全 文 ：核 农 学 报 2015，29 ( 2 ) : 0344 ～ 0350
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期: 2014-04-01 接受日期: 2014-10-29
基金项目:国家科技支撑计划重大项目( 2011BAD31B01 ) ，宁夏农业综合开发科技推广项目( NTKJ-2013-03-1 )
作者简介:蔡艳，女，副教授，主要从事土壤与植物营养研究。E-mail: caiyya @ 126． com
通讯作者:郝明德，男，研究员，主要从事土壤生态研究。E-mail: mdhao@ ms． iswc． ac． cn
文章编号: 1000-8551 ( 2015 ) 02-0344-07
不同轮作制下长期施肥旱地土壤微生物多样性特征
蔡 艳1，2 郝明德2，3 臧逸飞2 何晓雁2 张丽琼2
( 1 四川农业大学资源环境学院，四川 成都 611130 ; 2 西北农林科技大学资源环境学院，
陕西 杨凌 712100 ; 3 西北农林科技大学水土保持研究所，陕西 杨凌 712100 )
摘 要:为了探讨典型旱地区施肥制度对土壤微生物多样性的影响，本研究通过 27 年长期定位试验，采
用 454 测序技术，分析了黄土旱地区小麦连作、苜蓿连作、粮豆轮作中不同化肥及有机肥施肥措施下土
壤细菌、真菌多样性的变化情况。结果表明 : 除施氮肥和有机肥 ( NM ) 处理外，施肥后连作小麦土壤细
菌 Chao 指数提高 7. 5% ( 施磷肥和有机肥，PM ) ～ 60. 6% ( 单施有机肥，M ) ，Shannon 指数增加 0. 04
( PM) ～ 0. 40 ( M) ，肥料单施优于配施 ;施肥后连作苜蓿土壤细菌 Chao 指数提高 92. 0% ( 单施磷肥，P)
～ 102. 4% ( 施氮肥、磷肥和有机肥，NPM) ，Shannon 指数增加 0. 30( NPM) ～ 0. 32( P) ;施肥对粮豆轮作
土壤细菌多样性影响较小。除小麦连作 NP 处理外，施肥后各种植系统土壤真菌 Chao 指数提高 19. 1%
～ 55. 0%，但真菌 Shannon 指数变化不大或明显下降。黄土旱地区作物连作时施与适当化肥或有机肥，
可提高土壤细菌多样性。本研究对优化旱地作物施肥制度、发挥土壤潜力肥力、实现土壤资源可持续利
用有着重要的意义。
关键词: 454 测序 ;旱地土壤 ;微生物多样性;长期施肥
DOI: 10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2015. 02． 0344
土壤微生物是土壤生态系统的核心，在土壤有机
物的分解与转化、养分循环与利用、土壤肥力形成等起
着关键作用，是衡量土壤肥力水平的重要指标，对土壤
可持续利用至关重要［1 － 2］。土壤微生物多样性指土壤
中所有微生物的种类拥有的基因及其与环境之间相互
作用的多样化程度［3］，可反映土壤生态系统的稳定性
和和谐性［4］。传统的分离培养方法不能完全反映土
壤中微生物的多样性特征［5］，基于 DNA /ＲNA 的分子
生物学技术在土壤微生物多样性研究中逐渐广泛应
用［6］。其中高通量测序技术尤其是 454 测序技术因无
需构建克隆，通量高，可大量构建基因信息库进行比较
分析，使高效、全面认识土壤微生物成为可能，自 2006
年问世以来已逐步应用于土壤微生物研究中［7 － 10］。
有关长期施肥下土壤微生物群落结构多样性的研
究一直备受关注，由于与肥料种类、施用方式、土壤类
型等因素及研究微生物的手段和方法不同。研究结果
不尽相同［8，11 － 14］。黄土高原是我国典型的旱作农业
区，农业生产完全依赖天然降水。本研究针对黄土高
原中南部长武长期定位试验土壤，采用 454 焦磷酸测
序技术，对该地区小麦连作、苜蓿连作、粮豆轮作 3 种
典型种植制度下长期施肥后土壤细菌、真菌多样性进
行分析，以期明确 3 种种植制度下旱地土壤微生物对
不同施肥制度的变化产生的不同响应，为黄土高原生
态系统中养分循环的有效管理、土壤资源的可持续利
用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 试验概况
试验地位于陕西省长武县十里铺村塬面旱地，地
处黄土高原中南部。试验开始于 1984 年，供试土壤为
粘化黑垆土，母质是深厚的中壤质马兰黄土，全剖面土
质均匀疏松，通透性好，肥力中等。起始时土壤耕层有
机质含量 10. 50 g·kg － 1，全氮含量 0. 80 g·kg － 1，碱解
443
2 期 不同轮作制下长期施肥旱地土壤微生物多样性特征
氮含量 37 mg·kg － 1，有效磷含量 2. 0 mg·kg － 1，速效钾
