全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
454测序法在环境微生物生态研究中的应用
徐晓宇 1 刘和 2
( 1江南大学医药学院,无锡 214122; 2江南大学环境与土木工程学院,无锡 214122)
摘 要: 传统的 Sanger测序技术虽已成熟, 但其速度和成本的限制满足不了大规模测序的要求。第二代高通量测序技
术结合了乳胶微粒和皮升级反应的 454焦磷酸测序法, 作为一种高通量测序技术, 具有分析结果准确、高速、高灵敏度和高自
动化的特点。对 454测序法的技术原理和操作步骤进行了介绍, 对近年来运用该方法在环境微生物生态研究领域的进展进行
了综述。
关键词: 454测序 环境微生物生态 宏基因组
Application of 454 Sequencing in EnvironmentalM icrobial Ecology
Xu X iaoyu
1 L iu H e2
(
1
School of M edicine and Pharmaceutical, W ux i 214122;
2
School of Environment
and CivilEngineering J iangnan University, Wux i 214122)
Abstrac:t There has been a des ire to increase the throughput o f DNA sequenc ing ever since Sanger sequencing by cha in te rm ina
tion o r fragmentation techn iques coupled w ith e lectrophoretic size separa tion454 sequenc ing is the py rosequenc ingw hich comb ined w ith
m icroflu id ics and p ico lite r reaction In th is article, the deve lopm ent o f the 454 sequenc ing system was discussed, and the app lication of
454 sequenc ing in env ironm enta lm icrob ia l eco logy w as rev iew ed
Key words: 454 sequenc ing Env ironm ental m icrob ia l ecology M etagenom ics
收稿日期: 20090930
基金项目:江苏省科技支撑计划社会发展项目 ( BE2008627)
作者简介:徐晓宇,女,硕士,研究方向:环境微生物; Ema i:l iist@ j iangn an edu cn
自 Sanger测序法 1977年问世以来, 因其准确、
读长较长的优点而被广泛应用,但是这种测序方法
效率较低,科学的发展需要更高通量的测序平台,包
括 454测序技术在内的新的测序方法应运而生。
454测序法是以 DNA扩增的乳胶系统 ( emu lsion
system )和皮升 ( p ico liltre )大小焦磷酸 ( pyrophos
phate)为基础的测序方法 [ 1]。据发明者称, 该方法
比传统的 Sanger测序法要快 100倍, 而每个碱基的
测序成本仅为后者的几十分之一。 454公司以该法
为基础推出了高通量测序平台 G enome Sequencer
20,该公司于 2007年被罗氏诊断公司收购,进而推
出第二代测序平台 G enome Sequencer FLX ( GS
FLX)
[ 2]
,后者在技术的成熟性和性能方面的表现均
远远超越了第一代产品。这种高通量低成本的测序
方法为环境微生物生态研究提供了新的手段, 本文
对 454测序技术在环境微生物生态学研究中的应用
作一简要综述。
1 454测序法的原理
11 焦磷酸测序法的原理
454测序法的基础是焦磷酸测序技术, 它的原
理是将 PCR扩增的单链与引物杂交, 并与 DNA聚
