全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 303–311　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0611 303
收稿 2015-11-18　　修定 2016-01-11
资助 国家自然科学基金(31360060)。
* 通讯作者(E-mail: jiey@shzu.edu.cn)。
能源植物橡胶草TkGGPPS基因的克隆及表达分析
李永梅, 冯玉杰, 李锦, 赵李婧, 闫洁*
石河子大学生命科学学院, 新疆石河子832000
摘要: 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)是植物细胞萜类物质合成的重要调节
靶点。利用RT-PCR和RACE技术首次从橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)中克隆得到一个GGPPS基因, 命名为TkGGPPS (Gen-
Bank: KT028713), TkGGPPS cDNA全长1 140 bp, 编码379个氨基酸。序列分析表明, TkGGPPS基因属于类异戊二烯超家族
成员, 其功能可能与萜类物质的合成有关。氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明, TkGGPPS与向日葵HaGGPPS的
亲缘关系较近, 相似性为74.67%。实时定量PCR的结果表明, TkGGPPS基因在第6周橡胶草的主根和成熟的种子中显著表
达。上述结果为进一步研究橡胶草产胶代谢途径和产胶合成相关基因功能提供一定的理论指导和技术支持。
关键词: 橡胶草；GGPPS；基因克隆；序列分析；表达分析
橡胶草(Taraxacum kok-saghyz), 又称俄罗斯蒲
公英, 属于菊科蒲公英属多年生宿根型草本双子
叶植物(Shi等2011), 是全球三大产胶植物之一。其
根和叶均有乳管组织, 其中根含橡胶6%~28%, 从
橡胶草根部提取的橡胶, 与巴西橡胶树所产橡胶
的结构和性能类似。目前仅在我国新疆境内伊
犁、昭苏一带发现有大量的野生种橡胶草。20世
纪50年代, 苏联政府认为橡胶草是一种重要的产
胶植物并对其进行了较系统的研究。
牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl
pyrophosphate synthase, GGPPS, GGPS, EC 2.5.1.29)
属于短链E-IPPS (isoprenyl pyrophosphate synthases,
异戊二烯焦磷酸合酶)或写为短链异戊烯基转移酶
(Kharel等2006)。这类酶普遍存在于植物、动物和
微生物中, 它能够催化烯丙基二磷酸和异戊烯基
焦磷酸(isopentenyldiphosphate, IPP)进行1,4位缩合
(头尾缩合)生成20碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸
(GGPP), 是多种二萜、类胡萝卜素、叶绿素、
醌、维生素E侧链和天然橡胶等的构建骨架 ,
GGPPS是类异戊二烯化合物合成的一个关键酶。
由于GGPP是多种初生和次生代谢物的共同前体,
GGPPS能够调节类异戊二烯通路上的碳流(Las-
karis等1999; Aharoni等2003)。目前, 已经从多个
物种中克隆到GGPPS, 比如拟南芥(Beck等2013)、
向日葵(Oh等2000)、丹参(化文平等2014)、海南
粗榧(钱丹等2013)、烟草(林世锋等2014)等。氨基
酸的序列比对表明, GGPPS包括5个保守的氨基酸
结构域: I、II、III、IV和V。其中, 第II个和第V个
保守区域是2个富含天冬氨酸区域: DDXX(XX)D,
称FARM (the fi rst aspartate-rich motif)和SARM (the
second aspartate-rich motif), 它们分别是烯丙基底
物和IPP的结合位点(Hemmi等2003; Hao等2011),
对植物GGPPS的研究表明, 在FARM区域前第四、
第五位的小氨基酸和FARM中插入的氨基酸对于
决定产物链的长度是必需的(Sitthithaworn等2001)。
因此, FARM及其上游区域被命名为链长决定区
(chain length determination region, CLDR) (王惠等
2005)。
目前, 对橡胶草中GGPPS基因的研究还未见
相关报道。本研究对橡胶草GGPPS基因进行全长
序列的克隆, 并对其进行生物信息学和表达模式
的分析, 为进一步研究GGPPS在橡胶草橡胶合成
中的作用奠定基础。
材料与方法
1 植物材料和培养条件
2014年3月, 从新疆石河子北泉镇附近采集橡
胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)植株, 在光周期为
昼16 h/夜8 h、温度为20°C、光强为400 μmol·m-2·s-1
的光照恒温培养箱培养。
培养2~3个月后, 收获种子, 取饱满的种子若
干粒, 搓掉表面的种毛, 后将若干粒种子播种到
121°C、20 min高压灭菌的湿润滤纸的培养皿中,
继续在光照培养箱中培养约7 d使种子萌发, 然后
将萌发后的幼苗移栽到腐殖土:蛭石(3:1)中, 在光
照培养箱中培养。
植物生理学报304
2 菌株与试剂
工程菌E. coli Top10由石河子大学生命科学
学院农业生物技术重点实验室保存。
3 TkGGPPS基因全长cDNA的克隆
3.1 TkGGPPS部分序列的克隆
根据关西蒲公英(Taraxacum japonicum, Gen-
Bank: AB045717)在NCBI上所提交的部分序列, 利
用Primer Premier 5.0设计引物, 用TkGGPPS上和Tk-
GGPPS下 (表1)克隆TkGGPPS基因的部分序列。以
橡胶草cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经琼
脂糖凝胶电泳后回收, 与pMD19-T载体于16°C过
夜连接, 连接产物转化大肠杆菌(E. coli Top10)感
受态细胞, 对重组克隆进行PCR鉴定。阳性克隆由
北京华大基因公司进行测序。
表1 本研究所用引物
Table1 Primers used in this study
引物名称 引物序列(5→3)
TjGGPPS上 TAACGACGATTTCCGACGCG
TjGGPPS下 CAATAATCCAATGCATCTCGC
5′-CDS [Attb1R(G)3] ACAAGTTTGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTRGGG
3′-CDS [Attb2(dT)25] ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGG(T)25
GSP2 CTCGCCGGGGACTCTCTCCTCGCAT
Attb2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
GSP1 GCTGCTTCCAATAGCACCGCCGTCTTG
UPM CTAATACGACTCACTATAGGGC
TkGGPPS-QF TTTCCGTCAAAACGCCTCC
TkGGPPS-QR TCGTCATGAATCAACGACATCG
TkGAPDH-F GTCAACGAGAAGGAATACACACC
TkGAPDH-R AGACCCTCAACAATGCCAAAC
TkGGPPS-F TCCTGGATAAACATGAGATCTCTGA
TkGGPPS-R TCAGTTCTGCCGGTAAGCTATATAC
3.2 5′-cDNA序列的克隆
根据SMARTer® RACE cDNA Amplification Kit
的指导说明书, 用SMARTer® RACE cDNA Amplifi -
cation Kit逆转录mRNA获得cDNA, 克隆GGPPS相
关的序列。
根据已经克隆得到的TkGGPPS的部分序列,
设计基因特异性的引物GSP1 (表1), 以GSP1作为下
游引物; 以通用引物UPM为上游引物(表1)。以上
述cDNA为模板, 进行PCR扩增, 从橡胶草cDNA中
克隆得到单个独立的5′-RACE片段; 而后将所获得
的所有片段克隆到pMD19-T载体, 进行测序。
3.3 3′-cDNA序列的克隆
根据Invitrogen公司的SuperScript II Reverse
Transcriptase的指导说明书, 用SuperScript II Re-
verse Transcriptase合成cDNA模板双链(接头序列
5′-CDS引物和3′-CDS引物如表1)。
根据已经克隆得到的TkGGPPS的部分序列,
设计基因特异性的引物GSP2 (表1), 以GSP2为上游
引物; 3′接头引物Attb2为下游引物(表1), 以上述
cDNA为模板进行PCR扩增, 从橡胶草cDNA中克
隆得到单个独立的3′-RACE片段; 而后将所获得的
所有片段克隆到pMD19-T载体, 进行测序。
3.4 全长TkGGPPS的克隆
经测序后的多个 5′-RACE片段和多个3′-RACE
片段, 与原有的GGPPS进行拼接, 筛选获得Tk-
GGPPS的全长序列, 而后根据TkGGPPS的全长序
列, 利用Primer Premier 5.0设计引物, 用TkGGPPS-F
和TkGGPPS-R (表1)克隆TkGGPPS的全长序列。