含量 129 mg·kg － 1，pH 值( H2O) 8. 4。
试验设 3 组共 14 个处理。分别为小麦连作 8 个
处理 :不施肥( CK ) ，氮肥 ( N ) ，磷肥 ( P) ，有机肥 ( M ) ，
氮磷肥 ( NP ) ，氮肥及有机肥 ( NM ) ，磷肥及有机肥
( PM) ，氮肥、磷肥及有机肥 ( NPM ) ; 苜蓿连作 3 个处
理 :不施肥 ( CK ) ，磷肥 ( P ) ，氮肥、磷肥及有机肥
( NPM) ;粮豆轮作( 豌豆 → 小麦 → 小麦 + 糜子) 3
个处理 :不施肥 ( CK ) ，磷肥 ( P ) ，氮肥、磷肥及有机肥
( NPM) 。
小区面积 66. 69 m2 ( 10. 26m × 6. 5m ) 。每个处理
3 次重复，随机区组排列。各处理按设计要求施肥，施
肥量为 N 120 kg·hm － 2·y － 1，P2O5 60 kg·hm
－ 2·y － 1，有
机肥 75 t·hm － 2·y － 1，所施氮肥为尿素，磷肥为过磷酸
钙，有机肥为腐熟牛粪 ( 含有 机质 10. 6%，全 氮
0. 265%，有效磷 1095 mg·kg － 1，速效钾 645 mg·
kg － 1 ) ，皆于作物播前将肥料撒施地表后耕翻入土，田
间管理同大田。
1. 2 土壤样品采集与处理
本试验即 2011 年 8 月 30 日采集土样。使用不锈
钢取土器，在每个小区采用 5 点 S 形法采集0 ～ 15 cm
土层，3 个试验小区土样组成混合样，四分法保留约
500 g。鲜土去除植物残体，过 2 mm 筛后保存于 －
80℃，用于微生物多样性分析。
1. 3 土壤微生物多样性分析
1. 3. 1 土壤总 DNA 的提取 每个样品取 0. 50 g 提
取 DNA，本试验使用 OMEGA 公司生产的 E． Z． N． A
Soil DNA 试剂盒抽提并纯化土壤微生物基因组 DNA，
按试剂盒使用说明的操作步骤进行。
1. 3. 2 PCＲ 扩增 细菌 PCＲ 扩增 : 将纯化后的基因
组 DNA 作为 PCＲ 的模板，采用细菌 16S rＲNA V1 ～
V3 区具有特征性的引物对 27F 和 553Ｒ 扩增［15］，其序
列分别为 : 27F( 5-3 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ) ，
533Ｒ( 5-3 TTACCGCGGCTGCTGGCAC) ，由上海美吉
生物医药科技有限公司合成，同时在前引物 5端添加
Barcode 序列区分样品。反应体系为 20 μL: 5 ×
FastPfu 缓冲液 4 μL，2. 5 mmol·L － 1 dNTPs 2 μL，正向
引物( 5 μmol·L － 1 ) 0. 4 μL，反向引物( 5μmol·L － 1 )
0. 4 μL，FastPfu 聚合酶 0. 4 μL，模板 DNA 10 ng，补
ddH2O 至 20 μL。反应参数为 : 95℃ 预变性 2 min，
95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，25 个循
环后，72℃ 延伸 5 min，10℃直到反应完成。每个样品
3 次重复，将同一样品的 PCＲ 产物混合后用 2%琼脂
糖凝胶电泳检测，使用 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒
( AXYGEN 公司) 切胶回收 PCＲ 产物，Tris_HCl 洗脱，
2%琼脂糖电泳检测。
真菌 PCＲ 扩增 : 采用真菌 18S rＲNA 具有特征性
的引物对 ITS1 和 ITS4 扩增［16 － 17］，其序列分别为 ITS1
( 5-3 TCCGTAGGTGAACCTGCGG) ，ITS4 ( 5-3 TCCT
CCGCTTATTGATATGC ) 。反应体系为 20 μL: 5 ×
FastPfu 缓冲液 4 μL，2. 5 mmol·L － 1 dNTPs 2 μL，正向
引物( 5 μmol·L － 1 ) 0. 8 μL，反向引物( 5μmol·L － 1 )
0. 8 μL，FastPfu 聚合酶 0. 4 μL，模板 DNA 10 ng，补
ddH2O 至 20 μL。反应参数为 : 95℃ 预变性 2 min，
95℃变性 30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，32 个循
环后，72℃ 延伸 5 min，10℃直到反应完成。其他方法
同细菌 PCＲ 扩增。
1. 3. 3 罗氏超高通基因组测序系统 GS FLXＲoche
Genomo Sequencer FLX +上机测序 由上海美吉生物
