全 文 ：中国农业科学 2016,49(6):1034-1046
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.002

收稿日期：2015-10-16；接受日期：2016-01-14
基金项目：国家自然科学基金（31360060）
联系方式：曹新文，Tel：15699338626；E-mail：cxw981319376@163.com。通信作者闫洁，Tel：13677564159；E-mail：jiey@shzu.edu.cn


橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析
曹新文，王秀珍，李永梅，赵李婧，马海霞，闫 洁
（石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000）

摘要：【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟
戊酸途径中的关键酶，获得橡胶草 FPS 基因并转化野生橡胶草，为研究 FPS 基因在橡胶草橡胶生物合成过程
中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草 FPS 基因全长 cDNA 序列，并对该基因进行
生物信息学分析。对橡胶草和其他 18 种不同高等植物的 FPS 氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取
橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子 RNA，对 FPS 基因进行组织特异性表达分析，并对不同生
长时期的橡胶草 FPS 表达量进行比较，分析橡胶草生长过程中 FPS 的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中
过表达，对得到的转基因和野生型植株 FPS 相对表达水平进行分析，比较转基因和野生型植株橡胶含量的变
化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶，测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草 FPS 基因全长 cDNA
序列，命名为 TKFPS（GenBank 登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含 1 个 1 029 bp 的完整开放阅
读框，编码 342 个氨基酸，编码的蛋白质相对分子量为 39.35 kD，理论等电点（pI）为 5.41，平均疏水性为
-0.242。多序列比对结果表明，橡胶草 FPS 氨基酸序列含有高等植物 FPS 基因的 5 个保守结构域，系统发育
分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支，其亲缘关系最近。TMHMM 和 TargetP 亚细胞定位分析
得知，TKFPS 蛋白无跨膜区域，可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明 TKFPS 在橡胶草的
根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达，其中，在叶中表达量最高，根次之，在花中表达量最低。重组
子 pCAMBIA2300-35S-TKFPS 经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘，得到 6 株转基因植株。实时荧光定量 PCR
检测发现，与野生型相比，转基因株系 FPS 的相对表达量水平明显升高，6 株转基因株系 TKFPS 表达量平均
约是野生型的 2.8 倍。橡胶含量测定结果表明 6 株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了
3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得 TKFPS，并转化野生橡胶草得到转 TKFPS 的高产橡胶草株系，FPS
在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。
关键词：橡胶草；法尼基焦磷酸；生物信息学；Real-time PCR

Molecular Cloning and Functional Analysis of Farnesyl
Pyrophosphate Synthase Genes from
Taraxacum kok-saghyz Rodin
CAO Xin-wen, WANG Xiu-zhen, LI Yong-mei, ZHAO Li-jing, MA Hai-xia, YAN Jie
(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang)

Abstract: 【Objective】 The Farnesyl pyrophosphate synthase (FPS) is a key enzyme in the mevalonate biosynthesis pathway
of the crude rubber. The FPS was cloned from Taraxacum kok-saghyz Rodin and transformed into the wild types, this study will lay a
foundation for the research of regulating effects of FPS gene on T.kok-saghyz biosynthesis. 【Method】 Homologous cloning was
used to clone the full-length cDNA of this gene, bioinformatic analysis was conducted. Multiple sequence alignment and
6期 曹新文等：橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析 1035

