SH细胞的ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
这说明蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞的增殖抑制可能是触
发了 ERK相关的信号通路。蜂斗菜素可能抑制了 ERK
的磷酸化或者 ERK上游相关的蛋白的表达。
综上所述，蜂斗菜素对 SK-N-SH细胞有强效的增
殖抑制作用，并不诱导细胞凋亡。其分子机制可能是下
调 ERK1/2蛋白的磷酸化水平，抑制 SK-N-SH细胞增殖。
而且蜂斗菜素来源于天然的蔬菜中，固有的低毒性，使其
成为具有细胞抑制作用化合物的潜在来源。
参　考　文　献
1 Lipton RB，Gobel H，Einhaupl KM，et al. Petasites hybridus
root （butterbur） is an effective preventive treatment for migraine
［J］. Neurology，2004，63（12）：2240-2244.
3　讨论
近年来对蜂斗菜的研究主要集中在抗炎，抗过敏以
及偏头痛的预防和治疗。文献报道蜂斗菜素是蜂斗菜
预防偏头痛的主要活性成分之一［1-2］。另外，有报道称
硫蜂斗菜素（s-petasin）可以诱导前列腺癌细胞 PC3凋
亡［3］。我们的实验结果也说明蜂斗菜素对 SK-N-SH细
胞的体外增殖有明显的抑制作用（作用 72 h后，IC50低
至 0.8 μmol·L-1），并且这种抑制作用对 SK-N-SH细胞有 （下转第 22页）
Fig. 5 Petasin suppressed the phosphorylation of
ERK1/2
SK-N-SH cells were treated with vehicle， 0.4 μmol·L-1，
0.8 μmol·L-1 and 1.6 μmol·L-1 of petasin for 30 min， respec-
tively. Cells were collected， and total proteins were extracted for
western blotting. A： The representative western blotting bands
of p-ERK1/2 and β-actin； B： Statistical results of western
blotting. The results were shown as mean ±standard deviation
（x-±s，n=3；* P<0.05 vs control）.
B
Petasin（μmol·L-1）
p-ERK1/2
β-Actin
0
A
0.4 0.8 1.6
44 kD▲
▲
▲
42 kD
42 kD
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