全 文 ：蜂斗菜素对人胃癌 SGC7901 细胞增殖抑制和诱导凋亡作用
姚 莉， 武兴斌， 秦 龙
(兰州大学第二医院药学部，甘肃 兰州 730030)
收稿日期:2015-08-05
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金 (lzujbky-2013-216);甘肃省自然科学基金项目 (1606ＲJZA116)
作者简介:姚 莉 (1971—) ，女，硕士，副主任药师，研究方向为肿瘤药理学。Tel: (0931)8942581，Email:ldeyyl@ 163． com
摘要:目的 观察蜂斗菜素对人胃癌细胞 SGC7901 增殖及凋亡影响，并探讨其作用机制。方法 磺酰罗丹明 B (Sul-
forhodamine B，SＲB)法检测细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡及周期阻滞，免疫印迹法 (Western blot)
检测肿瘤抑制基因 p53 蛋白的表达及细胞外信号调节激酶 1 /2 (EＲK1 /2)磷酸化水平。结果 蜂斗菜素作用 24、48、
72 h后对人胃癌 SGC7901 细胞均有显著的增殖抑制作用，并具有剂量和时间依赖性;与对照组相比，蜂斗菜素作用
48 h后 G1 /G0期细胞比率增加，S期及 G2 /M期细胞比率下降，细胞凋亡率升高;和对照组相比，蜂斗菜素作用48 h
后，细胞中 p53 蛋白表达显著增加增加，EＲK1 /2 磷酸化水平则显著降低。结论 蜂斗菜素对人胃癌 SGC7901 细胞具
有增殖抑制、细胞周期阻滞及诱导凋亡作用，其机制可能与增加 p53 蛋白表达和降低 EＲK1 /2 磷酸化水平有关。
关键词:蜂斗菜素;SGC7901;凋亡;p53;EＲK1 /2
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)10-2263-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 10. 035
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，占消化道恶性肿
瘤的首位，每年约有 40 万新发病例，是一种严重威胁人民
身体健康的疾病［1］。胃癌常规的治疗手段之一为化疗，但
化疗药物带来的毒副作用严重影响患者的生活质量。近年
来中草药在肿瘤治疗中的应用越来越受到重视，从药食两
用植物蜂斗菜中提取物的成分之一蜂斗菜素具有诱导肿瘤
细胞凋亡的作用［2-3］。本研究以人胃癌细胞 SGC-7901 为模
型，观察了蜂斗菜素对细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影
响，并初步探讨其作用机制，以期为蜂斗菜素应用于临床
胃癌治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 细胞培养 胃癌 SGC7901 购自中科院上海细胞库，
在含有 10%的 FBS、100 U /L 青霉素、100 mg /L 链霉素的
ＲPMI-1640 培养基中，于 37 ℃、5% CO2 孵箱中培养，3 d
传代一次，取对数期细胞为实验对象。
1. 2 试剂及设备 蜂斗菜素 (批号 20141015，西安天瑞
生物技术有限公司);ＲPMI-1640 培养基 (批号 W15015，
北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司) ;胎牛血清
(FBS，批号 151203，上海依科赛生物制品有限公司) ;硫
基罗丹明 B 蛋白染料 (SＲB，批号 s1402，美国 Sigma 公
司) ;DMSO (批号 150104，碧云天生物技术研究所) ;细
胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 (批号 CA1510，北京鼎国生
物技术有限责任公司) ;抗 p-EＲK1 /2、p53 抗体 (批号 sc-
81492，sc-126，美国 Santa Cruz 公司) ;二氧化碳培养箱
(E191 型，美国 SIM 公司) ;酶标仪 (SpectraMr 型，美国
DYNEX公司) ;FACS Calibur 型流式细胞仪 (美国 BD 公
司);Z-323 型高速冷冻离心仪 (德国 HEＲMLE公司)。
1. 3 方法
1. 3. 1 SＲB 法检测细胞活性 取对数生长期细胞，以
2 × 104 /孔接种于 96 孔培养板中。细胞分为实验组和对照
组，接种 24 h后分别加入不同浓度的蜂斗菜素和空白培养
基，根据文献［3］蜂斗菜素的浓度设定为 25、50、
100 μmol /L。5% CO2、37 ℃孵育 24、48、72 h。采用 SＲB
染色，515 nm波长处全波长酶标仪测定每孔的光密度值