phylogenetic tree analysis were performed using typical sequences of T.kok-saghyz and other 18 plants FPS proteins. The total RNA
was extracted from root, petiole, leaf, peduncle, flower and seed to analysis tissue-specific expression of FPS gene in T.kok-saghyz.
The comparation of relative expression levels of the FPS from different growth stages of T.kok-saghyz was processed to research the
regulating role of TKFPS in different developing periods of T.kok-saghyz. And this gene was overexpressed in T.kok-saghyz, the
expression level of TKFPS and rubber content changes were analyzed after the FPS overexpressed. The rubber was extracted from
roots of the wild-type and transgenic strains with Alkali cooking method for determining rubber content. 【Result】 The full-length
cDNA of the FPS from T.kok-saghyz was obtained (TkFPS, KJ558350.1). The ORF of 1029 bp encodes 342 amino acid residues
with the predicted molecular weight of 39.35 kD, isoeletric point value of 5.41 and average hydrophobicity value of -0.242. Amino
acid sequence analysis showed that it contains five conserved domains of FPS gene in higher plants. Phylogenetic tree analysis
showed that the T.kok-saghyz had the closest evolutionary relationship with Herba Taraxaci. Subcellular localization analysis of
TMHMM and TargetP indicated that it might be targeted to the cytoplasm without transmembrane region. TKFPS gene was
expressed in the root, petiole, leaf, peduncle, flower and seed of T.kok-saghyz by the tissue-specificity expression. The expressive
content of TKFPS gene in different tissues of T.kok-saghyz was different: the highest was leaf, the next was root, and the lowest level
was in flower. Six transgenic strains were obtained after recombinant pCAMBIA2300-35S-TkFPS was transformed to wild
T.kok-saghyz by Agrobacterium-mediated transformation. The fluorescent quantitative RT-PCR showed that the relative expression
levels of the FPS in transgenic lines were significantly higher, with the increases up to 2.8 times over the wild types. On average,
rubber assay results showed that rubber content in roots of six transgenic lines was increased by about 3.92% compared to the wild
types. 【Conclusion】 The FPS was successfully cloned from T.kok-saghyz and transformed into the wild types. The obtained
transgenic lines had much more rubber than the wilds, this result indicated that TKFPS does play an important role in the biosynthetic
pathway of the rubber in T.kok-saghyz.
Key words: Taraxacum kok-saghyz Rodin; farnesyl pyrophosphate synthase; bioinformatics; real-time PCR

0 引言
【研究意义】天然橡胶是由许多的顺式-异戊二烯
聚合在一起形成的高分子聚合物，中国是全球第一天
然橡胶消费大国，因天然橡胶及其产品在中国国民经
济和国防建设中占有战略地位，天然橡胶的生产、供
给将对中国相关领域产生重大影响。世界上存在约 2
500 种产胶植物，只有少数物种产生的天然橡胶的物
理性能符合工业生产需要，如：巴西橡胶树、银胶菊
和橡胶草[1]。据调查，中国将近全部的进口橡胶都来
源于东南亚，随着国民经济的快速发展，中国天然橡
胶的需求量还在增加[2]。由于中国巴西橡胶树种植在
高纬度地区，这样的生存环境和抗病性总体较差，还
会受到各种病虫害和天气灾害的影响，与东南亚天然
橡胶的主产区的单位面积产量相比，中国巴西橡胶产
量较低，自产的橡胶已远不能满足国内需求[3]，所以
亟须寻找开发新的可用天然橡胶资源。【前人研究进
展】橡胶草由于其独特的特性，近年来受到广泛关注。
橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin），菊科蒲公英
属多年生草本植物，其根叶含乳管，根内含有高达 20%
的橡胶，所产橡胶结构和功能与巴西橡胶相似[4]。橡
胶草是草本的产胶植物，适应性强，在许多气候条件
下能够快速生长；同时，橡胶草从播种至收获只需要
1 年时间，不但可以密集种植，收割也能够实现自动
化，能在短期内得到较大的产量[5]。此外，橡胶草服
从常规育种和基因工程，橡胶草的乳管也可以作为产
胶功能基因鉴定平台，因此，橡胶草是研究植物产胶
机理的良好模式植物，也是具有发展前途的产胶植物。
类异戊二烯途径是植物体内一条重要的次生物质代谢
途径，多种与生长发育相关的激素（赤霉素、脱落酸、
细胞分裂素）以及类胡萝卜素、质体醌、甾体和皂苷
等各种萜类次生代谢物质的生物合成都与该途径密切
相关[6]。橡胶主要通过依赖于甲羟戊酸的植物类异戊
二烯次生代谢途径合成，是一个酶促顺-1,4-异戊二烯
聚合到长链聚异戊二烯链的过程。此途径中，异戊二
烯 单 体 来 源 于 异 戊 二 烯 焦 磷 酸 （ isopentenyl
pyrophosphate，IPP 或 IDP），IPP 来源于甲羟戊酸
（mevalonic acid，MVA），MVA 来源于乙酰-CoA
（acetyl CoA），乙酰-CoA最终来源于蔗糖。橡胶在
胶乳细胞中的橡胶粒子表面合成，其生物合成大致可
以分为 3 个阶段:（1）乙酰-CoA 的形成；（2）乙酰
-CoA 经 MVA 途径合成 IPP、二甲基丙烯基焦磷酸
（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP或 DMADP）、
牻牛儿基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP 或
GDP）、法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP
或 FDP）和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl
1036 中 国 农 业 科 学 49卷