以橡胶草cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物回
收, 克隆到pMD19-T载体, 进行测序。
4 TkGGPPS基因序列的生物信息学分析
利用ORF Finder (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html)工具, 分析该基因序列的开放阅读框; 利
用ProtParam (http://web.expasy.org/cgi-bin/prot-
param/protparam)在线分析软件对推导的氨基酸序
列进行理化特性分析; 采用ExPASy的ProtScale
李永梅等: 能源植物橡胶草TkGGPPS基因的克隆及表达分析 305
(http://web.expasy.org/protscale/)程序对橡胶草Tk-
GGPPS蛋白进行亲水性/疏水性预测; 利用Predict-
Protein (https://www.predictprotein.org/)在线软件对
TkGGPPS蛋白质二级结构进行分析; 利用PHYRE
(http:// www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/index.cgi)在线
软件对蛋白质三级结构进行预测; 采用InterProScan
(http:// www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)在线工具
预测蛋白的保守结构域; 利用GenBank数据库中的
Blastp程序对氨基酸进行同源性分析; 利用DNA-
MAN软件对同源氨基酸进行多重比对, 用Clustalx
和MEGA 5.02软件构建系统进化树。
5 TkGGPPS表达模式检测
根据EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂
盒, 提取橡胶草叶、叶柄、花、花梗和种子以及
2、4、6、12周(以种子萌发后为起点算起)主根和
侧根总RNA, 用逆转录试剂盒逆转录总RNA获得
cDNA。检测TkGGPPS在不同的组织和生长发育
时期的基因表达。用TkGGPPS-QF和TkGGPPS-
QR (表1)克隆TkGGPPS基因的特异性的片段, 用
TkGAPDH-F和TkGAPDH-R (表1)克隆管家基因
TkGAPDH, 以该管家基因为阳性对照。所有PCR
的产物, 通过测序进行鉴定。序列鉴定正确后, 进
行qRT-PCR, 反应程序为: 95°C 3 min; 95°C 10 s,
60°C 30 s, 40个循环。每个样品3个重复。数据分
析采用“2–∆∆CT”的方法(Vandesompele等2002)。
实验结果
1 全长TkGGPPS的克隆
根据NCBI中提交的与橡胶草同属的T. japoni-
cum的GGPPS部分序列为模板设计引物, 利用RT-
PCR从橡胶草的总RNA中克隆得到TkGGPPS的部分
序列, 结果如图1-A所示。经测序分析表明, Tk-
GGPPS片段大小为382 bp, 和T. japonicum的序列同
源性极高, 橡胶草的一个T与T. japonicum物种的一
个C碱基对应, 其余碱基完全一致。TkGGPPS cDNA
末端缺失的片段通过5′-RACE和3′-RACE克隆, 获得
5′-RACE片段约为776 bp; 获得3′-RACE片段约为727
bp, 结果如图1-B所示。通过DNAMAN进行序列拼
接, 获得1 503 bp片段, 并利用ORF Finder工具分析其
开放阅读框(open reading frame, ORF), 即ORF为1
140 bp。以其ORF为模板, 利用Primer Premier 5.0设
计基因特异性引物, 以橡胶草cDNA为模板, 进行Tk-
GGPPS的全长序列的克隆, 结果如图2所示(该序
列已经在NCBI上提交, GenBank: KT028713)。
2 橡胶草TkGGPPS基因的生物信息学分析
2.1 橡胶草TkGGPPS基因的序列分析
利用 ORF Finder工具分析显示, 所克隆的Tk-
GGPPS包含1个1 140 bp的完整开放阅读框, 推导
ORF编码379个氨基酸(图3)。
2.2 TkGGPPS蛋白质理化性质及高级结构预测分析
利用ProtParam在线分析软件对推导的TkGGPPS
氨基酸序列进行理化特性分析: 橡胶草TkGGPPS
蛋白质的分子式为C1779H2876N486O555S20; 相对分子
质量为40.5945 kDa; 理论等电点为5.71, 不稳定系
数为40.51, 属于不稳定蛋白。采用ExPASy的
ProtScale程序对橡胶草TkGGPPS蛋白进行亲水性/
疏水性预测。表明该蛋白为疏水性蛋白。
利用PredictProtein在线软件对TkGGPPS蛋白