合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸
酶、底物荧光素酶和 5!磷酸硫腺苷共同孵育, 然后
脱氧核糖核苷三磷酸即按照碱基配对的原则依次连
接到引物上。在每一轮测序反应中, 只加入一种
dNTP, 若该 dNTP与待测模板配对, DNA聚合酶可
以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸
基团 ( PP i)。ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催
化焦磷酸形成 ATP, ATP驱动荧光素酶介导的荧光
素向氧化荧光素 ( oxy luc iferin )的转化, 氧化荧光素
发出与 ATP量成正比的可见光信号。ATP和未掺
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
入的 dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解, 淬灭光信
号,并再生反应体系, 然后加入下一种 dNTP,如此循
环 [ 3] (图 1)。
图片引自参考文献 [ 4]
图 1 焦磷酸测序的原理
12 454测序法的步骤
121 样品输出并片段化 GS系统支持各基因组
DNA、PCR产物和细菌人工染色体 ( BAC s)及 cD
NA、小分子 RNA 的测序。先将基因组 DNA和
BAC s等通过物理方法打断为 300800 bp的片段,
而对于短的小分子 RNA和 PCR产物, 则无需此
步骤。
122 DNA文库的准备 利用核酸内切酶、聚合
酶和激酶的作用在 DNA片段的 5!端加上磷酸基团,
3!端变成平端, 然后和两个 44 bp的衔接子 ( adap
to r)A、B进行平端连接。将样品 5!端和 3!端分别连
接 A和 B衔接子。具有 A B接头的单链 DNA片段
组成了样品文库。
123 DNA片段与磁珠结合 加入特异性的洗脱
溶液后, 提高温度到 DNA的解链温度上, 可以选择
性的将单链的 AB连接产物洗脱下来, 通过生物素
可以与链霉亲合素特异结合的特性, 将这些 DNA模
板和过量的链霉亲合素的磁珠结合, 使 1条 DNA片
段结合 1个磁珠。
124 乳滴 PCR扩增 将这些磁珠用包含了 PCR反
应所必须的各种试剂的油水混合物的小滴包裹后,对
所有的 DNA片段进行 emPCR平行 PCR ( emPCR )
扩增。
125 数据分析 经过扩增后, 每个磁珠上的
DNA片段拥同一拷贝,此时打断 PCR反应过程,对
结合有大量 DNA链的珠子进行富集, 随后放入皮升
级反应板中进行后继测序 [ 4]。
2 454测序法在环境微生物生态学研究中
的应用
与传统的 Sanger测序方法相比, 454测序技术
无需文库构建,没有克隆的误差。该技术环境微生
物生态学研究中包括土壤、海洋、污泥和废水等。
21 454测序法在土壤微生物研究中的应用
土壤微生物对自然界物质的转化和循环起着极
为重要的作用,对农业生产和环境保护有着不可忽
视的影响。Roesch等 [ 5]采用 454测序法对西半球
的一个大的横断面的 4类土壤进行检测和统计学评
价。结果表明,这 4种土壤中,最丰富的微生物类群
拟杆菌纲、变形菌纲和 变形菌纲。与农业土壤
相比,森林土壤的微生物多样性更为丰富,然而检测
结果表明森林土壤中的古生菌多样性较少, 仅为该
位点所有序列的 0009%, 而农业土壤的比例则为
4% - 12%。U rich等 [ 6 ]采用基于 RNA的环境转录
组学方法同时获得土壤微生物种群结构和功能信
息。结果认为,通过该方法可以同时研究微生物生
种群结构与功能从而避免其他方法所造成的偏差。
Le in inger
[ 7]检测了 3个气候区域中的原始和农业土
壤里检测编码氨单加氧酶 ( amoA )的一个亚基的基
因丰度。采用反向转录定量 PCR研究及互补 DNA
分析采用无需克隆的焦磷酸测序技术证实古细菌的
氨氧化活性要远高于细菌,证实 C renarchaeo ta可能
是土壤生态系统中最富有氨氧化活性的微生物。
22 454测序技术在海洋微生物研究中的应用