pyrophosphate， GGPP或 GGDP）；（3）IPP聚合
形成橡胶分子[7]。法尼基焦磷酸合酶是一种异戊烯
基转移酶，是类异戊二烯代谢途径的关键酶之一，
在异戊二烯代谢途径中，主要催化五碳原子的异戊
烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）
以 1,4头尾连续缩合反应，形成法尼基焦磷酸（FPP），
FPP 是甾体、皂苷、倍半萜等许多萜类衍生物的合
成前体。已有多种植物的法尼基焦磷酸合酶基因
（FPS）的 cDNA被克隆，包括拟南芥[8]、青蒿、玉
米和棉花等[9]。【本研究切入点】近年来，FPS 基
因的克隆表达以及转基因的研究非常多，如 FPS基因
的过量表达，青蒿素含量提高近 4倍[10]，薄荷的 FPS
基因在烟草中转基因，对赤星病抗性明显提高[11]。
但是 FPS对相关产胶途径的调控机制还不甚明确。
【拟解决的关键问题】本研究通过克隆橡胶草 FPS基
因，构建植物过表达载体 pCAMBIA2300- 35S-TKFPS
并转化野生橡胶草。通过荧光定量 PCR 检测并测定
橡胶含量，同时，通过基因工程的手段提高橡胶草中
的橡胶含量，获得高产橡胶草植株，为研究 FPS 基
因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 材料
橡胶草野生植株于2013年6月采自新疆石河子北
泉镇农田沟渠旁，后移栽至温室栽培。大肠杆菌
TOP10、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）
GV3101、植物表达载体 pCAMBIA2300由石河子大学
农业生物技术重点实验室保存；Taq DNA polymerase、
M-MLV反转录试剂盒、内切酶 BamHⅠ和 SalⅠ、T4
DNA ligase、pGM-T vector及普通琼脂糖凝胶 DNA回
收试剂盒等购自于北京天根生化科技有限公司；LA
Taq DNA polymerase购自 TaKaRa公司，各种限制性
内切酶购自 TIANGEN公司；引物合成、序列测定由
北京华大基因科技股份有限公司完成；其他试剂均为
分析纯。
1.2 总 RNA 的提取和 cDNA 的合成
用艾德莱公司 RNA 提取试剂盒提取橡胶草叶片
总RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA
完整性及浓度，依据 EasyScript RT试剂盒说明操作反
转录合成 cDNA，-20℃保存备用。
1.3 全长 cDNA 的 PCR 扩增及测序
根据 GenBank公布的蒲公英法尼基焦磷酸酶基
因序列（GenBank 登录号分别为 JX424566.1 和
JX424567.1），结合软件 Primer premier5.0设计特异
性引物 TKFPSF1：5′-GGATCCTCTCACACCTTTGCC
GATCAT-3′，TKFPSR1：5′-GTCGACTTTGGCAAAAC
GATCACTACC-3′，以 cDNA 为模板进行扩增。PCR
反应体系为 cDNA 1.5 µL、TKFPSF1和 TKFPSR1各
0.5 µL、DNA Polymerase 0.5 µL、dNTP 2 µL、10×Taq
Reaction Buffer 2.5 µL，灭菌 ddH2O补足至 25 µL。反
应程序为 94℃ 5 min；94℃ 45 s，61℃ 45 s，72℃ 1
min30 s，30个循环；72℃ 7 min；4℃保存。PCR产
物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收，并连接
pMD19-T Vocter转化大肠杆菌 TOP10，挑取阳性克隆
交由北京华大基因公司测序。
1.4 生物信息学分析
应用DNAMAN软件分析TKFPS的开放阅读框和
氨基酸序列，采用 ProtParam （http://web.expasy.org/
protparam/）对编码蛋白的理化性质推测分析；用 NCBI
的 CDD 在线预测编码蛋白的保守域，利用 BLASTX
搜索同源氨基酸序列，用 DNAMAN软件分析不同来
源氨基酸的相似性。用 Clustal X和MEGA4.1软件构
建系统进化树。
1.5 TKFPS 的组织特异性分析
以橡胶草种子、叶、叶柄、花梗、花和根等不
同组织的 TKFPS cDNA为模板，选择双链 DNA结
合染料 SYBR GreenⅠ，进行实时荧光定量 PCR检
测，内参基因为橡胶草 GAPDH，反应所用引物为
TKFPSForward：5′-CCTTCGAGTTCGATGACGATTC
-3′，TKFPSReverse：5′-TCCGCCTTTAAGCAACTGG
TAG-3′。TKGAPDHForward：5′-CCAGCTGTACAACC
AACTGCCT-3′，TKGAPDHReverse：5′-TCCAGTCCTT
CATTGATGGACC-3′。反应体系为样品溶液 0.5 μL，
上下游引物各 0.5 μL，SYBR Green I Mster 5 μL，蒸
馏水补足到 10 μL。反应程序为 95℃ 1 min；95℃ 15
s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。3次重复。
使用 SPPS13.0和 Microsoft Excel（2007）软件进行
数据分析。
1.6 植物表达载体构建
用 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切 pMD19-T-TKFPS 重
组质粒和含有 CaMV35S 启动子的植物表达载体
pCAMBIA2300，将二者的产物用 T4 DNA 连接酶
16℃过夜连接，然后转化大肠杆菌 Top10，涂布到
含有卡那霉素的 LB 固体培养基上，37℃培养。
PCR、双酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆测序验
6期 曹新文等：橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析 1037