医药科技有限公司完成。试剂采用 Ｒoche GS FLX +
Sequencing Method Manual_XLＲ70 kit 购自瑞士罗氏公
司。
1. 3. 4 生物信息分析方法 使用 mothur 软件完
成［18］。分析流程如下 :
1 ) 有效序列数据分析: 通过 Barcode 区分各样品
的测序数据，生成不含 Barcode 的各样品测序序列。
2) 优化数据分析: 采用以下步骤进行优化数据分
析:①保留引物的错配数在 2 个以内的序列; ②去除序
列末端的后引物的接头序列、多碱基 N、polyA /T 尾巴及
低质量碱基;③去除长度短于 200 bp，模糊碱基数大于
0、序列平均质量低于 25 的序列。本研究共获得297 225
条优化序列; 其中细菌 198 079 条，每个土样7 473 ～ 19
514 条;真菌 99 146 条，每个土样 3 222 ～ 8 631 条。
3 ) OTU ( operational taxonomic units ) 聚类分析:
OTU 是在系统发生或群体遗传学研究中，为了便于进
行分析，人为给某一个分类单元设置的同一标志。主
要步骤如下 :①提取非重复序列，便于降低分析中间过
程冗余计算量 ; ②与 silva 库 ( http: / /www． arb-silva．
de / ) ( silva SSU111 版) 中的 aligned ( 16S /18S，SSU ) 核
糖体序列数据库比对［19］，比对方法为 kmer searching;
③使用 UCHIME 方法检测并去除 Chimeric 序列 ; ④计
算比对对齐后的序列间非校正配对距离 ; ⑤使用最远
邻近法法聚类生成 OTU，即任意 2 条序列的相似度均
达到 97%以上，将该序列聚成 1 个 OTU。本研究共获
得 78 015 个 OTU;其中细菌 73 939 个，每个土样 3 225
～ 6 289 个 ;真菌 4 076 个，每个土样 202 ～ 375 个。
4 ) 丰富度指数和多样性指数计算 : 本研究选取
Chao 指数和 Shannon 指数反映微生物多样性。具体
543
核 农 学 报 29 卷
算法如下 :
①Chao: 用来估计群落中物种总数的指数。算法
为 :
Chao = S obs +
n( n － 1 )
2 ( n + 1 ) 其中
，Sobs为实际观测到
的 OTU 数 ; n1 为只含有一条序列的 OTU 数目; n2 为只
含有 2 条序列的 OTU 数目。
②Shannon: 用来估算样品中微生物多样性的指
数。算法为 :
Shannon = －∑
S obs
i = 1
ni
N
ln
ni
N 其中
，Sobs为实际测量
出的 OTU 数目; ni为含有 i 条序列的 OTU 数目; N 为
所有的序列数。
注 : 图 A 为 Chao 指数，图 B 为 Shannon 指数。CK: 不施肥 ; N: 施氮肥 ; P: 施磷肥 ; M : 施有机肥 ; NP: 施氮肥和磷肥 ; NM : 施氮肥和有机
肥 ; PM : 施磷肥和有机肥 ; NPM : 施氮肥、磷肥和有机肥。下同。
Note: Figure A is about Chao indexes，and figure B is about Shannon indexes． CK: No fertilization． N: Application of N fertilizer． P: Application
of P fertilizer． M : Application of organic manure． NP: Application of N fertilizer and P fertilizer． NM : Application of N fertilizer and organic
manure． PM : Application of P fertilizer and organic manure． NPM : Application of N fertilizer，P fertilizer and organic manure． The same as
following．
图 1 小麦连作不同施肥措施下旱地土壤细菌多样性指数
Fig． 1 Diversity indexes of bacteria from dryland soil after different fertilization under continuous planting wheat
2 结果与分析
2. 1 小麦连作下长期施肥土壤微生物多样性
除 NM 处理外，长期施肥可提高连作小麦土壤细