图1 TkGGPPS部分序列的克隆(A)以及5′-RACE片段和3′-RACE片段的克隆(B)
Fig.1 Amplifi cation of partial sequence of TkGGPPS (A) and amplifi cation of 5′-RACE and 3′-RACE (B)
M1: DMarker III; M2: Trans5K DNA Marker; 1~4分别为不同株系橡胶草cDNA。
植物生理学报306
图2 橡胶草全长TkGGPPS的克隆
Fig.2 Amplifi cation of Full- length TkGGPPS from
T. kok-saghyz
M: Trans5K DNA Marker; +1、+2: 部分片段的质粒(+1: 引物
为TjGGPPS上+TjGGPPS下; +2: 引物为GSP1+GSP2); －: 阴性对照;
1~6: 橡胶草1~6个株系cDNA的克隆。
质二级结构分析, 表明该蛋白主要由螺旋和无规
则卷曲组成, 属于全α型蛋白。利用PHYRE在线软
件对TkGGPPS蛋白质三级结构进行预测。结果表
明, 模板c2j1pB是白芥子牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸
合酶, 该模板与提交的目的序列匹配性较好, 匹配
的可靠性为100%, 一致性为75%。
2.3 橡胶草GGPPS结构域与氨基酸同源性分析
采用 InterProScan在线工具预测TkGGPPS蛋白
的保守结构域, TkGGPPS具有7个保守结构域(图4),
主要是聚丙烯相关合成酶(polyprenyl synthetase-related)
(IPR017446), 位于85~379位(PTHR-12001); 聚丙烯
合成酶(polyprenyl synthetase) (IPR000092), 分别位
图3 TkGGPPS的cDNA序列及其预测的编码蛋白质的氨基酸序列
Fig.3 cDNA sequence of TkGGPPS and predicted amino acid sequence coding protein
*表示终止密码子；阴影部分为GGPPS蛋白的5个保守功能域。
李永梅等: 能源植物橡胶草TkGGPPS基因的克隆及表达分析 307
于163~179位(PS00723)、296~308位(PS00444)和
115~365位(PF00348); 异戊二烯类合酶(isoprenoid
synthase) (IPR008949), 分别位于86~378位(G3DSA:
1.10.600.10)和88~369位(SSF48576)。另外, 还有牻
牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶结构域, 在IPR中没有
明确分类, 位于20~379位(PTHR12001: SF52)。
利用推测的蛋白序列检索NCBI的CDD (Con-
served Domain Database)数据库, 发现 TkGGPPS蛋
白属于类异戊二烯超家族成员(图5), 其功能可能
与萜类物质的合成有关。
2.4 橡胶草TkGGPPS氨基酸序列分析
由表2可知, 利用GenBank数据库中的Blastp
图4 InterProScan 预测的TkGGPPS蛋白保守结构域
Fig.4 Conserved domains of TkGGPPS protein predicted by InterProScan
表2 TkGGPPS编码的氨基酸序列与其他物种相似蛋白的同源性比对
Table 2 Multiple alignment of amino acid sequence encoded by TkGGPPS with homologous proteins from other plants
物种 相似性/% 基因 登录号
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 66.32 AtGGPPS AAA32797.1
长春花(Catharanthus roseus) 69.37 CrGGPPS AGL91648.1
甜瓜(Cucumis melo) 68.07 CmGGPPS AGN48013.1
沙枣(Elaeagnus umbellata) 66.75 EuGGPPS ACO59905.1
巨桉(Eucalyptus grandis) 66.49 EgGGPPS XP_010070017.1
大豆(Glycine max) 67.72 GmGGPPS XP_003537515.2
向日葵(Helianthus annuus) 74.67 HaGGPPS AAC77874.1
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis) 64.64 HbGGPPS BAF98302.1