证。构建成功的表达质粒命名为 pCAMBIA2300-
35S-TKFPS。
1.7 转 TKFPS 橡胶草植株的获得
重组质粒 pCAMBIA2300-35S-TKFPS电转化根癌
农杆菌 GV3101，通过菌液 PCR方法筛选阳性克隆用
于转化。
采摘橡胶草幼嫩叶片，先用 10%的洗洁精水溶液
浸泡 10 min，无菌水冲洗 5次；用 75%的酒精消毒 30
s；然后用 0.1%的升汞消毒 7 min；用无菌水冲洗 5次，
每次 5 min。剪去叶片边缘和主叶脉成大小约 1 cm×1
cm 的叶盘，将其放置在芽分化培养基 1（MS+2.0
mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1 NAA）上培养。培养条件：光
照 16 h/8 h，温度 25℃。待愈伤组织分化出丛生芽后，
切取单个芽至生根培养基 1 中（ 1/2MS+0.3
mg·L-1NAA）继续培养。
采用叶盘法通过农杆菌介导将 pCAMBIA2300-
35S- TKFPS整合到橡胶草基因组中，叶盘侵染后在芽
分化培养基 2（MS+2.0 mg·L-1 6-BA +0.3 mg·L-1 IAA
+50 mg·L-1 Kan +400 mg·L-1 Cb）上培养，待分化出丛
生芽后，切取单个芽至生根培养基 2 中（1/2MS+
0.2mg·L-1 NAA+50 mg·L-1Kan +400 mg·L-1 Cb）继续培
养，光照 16 h/8 h，25℃，直至分化生根，得到再生
植株。1 个月后，将生长良好的幼苗移栽至营养土
中。
1.8 再生植株检测
采用 CTAB法提取转基因橡胶草叶片 DNA，以
其为模板，选用 P35S 与 TKFPS 中的一段序列设计
特异性引物 TKFPSF2：5′-CATCATTGCGATAAAG
GAAAGGC-3′和 TKFPSR2：5′-AGTATGCTTGAAG
CCATTCAACAC-3′进行 PCR 扩增来鉴定阳性转基
因植株。
1.9 Real-time PCR 分析
转 TKFPS橡胶草生长至种子成熟期，取新鲜橡胶
草根约 1 g，同 1.2中所述方法提取根部总 RNA，并
合成 cDNA。荧光定量 PCR反应所用引物和反应条件
参照 1.5。
1.10 过表达 TKFPS 植株生物学性状及橡胶含量测定
当野生橡胶草和转基因橡胶草生长水平一致时，
分别随机选取 3个株系整株收获，分叶和根两部分进
行生物性状统计。80℃烘箱干燥 24 h至恒重，分别称
取质量，得到橡胶草叶和根的生物量。计量叶长、叶
宽、花梗、鲜重和干重。
橡胶提取采用 1951年罗士韦等[4]的改进方法完
成。碱煮法是先将一段橡胶草根在 3%的氢氧化钠中
煮软（至少 1 h），煮毕，用流水冲洗 10 min，将水
榨干，放入水中再煮 30 min，加以冲洗，榨干。榨干
后即放入乳钵中加水研磨。在研磨中随时更换清水，
到乳钵内水不浑浊为止。将余留在乳钵中的橡胶取出，
榨干，在 40—60℃榨干，最终在 70—75℃干燥至恒重
为止。
2 结果
2.1 橡胶草 FPS 基因的克隆
以新疆野生橡胶草叶片 cDNA为模板进行 PCR扩
增，经琼脂糖凝胶电泳检测得到一条约 1 000 bp的特异
性条带，与预期片段大小相一致（图 1）。经测序，测
序结果与预测一致，得到 pMD19-T-TKFPS。重组质
粒酶切鉴定得到 1 000 bp左右大小条带，表明成功从
野生橡胶草中克隆到全长 TKFPS（GenBank 登录号
为 KJ558350.1）。DNAMAN软件分析发现该基因包
含 1 029 bp的完整开放阅读框，编码 342个氨基酸。