(D值)。计算各组的生长抑制率 ［生长抑制率 = (1 － 药
物组 D值 /溶剂对照组 D 值) × 100%］。所有试验每个浓
度均设置 6 个复孔，所有试验均重复 3 次。
1. 3. 2 流式细胞术测定细胞周期和凋亡 实验分组及细胞
接种同“1. 3. 1”项。取对数期生长期的细胞以 5 × 105 /孔
接种于 6 孔板，孵育箱中培养 48 h，给予终浓度分别为 25、
50、100 μmol /L的蜂斗菜素，继续培养 48 h。用 4 ℃预冷
的 PBS 洗涤细胞 3 次，0. 25% 的胰酶消化细胞，离心
(1 000 r /s，5 min)，收集细胞，根据细胞周期与细胞凋亡
检测试剂盒说明书调整合适的细胞浓度，采用流式细胞仪
检测细胞周期和凋亡。
1. 3. 3 Western blot 检测 p53、EＲK1 /2 蛋白的表达 实验
分组同“1. 3. 1”项。取对数生长期的 SGC7901 细胞接种
于 6 孔板中，给予 25、50、100 μmol /L 的蜂斗菜素作用
48 h，预冷的 PBS冲洗两次，给予含适量含蛋白酶抑制剂
及 /或磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰浴作用 30 min。刮下
细胞，4 ℃离心 (25 000 r /s，15min)，取上清，BCA 法测
定蛋白含有量，分装后 － 20℃保存备用。利用 10% SDS-
PAGE凝胶电泳分离蛋白质，转移至 PVDF 膜上，5%的脱
脂奶粉封闭 2 h，一抗 (P53 抗体 1 ∶ 500 稀释，p-EＲK1 /2
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抗体 1 ∶ 10 000 稀释)4 ℃过夜后，TBST 漂洗 (10 min /
次，3 次)，加入二抗 (1 ∶ 1 000 稀释)室温孵育 2 h，ECL
法显色。应用 Image pro plus V7. 0 软件分析条带的积分光
密度。
1. 4 统计学方法 实验结果以 x ± s 表示，数据用 SPSS
17. 0 软件进行分析。结果“2. 1”项采用双因素方差分析，
其余所有数据均进行单因素方差分析及 LSD-t 组间多重比
较，P ＜ 0. 05 即认为有统计学意义。
2 结果
2. 1 蜂斗菜素对 SGC7901 胃癌细胞的增殖抑制作用 从
表 1 中可以看到，加入药物作用 24、48、72 h 后，不同浓
度的蜂斗菜素均对 SGC7901 胃癌细胞的增殖有显著的抑制
作用 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)，并且呈剂量和时间依赖性，
两者之间没有交互作用 (P ＞ 0. 05)。
表 1 蜂斗菜素对 SGC7901 细胞增殖的影响(x ± s，n =3)
组别
剂量 /
(μmol·L －1)
抑制率 /%
24 h 48 h 72 h
对照组 － 0 0 0
蜂斗菜素组 25 27. 21* 32. 01* 35. 12*
蜂斗菜素组 50 38. 75* 49. 24＊＊ 58. 45＊＊
蜂斗菜素组 100 51. 96＊＊ 62. 32＊＊ 79. 58＊＊
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
2. 2 蜂斗菜素对 SGC7901 胃癌细胞周期和凋亡率的影响
如表 2 所示，给予不同浓度的蜂斗菜素作用 48 h 之后，
各组 G0 /G1 期细胞比率升高 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，S 期
及 G2 /M期细胞比率降低 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，并且具有
一定的浓度依赖性，表明蜂斗菜素能够将细胞阻滞于 G0 /
G1 期，阻止细胞进入 S 期及 G2 /M 期。同时蜂斗菜素作用
之后细胞凋亡率升高 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。
表 2 蜂斗菜素对 SGC7901 细胞周期及凋亡率的影响 (x ± s，n =3)
组别 剂量 /(μmol·L －1)
细胞周期 /%
G0 /G1 S G2 /M
凋亡率 /%
对照组 － 55. 36 ± 0. 45 25. 41 ± 0. 23 17. 27 ± 0. 12 10. 23 ± 0. 25
蜂斗菜素组 25 64. 17 ± 0. 56* 18. 13 ± 0. 84* 12. 11 ± 0. 16＊＊ 31. 01 ± 0. 74*
蜂斗菜素组 50 69. 32 ± 0. 64* 14. 69 ± 0. 22＊＊ 10. 23 ± 0. 11＊＊ 49. 58 ± 0. 54＊＊