啤酒花(Humulus lupulus) 68.24 HlGGPPS ACQ90682.1
紫花苜蓿(Medicago sativa) 66.40 MsGGPPS ADG01841.1
烟草(Nicotiana tabacum) 69.47 NtGGPPS AHA58681.1
金鱼草(Sesamum indicum) 70.60 SiGGPPS XP_011083737.1
图5 TkGGPPS蛋白保守域分析
Fig.5 Prediction conserved domain of TkGGPPS
植物生理学报308
程序对TkGGPPS的氨基酸进行同源性分析, 结果
表明橡胶草TkGGPPS与向日葵HaGGPPS的相似
性最高, 为74.67%; 与橡胶树HbGGPPS蛋白序列的
相似性最低, 为64.64%。序列比对(图6)发现, 所有
的GGPPS都含5个保守区域, 而这些保守区域在所
有的异戊二烯基焦磷酸合酶中都存在。包括: 保
守区域I (GKxxR)、保守区域II [H(x)6DDxx(xx)D(x)4
RRG(x)4H(x)12N/D]、保守区域III (GQ)、保守区域IV
(KT)和保守区域V [FQxxDDxxN/D(x)9K(x)4D(x)4K]。
另外, 用Prosite软件(http://us.expasy.org/prosite/)在
图6 TkGGPPS氨基酸与其他物种氨基酸序列比对
Fig.6 Multialignment of the deduced amino acid sequences of TkGGPPS and other plant genes
I~V: 异戊烯基转移酶的5个保守区。
李永梅等: 能源植物橡胶草TkGGPPS基因的克隆及表达分析 309
线分析TkGGPPS蛋白质的结合位点, 发现163~179
aa和296~308 aa分别是两个聚异戊二烯基合酶的
特异序列LIhDDlpcmDnddfRRG和IGllFQVvD-
DIlD, 即DD(X)4D和DD(X)2D, 可以断定本实验所
获得cDNA序列编码的应是GGPP合酶蛋白, 因此
将该基因命名为TkGGPPS。
2.5 橡胶草TkGGPPS系统进化分析
利用分子进化遗传分析软件MEGA 5.02分析
不同物种间GGPPS的演化关系, 釆用邻位相连法
(Neighbor-joining)构建系统进化树(图7), 结果表明
所有植物和细菌的GGPPS聚集一个大类, 酵母的
GGPPS自成一支, 所有的动物GGPPS则聚集成一
类。目前, 将不同来源的GGPPS划分为3个不同类
型: I型(古细菌)、II型(植物和真细菌)和III型(真
菌、昆虫和哺乳动物) (Hermni等2003; Ling等
2007)。因此, TkGGPPS应该属于II型。
正如预期的那样, 所有植物的GGPPS聚成一
支, 且橡胶草的GGPPS和向日葵的GGPPS是最接
近的。另外, 向日葵法呢基焦磷酸合酶(HaFPS)则
独自聚为一支, 这表明GGPPS与FPS可能有不同的
起源。
3 TkGGPPS在橡胶草不同组织和不同发育时期的
表达
用qRT-PCR检测TkGGPPS在橡胶草不同组织和
不同发育时期中的表达程度。实验结果(图8)表明,
TkGGPPS在橡胶草的主根和种子中明显表达, 在花
和花梗中表达量较少; 而TkGGPPS在种子萌发后生
长6周的橡胶草主根中, 表达量明显高于其他时期。
讨　　论
GGPPS催化烯丙基焦磷酸和IPP缩合形成
GGPP, GGPP是各种异戊烯基焦磷酸化合物合成的
关键前体物质之一。该类化合物在植物的代谢和
生长发育过程中具有不同的功能。
本研究采用RT-PCR和RACE技术, 从橡胶草中
克隆了一个新的GGPPS基因, 并命名为TkGGPPS,
该基因包含一个1 140 bp的开放阅读框。多重序
列比对结果显示, TkGGPPS蛋白与其他植物的
图7 橡胶草GGPPS与其他物种GGPPS蛋白的系统进化关系
Fig.7 Phylogenetic relationship of TkGGPPS and other plant GGPPS proteins
分支线的长度代表遗传分化距离, 数字代表遗传距离的置信度。
植物生理学报310
GGPPSs高度保守, 而且具有GGPPSs的所有5个保守
区, 这表明它是GGPPS家族的一个新成员。通过对
橡胶草GGPPS氨基酸保守结构域的分析, 发现含有
2个聚异戊二烯基合酶特征的功能域, 即DD(X)4D和
DD(X)2D, 该区域可以与底物结合, 是重要的催化
位点(Hemmi等2003; Hao等2011), 表明TkGGPPS
蛋白属于类异戊二烯超家族的成员, 可能与质体
中萜类化合物(橡胶)的合成相关。利用Blastp程序
对TkGGPPS的氨基酸进行同源性分析, 结果表明
橡胶草TkGGPPS与同属的向日葵HaGGPPS的相