M：DNA marker III；1—8：RT-PCR扩增产物
M: DNA marker III, 1-8: RT-PCR amplification of TKFPS gene

图 1 TKFPS 的克隆
Fig. 1 The clone of FPS from T. kok-saghyz Rodin

2.2 TKFPS 序列分析
生物信息学分析表明，TKFPS编码的蛋白质相对
分子量为 39.35 kD，理论等电点（pI）为 5.41，平均
疏水性为-0.242。采用 SOPMA方法分析 TKFPS蛋白
的二级结构，其中，有 211个氨基酸残基参与组成 α-
螺旋（占 61.70%），67 个氨基酸残基参与组成无规
卷曲（占 19.59%），含有 β转角 8.19%，β-折叠 10.53%。
利用 NCBI 在线分析工具 CDD 分析保守 Domain
（CD），结果表明，TKFPS属于 Isoprenoid-Biosyn-C1
蛋白家族（图 2）。在线软件 TMHMM和 TargetP分
1038 中 国 农 业 科 学 49卷

substrate binding pocket
substrate-Mg2+ binding site
active site lid residues
chain length determination region
catalytic residues
aspartate-rich region 1
aspartate-rich region 2
Trans_IPPS_HT
Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily
氨基酸序列
Query seq.
氨基酸特定部分 Specific hits
蛋白超家族 Superfamilies
1 50 100 150 200 250 300 343

图 2 TKFPS 保守结构域的预测结果
Fig.2 Prediction of FPS conserved domain from T. kok-saghyz Rodin