菌物种数和多样性，且肥料单施优于肥料配施，单施有
机肥优于单施化肥( 图 1 ) 。单施有机肥后，细菌 Chao
指数比不施肥增加 60. 6%，有机肥与氮肥、磷肥及氮
磷肥配施后，其 Chao 指数反而分别比单施有机肥下降
42. 8%，33. 1% 和 14. 3%。各处理细菌 Shannon 指数
变化趋势与 Chao 指数大致相似，单施有机肥后细菌
Shannon 指数最高，达 8. 10，比 PM 处理和 NM 处理分
别高 0. 36 和 0. 64。
除 NP 处理外，长期肥料单施和配施亦可提高旱
地小麦土壤真菌物种数，尤以有机肥和化肥配施更显
著，其真菌 Chao 指数比不施肥提高 35. 2% ～ 55. 0%
( 图 2 ) 。长期单施有机肥后，土壤真菌 Shannon 指数
增加 0. 11，有机肥与其他肥料配施后，其真菌 Shannon
指数变化不大或稍有下降。长期单施化学肥料或化学
肥料配施，土壤真菌 Shannon 指数也大致呈现下降趋
势，尤以单施磷肥和氮磷肥配施下降最为显著，分别比
对照降低 0. 90 和 1. 22，降幅分别达 24. 9%和 33. 7%。
2. 2 苜蓿连作下长期施肥土壤微生物多样性
在连作苜蓿土壤中，长期施肥可在较大程度上提
高细菌多样性 ( 图 3 ) 。NPM 处理土壤细菌 Chao 指数
最高，较 CK 提高 102. 4%，单施磷肥也可使 Chao 指数
较对 照 提 高 92. 0%。施 肥 后，苜 蓿 地 土 壤 细 菌
Shannon 指数比对照提高 0. 30 ～ 0. 32。表明长期施肥
不仅提高了苜蓿土壤细菌物种数，而且细菌组成多样
性更丰富，有利于维持良好的土壤生态环境。
长期施磷肥和施氮磷肥及有机肥后，连作苜蓿土
壤真 菌 Chao 指 数 分 别 比 不 施 肥 提 高 40. 7% 和
46. 0%，但其真菌 Shannon 指数分别比不施肥减少
0. 57 和 0. 66，减幅达 13. 9%和 16. 0% ( 图 4 ) ，说明长
期施肥虽然提高了苜蓿土壤真菌物种数，但真菌组成
多样性减弱。
2. 3 粮豆轮作下长期施肥土壤微生物多样性
长期施肥对粮豆轮作土壤中细菌多样性影响程度
较小 ( 图 5 ) 。单施磷肥后，土壤细菌 Chao 指数和
643
2 期 不同轮作制下长期施肥旱地土壤微生物多样性特征
图 2 小麦连作不同施肥措施下旱地土壤真菌多样性指数
Fig． 2 Diversity indexes of fungi from dryland soil after different fertilization under continuous planting wheat
图 3 苜蓿连作不同施肥措施下旱地土壤细菌多样性指数
Fig． 3 Diversity indexes of bacteria from dryland soil after different fertilization under continuous planting alfalfa
图 4 苜蓿连作不同施肥措施下旱地土壤真菌多样性指数
Fig． 4 Diversity indexes of fungi from dryland soil after different fertilization under continuous planting alfalfa
Shannon 指数与不施肥相差无几。NPM 处理土壤细菌
物种数低于 CK，但细菌组成多样性稍高于 CK。
长期施磷肥使粮豆轮作土壤真菌 Chao 指数增加
了 38. 5%，其真菌 Shannon 指数也增加了 0. 10 ; 施氮
磷及有机肥后，虽然粮豆轮作土壤真菌物种数增加了
19. 1%，但其真菌组成多样性明显下降( 图 6 ) 。
743
核 农 学 报 29 卷
图 5 粮豆轮作不同施肥措施下旱地土壤细菌多样性指数
Fig． 5 Diversity indexes of bacteria from dryland soil after different fertilization under wheat － pea rotation
图 6 粮豆轮作不同施肥措施下旱地土壤真菌多样性指数
Fig． 6 Diversity indexes of fungi from dryland soil after different fertilization under wheat-pea rotation
3 讨论
许多研究者认为，土壤微生物多样性相对比较稳
定，短期施肥对土壤微生物的影响不显著［20］，但长期
合理施肥可以丰富土壤微生物多样性［21 － 22］。施肥除
了直接影响土壤化学成分变化，还能通过改变土壤物
理性状，影响地上植被生长状况，从而间接影响土壤微