蜂斗菜素组 100 78. 14 ± 0. 31＊＊ 10. 56 ± 0. 13＊＊ 8. 35 ± 0. 19＊＊ 60. 54 ± 0. 97＊＊
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
2. 3 蜂斗菜素对 SGC7901 细胞 p53 及 EＲK1 /2 蛋白表达的
影响 如图 1 及表 3 所示，不同浓度的蜂斗菜素作用 48 h
后，和对照组相比，细胞中 p53 蛋白表达显著增加 (P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01)，EＲK1 /2 磷酸化水平则显著降低 (P ＜
0. 01) ，并具有浓度依赖性。
图 1 蜂斗菜素对 p53 和 p-EＲK1 /2 蛋白表达的影响
表 3 蜂斗菜素对 P53 及 p-EＲK1 /2 蛋白表达的影响 (x ±
s，n =3)
组别
剂量 /
(μmol·L －1)
p53 /β-Actin
p-EＲK1 /2 /
β-Actin
对照组 0. 98 ± 0. 09 2. 37 ± 0. 41
蜂斗菜素组 25 1. 59 ± 0. 12* 1. 91 ± 0. 31＊＊
蜂斗菜素组 50 2. 38 ± 0. 24* 1. 23 ± 0. 10＊＊
蜂斗菜素组 100 3. 86 ± 0. 35＊＊ 0. 56 ± 0. 02＊＊
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
3 讨论
目前化学治疗是治疗胃癌的主要手段之一，但是化疗
药物带来的毒副作用促使人们寻求更安全有效抗肿瘤药物。
研究显示，从药食两用植物蜂斗菜中提取的成分活性之一
蜂斗菜素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作
用［3］，本研究也发现蜂斗菜素剂量依赖性对 SGC7901 胃癌
细胞的增殖有显著的抑制作用。为了进一步研究其抗胃癌
作用，我们观察蜂斗菜素对胃癌细胞周期及凋亡率的影响。
蜂斗菜素作用 48h之后，SGC7901 细胞 G0 /G1 期比率升高，
S期及 G2 /M期比率降低，细胞凋亡率升高，提示蜂斗菜素
能够将细胞阻滞于 G0 /G1 期，阻滞细胞进入 S 期及 G2 /M
期，阻滞肿瘤细胞 DNA 的合成，从而抑制细胞有丝分裂。
本实验接着初步研究了蜂斗菜素周期阻滞及诱导凋亡的
机制。
p53基因是一种功能强大的抑癌基因，它编码的蛋白
质是一种转录因子，能够控制着细胞周期的启动及诱导肿
瘤细胞凋亡。细胞周期是指细胞从上一次分裂完成开始到
下一次分裂结束所经历的全过程，包括即 DNA 合成前期
(G1 期)、DNA 合成期 (S 期)、DNA 合成后期 (G2 期)
和有丝分裂期 (M期)。在细胞周期中，p53 的调控功能主
要体现在 G1 和 G2 /M 期校正点的监测。p53 下游基因 p21
编码蛋白是一个依赖细胞周期调控蛋白的蛋白酶抑制剂，
能够引起细胞周期阻滞与凋亡［4-7］。目前，对 p53 促进细胞
凋亡的功能已经进行了大量的研究。p53 通过上调促凋亡
基因 Bax的表达水平，以及下调抑凋亡基因 Bcl-2 的表达共
同完成促进细胞凋亡作用［8］。另外，p53 还可通过调控死
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亡信号受体蛋白途径中相关受体 (TNF 受体等)和蛋白
(Fas 蛋白等)诱导凋亡［9-11］。本研究中，蜂斗菜素作用
48 h后，细胞中 p53 蛋白表达显著增加，与文献报道一致，
提示蜂斗菜素可能是通过直接上调 SGC7901 细胞中 p53 蛋
白的水平，引起下游相关蛋白的变化，共同参与周期阻滞
和诱导凋亡的过程。
p53 介导的细胞信号转导途径与细胞内其它信号转导
通路间的联系十分复杂。胞外信号调节激酶 (extracellular
signal-regulated kinase，EＲK)是丝裂原活化蛋白激酶 (mi-
togen-activated protein kinase，MAPK)家族的一员，参与调
控如细胞生长、发育、分裂、死亡等。研究表明 EＲK/12
参与调控肿瘤细胞的凋亡与周期［12-14］。程等的研究证实蜂
斗菜素能够通过下调 ＲK1 /2 蛋白的磷酸化水平诱导人神经
母细胞瘤细胞的增殖［3］。在研究肝纤维化过程中，学者发
现天然产物四甲基吡嗪 (TMP)在激活 p53 蛋白的同时，
有效的抑制了细胞 EＲK1 /2 蛋白表达，从而激活了 Caspase-
dependent途径引起肝星状细胞体外凋亡［15］。我们的数据
也显示给予蜂斗菜素作用后，EＲK1 /2 磷酸化水平显著降
低，这表明蜂斗菜素可能通过上调 p53 蛋白表达及下调
EＲK1 /2 磷酸化水平来发挥其周期阻滞及诱导凋亡作用的。
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