析得知，TKFPS蛋白无跨膜区域，可能定位于细胞质
中发挥功能。
橡胶草与巴西橡胶树（Hevea brasiliensis，
AAM98379.1）、大戟（ Euphorbi pekinensis，
ACN63187.1）、丹参（Salvia miltiorrhiz，ABV08819.1）、
甘草（Glycyrrhiza uralensis，ADE18770.1）、黄花蒿
（Artemisia annua，AAD17204.1）、黄芪（Astragalus
membranaceus，AID51444.1）、积雪草（Centella
asiatica，AAV58896.1）、陆地棉（Gossypium hirsutum，
AHI44281.1）、苜蓿（Medicago sativa，ADC32809.1）、
蒲公英（Taraxacum mongolicum，AFW98438.1）、人
参（Panax ginseng，AAY87903.1）、三脉紫苑（Aster
ageratoides，AFW98436.1）、土沉香（Aquilaria sinensis，
AHG54251.1）、向日葵（ Helianthas annuus，
AFW98437.1）、亚洲蓍（Achillea asiaica，AFW98432.1）、
杨树（Populus trichocarpa，XP_002308751.2）、
鹰嘴豆（Cicer arietinum，XP_004486372.1）、中
粒咖啡（Coffea canephora，CDP13684.1）18个高
等植物的 FPS氨基酸序列比对显示，新疆野生橡胶
草 TKFPS 与黄花蒿和向日葵的相似性最高，达
92.69%（图 3）。经多种植物 FPS蛋白质氨基酸序
列比对分析，发现均含有相同的 5 个保守结构域
（Ⅰ—Ⅴ），表明各物种 FPS基因在进化过程中相
对保守。
对新疆野生橡胶草、巴西橡胶树、大戟、丹参、
甘草、黄花蒿、黄芪、积雪草、陆地棉、苜蓿、蒲
公英等 19 个物种的 FPS 氨基酸序列进行分子进化
分析（图 4）。19个 FPS氨基酸序列被聚为三大类，
新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支，其亲缘关
系最近。
2.3 TKFPS 的组织特异性表达
实时荧光定量 PCR 分析 TKFPS 在橡胶草不同
组织的表达情况，结果（图 5-A）表明，TKFPS在
橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表
达，其中，在叶中表达量最高，根次之，在花中表
达量最低。橡胶草橡胶主要分布在根中，同时分析了
TKFPS 在不同时期根中表达情况，结果显示，
TKFPS 在橡胶草根中的表达随生长期呈先上升后
下降的趋势，其中，在生长期为 6个月左右时表达
量最高（图 5-B）。
2.4 植物过表达载体pCAMBIA2300-35S-TKFPS的构建
通过 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定阳性质粒，电泳
检测得到 2条条带，其中一条大小约为 1 000 bp，与
预期大小相一致，表明植物表达载体 pCAMBIA2300-
35S- TKFPS构建成功。
将重组子 pCAMBIA2300-35S-TKFPS通过电击法
转导根癌农杆菌 GV3101，28℃培养 48 h，菌液 PCR
筛选阳性菌株，用于遗传转化。
2.5 橡胶草的遗传转化及再生
通过叶盘法对橡胶草进行农杆菌侵染，侵染后的
叶盘在芽分化培养基 2（MS+2.0 mg·L-1 6-BA +0.3
mg·L-1 IAA +50 mg·L-1 Kan +400 mg·L-1 Cb）上培养 2
周后，开始膨大，两端分化出愈伤组织，15 d左右继
代一次。在芽分化培养基上分化出不定芽，切取单个
芽到生根培养基 2（1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 mg·L-1
Kan +400 mg·L-1 Cb）上诱导生根。生根培养约 30 d
得到完整再生植株，移栽到营养土中，光照 16 h/8 h，
25℃继续生长（图 6）。
6期 曹新文等：橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析 1039

112亚洲蓍 Achillea asiaica
113土沉香 Aquilaria sinensis
112黄花蒿 Artemisia annua
112三脉紫苑 Aster ageratoides
113黄芪 Astragalus membranaceus
113积雪草 Centella asiatica
113鹰嘴豆 Cicer arietinum
113中粒咖啡 Coffea canephora
113大戟 Euphorbia pekinensis
113甘草 Glycyrrhiza urahensis
113陆地棉 Gossypium hirsutum
112向日葵 Helianthas annuus
113巴西橡胶树 Hevea brasiliensis
113苜蓿Medicago sativa
113人参 Panax ginseng
113杨树 Populus trichocarpa
113丹参 Salvia miltiorrhiz
112橡胶草 Taraxacum kok-saghyz Rodin
112蒲公英 Taraxacum mongolicum
225
226
225
225
226
226
226
226
226
226
226
225
226
226
226
226
226
225
225
338
339
338
338
339
339
339
339
339
339
339
338
339
339
339
339
339
338
338
Ⅰ Ⅱ
Ⅲ Ⅳ
亚洲蓍 Achillea asiaica
土沉香 Aquilaria sinensis
黄花蒿 Artemisia annua
三脉紫苑 Aster ageratoides
黄芪 Astragalus membranaceus
积雪草 Centella asiatica
鹰嘴豆 Cicer arietinum
中粒咖啡 Coffea canephora
大戟 Euphorbia pekinensis
甘草 Glycyrrhiza urahensis
陆地棉 Gossypium hirsutum
向日葵 Helianthas annuus
巴西橡胶树 Hevea brasiliensis
苜蓿Medicago sativa
人参 Panax ginseng
杨树 Populus trichocarpa
丹参 Salvia miltiorrhiz
橡胶草 Taraxacum kok-saghyz Rodin
蒲公英 Taraxacum mongolicum
亚洲蓍 Achillea asiaica
土沉香 Aquilaria sinensis
黄花蒿 Artemisia annua
三脉紫苑 Aster ageratoides
黄芪 Astragalus membranaceus
积雪草 Centella asiatica
鹰嘴豆 Cicer arietinum
中粒咖啡 Coffea canephora
大戟 Euphorbia pekinensis
甘草 Glycyrrhiza urahensis
陆地棉 Gossypium hirsutum
向日葵 Helianthas annuus
巴西橡胶树 Hevea brasiliensis
苜蓿Medicago sativa
人参 Panax ginseng
杨树 Populus trichocarpa
丹参 Salvia miltiorrhiz
橡胶草 Taraxacum kok-saghyz Rodin
蒲公英 Taraxacum mongolicum