海洋中存在着丰富的微生物,但是研究手段的
限制成为这成为当代环境微生物学研究和海洋资源
开发的障碍。Huber等 [ 8]采用 454测序法, 通过对
大于 900 000小亚基核糖体 RNA复制子进行测序,
分析两眼深海热泉中包括微生物多样性和微生物丰
度在内的微生物的种群结构信息。结果表明, 这两
眼热泉的微生物种群结构完全不同均与当地的地球
化学特性。Sog in等 [ 9]采用 454测序法检测深海中
微生物多样性,研究结果表明,北大西洋海底和热泉
中的微生物比以前报道环境中的数量要高 1- 2个
数量级,且比后者要复杂的多。这些原始的微生物
可以提供新的基因组数据更新提供了无穷的资源,
这些原始微生物互相之间差异很大, 或许在地球历
史的不同时期,它们对地球的演变进程产生过深刻
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2010年第 1期 徐晓宇等: 454测序法在环境微生物生态研究中的应用
的影响。Palen ik等 [ 10]采用流式细胞仪筛选富集加
利福尼亚沿海海水中的 Synechococcus属蓝细菌,随
后用 454测序技术进行分析,将其序列信息与 Syne
chococcus的模式种基因组进行比较, 发现自然环境
微生物种群的基因组与沿海模式种序列之间高度一
致,但是在重复区中, 编码多种功能可变区域的序列
差异很大,该结果可以通过广泛的基因水平转移来
解释。G ilbert[ 11]采用 454测序宏基因组技术和宏转
录组技术对沿海水域生态系统的 28个 phnA基因
同源物质进行研究, 基因的同源性分析结果表明超
过 3%的海洋细菌携带有 phnA基因。同样,在该试
验中的 fosm id文库中同样发现了 phnA同源物。
G ilbert
[ 12]采用 GSFLX测序技术从海洋中获得
的总 mRNA中获取复杂的环境转录组信息。该方
法从海洋和土壤中获得了并首先报道了全新的环境
转录组高度表达序列, 证明从环境样品中进行环境
转录组研究不但可行,而且提供了前所未有的机会。
Angly
[ 13 ]采用 454测序技术对从 4大洋的 68个主要
位置取样采集到的宏基因组进行分析, 得到了 184
个病毒群,这些病毒与现有数据库中的病毒序列并
不相似,是典型的海洋病毒系, 具有丰富的多样性,
推测为几百上千个物种, 而且区域丰度随着南北纬
度而变化。试验结果表明病毒物种分布非常广泛,
而没有特殊环境下的选择性压力可能导致某种类型
病毒的富集。
23 454测序技术在活性污泥微生物研究的应用
K rause等 [ 14]采用 454测序法分析了沼气反应
器中的微生物组成, 得到了上述条件下微生物分类
组成和基因的大量数据。硬壁菌门的梭菌属是系统
发育分析中最常见的, 甲烷微菌属为产甲烷古细菌
的优势菌。 Sanapareddy等 [ 15]采用 454 FLX 技术,
对废水处理厂的活性污泥提取的总 DNA进行测序,
获得了平均读长为 2504 bp的 378 601个序列,对
上述序列运用组装算法拼接无法得到良好的集合,
只有 03%的序列组装成有意义的重叠群。其中有
117个大于 5 00 bp的重叠群,被猜测可能为转座酶
和假定的蛋白。将所得的序列与已知微生物基因组
进行比较表现出非特异性补充,表明先前描述的分
类单元与污水处理厂中的绝大多数微生物亲缘性较
远。通过对序列的翻译以及其他基因组序列翻译得
到的蛋白进行比较,活性污泥中微生物表现出独特
的代谢图谱,其中含有大量的氨基酸代谢基因和少
量的光合作用的基因。 Szczepanow sk i[ 16 ]采用 454焦
磷酸测序技术对污水处理厂细菌进行质粒宏基因组
研究,通过与抗生素抗性基因序列比对发现,污水处
理厂细菌质粒库中含有可以抵御所有抗微生物药物
的抗性质粒。质粒宏基因组数据的分析可以在最小
长度为 500 bp的 605个重叠群中装配起来,占优势
的重叠群编码维系质粒存在和转座的酶类。采用
454测序技术得到了废水处理厂中细菌的质粒宏基
因组序列。用 Pfam中隐马尔科夫模型分析推断出
质粒宏基因组中短的氨基酸序列, 获得了与代表质
粒复制、稳定性和移动性功能相关的基因匹配的证