生物多样性［11 － 12］。其中有机肥因能提高土壤中碳源
和能源，促进可溶性碳、氮的生成，为微生物生长繁殖
及活性提高创造有利条件［23］，往往会对土壤微生物多
样性产生更加深刻的影响［8］。
连续种植小麦下，长期施用有机肥后土壤细菌多
样性最高，与施肥后土壤有机质和有效养分提升有很
大关系。据测定，施用有机肥后小麦土壤有机质、碱解
氮、有效磷和速效钾含量分别增加 45. 8%、61. 8%、
489. 3%和 191. 5%，可为细菌生长繁殖提供较多碳源
和较均衡的矿质养分。长期施用化肥或化肥配施会造
成土壤有机质或部分有效养分含量呈下降趋势，如单
施氮肥后有效磷、速效钾分别减少 6. 0%、3. 2%，单施
磷肥后有机质、速效钾分别减少 2. 0%、4. 6%，细菌生
长缺乏相应碳源或矿质养分，故多样性降低。长期有
机肥和化肥配施下，外源肥料提供的养分数量过多，反
而会降低细菌多样性。李杨等［13］、王保莉等［14］也报
道合理施用肥料可增加旱地土壤细菌多样性，过量施
肥则减少细菌多样性，本研究结果与此一致。
此外，黑垆土地处黄土旱塬区，不同种植系统对土
壤干燥化影响程度不同，亦会对土壤微生物多样性产
生不同影响。旱地上连续种植小麦，土壤干燥化趋势
不明显［24 － 25］，因此细菌多样性受施肥措施影响更大。
但在旱地黑垆土上连续种植苜蓿后，由于苜蓿的耗水
特性导致土壤干燥化明显［24 － 25］，虽然不施肥时土壤有
机质和碱解氮仍较连作小麦提高 135. 2%和 238. 4%，
其细菌物种数和组成多样性仍不及连作小麦丰富。苜
蓿连作下长期施用有机肥可为土壤提供大量有机胶体
作为有机无机复合团聚体的物质基础，有助于形成团
粒结构，改善土壤保水能力［26］，从而提高土壤细菌多
样性。旱地上采取粮豆轮作后，茬口效应会减弱肥料
843
2 期 不同轮作制下长期施肥旱地土壤微生物多样性特征
对土壤性质的影响，故施肥措施对其细菌多样性无明
显影响。
虽然目前关于施肥对真菌多样性的影响知之较
少，但 Arfi 等［27］仍认为土壤真菌多样性受土壤环境影
响较大。本研究表明，旱地土壤施肥可增加土壤真菌
Chao 指数，但对真菌 Shannon 指数无明显影响或明显
下降，其原因可能是真菌适宜湿润土壤［28］，施肥后增
加的有机质或矿质养分对真菌的富集作用不足以弥补
旱区缺水对土壤真菌造成的影响［7］。
樊军等［29］采用稀释平板法测定了施肥措施对旱
地土壤微生物数量的影响，发现小麦连作下土壤可培
养微生物表现为 NM ＞ NPM ＞ P ＞ PM ＞ NP ＞ CK
＞ N ＞ M，苜蓿连作土壤和粮豆轮作土壤均表现为
NPM ＞ CK ＞ P，与本文研究结果不一致。由于人类
可培养的微生物数量大约仅占土壤微生物总数 1%左
右［5］，笔者认为本研究结果更能真实反映施肥措施对
旱地土壤微生物的影响状况。还应该进一步利用测序
结果对微生物进行分类研究，并结合其土壤管理措施
或土壤理化性质，充分揭示黄土旱塬区典型施肥制度
对土壤微生物类群尤其是功能微生物类群的影响。
4 结论
施肥对旱地连作系统土壤细菌丰富度和多样性影
响大于轮作系统。单施化肥或有机肥均能提高连作小
麦土壤细菌多样性，以单施有机肥最明显，肥料配施后
细菌多样性有所下降 ; 施氮磷化肥和有机肥及单施磷
肥可明显提高连作苜蓿土壤细菌多样性 ; 施肥对粮豆
轮作土壤细菌多样性影响较小。施肥可提高土壤真菌
Chao 指数，但真菌 Shannon 指数变化不大或明显下
降。
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Effect of Long-term Fertilization on Microbial Diversity of Black
Loessial Soil Based on 454 Sequencing Technology
CAI Yan1，2 HAO Mingde2，3 ZANG Yifei2 HE Xiaoyan2 ZHANG Liqiong2
( 1 College of resources and environment，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130 ;
2 College of natural resources and environment，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100 ;
3 Institute of soil and water conservation，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100 )