Ⅰ—Ⅴ法尼基焦磷酸合酶的 5个保守区 Ⅰ-Ⅴ: The five conserved regions of Farnesyl Pyrophosphate Synthase

图 3 TKFPS 与其他物种氨基酸序列多重比对
Fig. 3 Multiple alignment of the TKFPS amino acid sequences of T. kok-saghyz Rodin and other plants

2.6 橡胶草再生植株 PCR 检测
以再生植株基因组 DNA 为模板进行 PCR 检
测。获得 771 bp 特异的扩增条带，与目标大小相
一致。初步鉴定得到 6株转 TKFPS橡胶草植株（图
略）。
2.7 转基因橡胶草的 Real-time PCR 检测
以野生型和转 TKFPS的转基因植株 cDNA为模
板，进行实时荧光定量 PCR 反应。不同植株 FPS 相
对表达量如图 7，与野生型相比，转基因株系 FPS的
相对表达量水平明显升高。6 株转基因株系，其中，
F9 株系的 FPS 表达量水平与野生型相比提高了 5.54
倍，F14提高了 3.0倍。
2.8 转基因植株的生物学性状分析
不同生长时期的野生型橡胶草如图 8所示，1个
1040 中 国 农 业 科 学 49卷

苜蓿Medicago sativa ADC32809.1
鹰嘴豆 Cicer arietinum XP_004486372.1
甘草 Glycyrrhiza urahensis ADE18770.1
黄芪 Astragalus membranaceus AID51444.1
杨树 Populus trichocarpa XP_002308751.2
巴西橡胶树 Hevea brasiliensis AAM98379.1
大戟 Euphorbia pekinensis ACN63187.1
陆地棉 Gossypium hirsutum AHI44281.1
丹参 Salvia miltiorrhiz ABV08819.1
中粒咖啡 Coffea canephora CDP13684.1
人参 Panax ginseng AAY87903.1
积雪草 Centella asiatica AAV58896.1
向日葵 Helianthas annuus AFW98437.1
三脉紫苑 Aster ageratoides AFW98436.1
亚洲蓍 Achillea asiaica AFW98432.1
黄花蒿 (Artemisia annua AAD17204.1
蒲公英 Taraxacum mongolicum AFW98438.1
0.02
土沉香 Aquilaria sinensis AHG54251.1
橡胶草 Taraxacum kok-saghyz Rodin AHZ21075.1

标尺上面的数字代表遗传距离 The numbers in the ruler indicate the genetic distances

图 4 橡胶草与其他科属植物 FPS 氨基酸序列的分子系统进化树系统树
Fig. 4 Phylogenetic tree of FPS from T. kok-saghyz Rodin and other plants

相
对
表
达
水
平
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
r
相
对
表
达
水
平
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
r


A：橡胶草不同组织 Different tissues of T. kok-saghyz Rodin；B：橡胶草不同时期 Different growth stages of T. kok-saghyz Rodin roots