据。研究结果意味着废水处理厂细菌含有遗传稳定
性的可移动质粒, 且废水处理厂质粒宏基因组具有
高度的多样性。在测序样品中, 从 A cinetobacter bau
mannii中得到的可移动的有机过氧化物抗性质粒
pMAC被认为是最丰富的复制模式类型。附属质粒
编码不同的转座子、插入序列、整合子、抗性和毒性
的决定序列。许多与转座蛋白家族相匹配的的序列
被鉴定为编码与铬酸盐抗性转座子 Tn5719相似的
转座酶类。值得注意的是, 对 内酰胺酶蛋白家族
序列分析后表明从废水处理厂细菌质粒基因组含有
内酰胺水解活性的酶类的编码基因。
24 454测序技术在矿井微生物研究中的应用
Robert等 [ 18]采用 454焦磷酸测序技术,对美国
明尼苏达 Soudan矿井中两个地理位置毗邻而化学
和水文差异显著的位点所采土样的宏基因组进行分
析, 发现二者的微生物代谢能力的差异性显著,在可
获取的底物条件下,微生物发生截然不同的生化反
应, 而这两个种群的呼吸途径也不一样。 Jonathan
等 [ 19]采用 GS FLX T itanium 平台从海洋中新发现一
种只能固定氮气但缺乏生产氧气和固定碳所需的遗
传学机制的蓝细菌,了解这种蓝细菌在生态系统中
的作用以及它如何影响碳氮平衡对于生态学研究来
说非常重要。
25 454测序技术在人类微生物组研究中的应用
据报道,在人体表面和内部的微生物细胞估计
是人类自身细胞的 10倍, 甚至是 100倍以上, 占人
类体重的 1% - 2% [ 20]。这些微生物对人类的健康
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
起到非常重要的作用,如分解消化食物、制造人体必
需的维生素、影响免疫系统等, 同时研究表明人体微
生物种群与大量的急性和慢性疾病,肥胖、心血管疾
病、皮肤病阴道感染等等疾病密切相关。Peter等 [ 21]
采用 454测序平台检测两个成年双胞胎及其母亲肠
道微生物,起初鉴定为成年人肠道微生物种群结构,
但研究结果表明,人类肠道微生物组存在统一水平
的微生物物种的假设是错误的,即起着同样功能的
肠道微生物种群的基因组在个体之间则有很大的
差别。
454测序可以用来检测器官移植中致死的突发
新型病毒, Palacios等 [ 22]在检验移植器官中发现新
型的致死病毒,接受器官移植的 3位病人均在手术
几周后去世。这些器官来自同一个捐献者, 采用传
统的方法 (体外培养、PCR、寡核苷酸芯片等 )无法检
测出病因,而用 GS系统检测了从捐献者的肺和肾
脏中获取的 RNA, 在得到的 103 632个序列里找到
14个与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 ( lymphocy tic
cho riomening itis v irus, LCMV ) 相似的序列, 随后的
PCR结果证实捐献的器官中有沙粒序列的病毒。
3 454测序法的发展及展望
在 454测序技术问世之初, 虽然该方法和 San
ger测序法相比在基因组测序中虽然测序的准确率
相似,但是 454测序法读出的片段较短,不能提供配
对端点测序信息, 无法单独的读取重复的 DNA序
列,特别是单一的聚合体。这些因素导致 454测序
法无法跨越重复 DNA区域, 在单分子一致重叠群装
配的时候留下无法解决的序列缺口。针对以上问
题,罗氏 454公司迅速对 GS平台进行改进, 目前单
个序列读长达到 400个碱基对 (第 400个碱基的准
确率高达 99% ,前面的碱基准确率更高 ); 通量提高
5倍,达到每轮运行能获得 4 - 6亿个碱基对序列。
每个新技术的产生都伴随着怀疑, 在 Sanger测序法
问世之初, 其阅读能力很难超过 25 bp, Fred Sanger
双脱氧终止法发明后也只达到 80 bp,如今却达到了
750 bp。而焦磷酸测序法从开始的 100 bp的阅读量
而在一年多内迅速提升达到 400 bp, 相信随着研究
人员对该技术的改进, 454测序技术将会在科学研
究中得到更多的运用。
参 考 文 献
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