似性最高, 为74.67%; 与木本植物橡胶树HbGGPPS
蛋白序列的相似性最低, 为64.64%。进化分析表
明, 不同物种的GGPPS蛋白序列具有明显的种族
特异性, 动物、植物、细菌和真菌来源的GGPPS
在进化上属于不同的分支(张浩2014; Ling等2007),
所有的植物聚成一支, 且植物与细菌进化关系较
近, 而与真菌和动物进化关系较远。qRT-PCR结果
表明TkGGPPS基因在不同的组织和不同时期差异
表达, 橡胶主要在橡胶草根部合成, TkGGPPS基因
在主根中显著表达, 表明该基因可能与橡胶合成
相关, 通过基因工程技术提高橡胶草橡胶合成量,
对解决橡胶能源供不应求的现状具有重要的理论
和经济价值。但种子中TkGGPPS基因表达量较高
情况还有待进一步研究。
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图8 TkGGPPS在橡胶草不同发育时期和不同组织中的表达
Fig.8 Expression patterns of TkGGPPS at different
developmental stages and tissues in T. kok-saghyz
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Cloning and expression analysis of the TkGGPPS gene from engery plant Ta-
raxacum kok-saghyz
LI Yong-Mei, FENG Yu-Jie, LI Jin, ZHAO Li-Jing, YAN Jie*
College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000, China
Abstract: Geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) is one of the important regulating targets in plant
cell terpenoid substances synthetic. A new cDNA sequence encoding GGPPS, designated as TkGGPPS (Gen-
Bank: KT028713), from Taraxacum kok-saghyz was cloned by RT-PCR and RACE techniques and assayed by
bioinformatics. The cDNA sequence of TkGGPPS was of 1 140 bp encoding 379 amino acids. Sequence analy-
sis showed that TkGGPPS was one of the members of short chain prenyltransferases super family. Its function
may be associated with the synthesis of terpenoid substances. Amino acid sequence homology alignment and
phylogenetic analysis showed that the similarition of TkGGPPS and HaGGPPS from Helianthus annuus were
more than 74.67%. Quantitative RT-PCR analysis revealed that TkGGPPS genes expressed in 6th-week T. kok-
saghyz root and mature seeds signifi cantly. This work will provide certain theoretical guidance and technical
support for further study to metabolic pathways and functional gene related to the synthetic rubber.
Key words: Taraxacum kok-saghyz; GGPPS; gene clone; sequence analysis; expression analysis
Received 2015-11-18 Accepted 2016-01-11
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31360060).
*Corresponding author (E-mail: jiey@shzu.edu.cn).