Abstract: In order to the influence of cropping systems on soil microbial diversity in typical arid areas． the paper
analyzed the changes of diversity of bacteria and fungi from black loessial after fertilized by chemical fertilizer or organic
fertilizer under continuous planting wheat，continuous planting alfalfa and wheat-pea rotation based on 454 sequencing
technology in Loess Plateau According to 27-year long-term field experiment，The results showed that: Except NM
( application of N fertilizer and organic manure ) treatment，Chao indexes and Shannon indexes in soil of continuous
wheat increased by 7. 5% ( PM，meaning application of P fertilizer and organic manure ) to 60. 6% ( M，meaning
application of organic manure ) and 0. 04 ( PM) to 0. 40 ( M) respectively after fertilization，and fertilizer administered
alone was more obvious than fertilizer mixed other fertilizer． Chao indexes of bacteria in soil of continuous alfalfa
increased by 92. 0% ( P，meaning application of P fertilizer ) to 102. 4% ( NPM，meaning application of nitrogen
fertilizer，phosphate fertilizer and organic manure) after fertilization，and Shannon indexes of those increased by 0. 30
( NPM) to 0. 32 ( P) ． Fertilization had small impact on soil bacteria diversity of wheat-pea rotation． Chao indexes of fungi
in soil of various cropping systems increased by 19. 1% to 55. 0% after fertilization except continuous wheat fertilized
nitrogen fertilizer and phosphate fertilizer，but Shannon indexes of fungi changed little or decreased significantly． In
Loess dryland areas，It could improve the bacterial diversity significantly that applying proper chemical fertilizer or
manure fertilizer when continous planting single crop． It has important significance on optimizing dryland cropping
systems，playing the soil potential fertility and achieving the sustainable use of soil resources．
Keywords: the 454 sequencing，dry land soil，microbial diversity，long-term fertilization
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