图 5 TKFPS 在橡胶草中的 qRT-PCR 分析
Fig. 5 Expression patterns of TKFPS by qRT-PCR analysis

月的橡胶草长出两片真叶，有一条主根。生长到 2
个月的橡胶草叶片数目增多，叶片变宽变长，在主根
上长出 4—5条侧根。生长到 3个月大时，橡胶草的
叶片明显变大，叶尖弯曲，数目增多，侧根增加，有
许多须根。一年生的橡胶草叶柄基部变粗，主根长而
不规则弯曲，在侧根上分化出新的幼苗；在野生橡胶
草和转基因橡胶草生长水平一致的情况下，进行生物
性状统计（表 1），形态观察发现转基因橡胶草和野
6期 曹新文等：橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析 1041



图 6 橡胶草的再生
Fig. 6 Regeneration process of T. kok-saghyz Rodin

相
对
表
达
水
平
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
r


WT：野生型橡胶草 Wild-type T. kok-saghyz Rodin；F9、F14、F26、F41、F48、F61：转基因橡胶草 Transgenic T. kok-saghyz Rodin

图 7 转 FPS 橡胶草的 Real-time PCR 检测
Fig. 7 Real-time PCR detection for regenerated T. kok-saghyz Rodin plants

表 1 转 FPS 橡胶草的生物学性状调查
Table 1 Comparison of biological characteristics between wild-type (CK) and transgenic T. kok-saghyz Rodin
性状 Trait CK FPS
叶长 Leaf length (cm) 17.23±1.14 12.36±1.26
叶宽 Leaf width (cm) 1.62±0.05 1.32±0.03
叶鲜重 Fresh weight of leaf (g) 7.69± 0.56 5.27±0.48
叶干重 Dry weight of leaf (g) 1.45± 0.25 0.95±0.17
叶鲜重干重比 Ratio of leaves fresh and dry weight 5.30± 0.96 5.54±1.01
根鲜重 Fresh weight of root (g) 5.58± 0.18 3.16±0.08
根干重 Dry weight of root (g) 0.92± 0.02 0.54±0.01
根鲜重干重比 Ratio of roots fresh and dry weight 6.06±1.16 5.85±0.98
1042 中 国 农 业 科 学 49卷

生型橡胶草的叶片数目无明显区别，但叶形和叶色差
异显著。野生型橡胶草叶形为全缘或有数齿，叶面
较平展，而转基因橡胶草叶形有羽裂，裂片三角形，
叶面有皱褶，叶色为深绿色。同时转基因植株的侧
根多而粗，而野生型橡胶草只有一根主根，其余多
为须根（图 9）。
2.9 橡胶含量的检测
碱煮法提取橡胶草根部的橡胶，与野生型相比，
转基因橡胶草根中橡胶质量分数都有不同程度的提高
（图 10），其中 F9 和 F41 增加比较明显，6 株转基
因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了
3.92%。

A B
C
D

A：生长 1个月的橡胶草；B：生长 3个月的橡胶草；C：生长 6个月的橡胶草；D：1年生橡胶草。短线代表实际长度为 1 cm
A: T. kok-saghyz Rodin of one month; B: T. kok-saghyz Rodin of three months; C: T. kok-saghyz Rodin of six months; D: T. kok-saghyz Rodin of one year.
Short-term indicates the actual length of one centimeter

图 8 不同生长时期的橡胶草
Fig. 8 Different growth stages of T. kok-saghyz Rodin
A
B
WT F9 F14

WT：野生型橡胶草，F9、F14：转 FPS基因橡胶草。A：叶片生长形态观察，B：根的形态学观察
WT: Wild-type T. kok-saghyz Rodin; F9, F14: Transgenic plants. A: Observation of leaf morphology; B: Morphological observation on the root

图 9 转 FPS 橡胶草的形态学研究
Fig. 9 Morphological study of transgenic T. kok-saghyz Rodin plants
6期 曹新文等：橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析 1043

0
10
20
30
WT F9 F14 F26 F41 F48 F61
*
*
* *

WT：野生型橡胶草；F9、F14、F26、F41、F48、F61：转基因橡胶草。*表示 FPS表达水平相比于WT差异显著（P<0.05）
WT: Wild-type T. kok-saghyz Rodin; F9, F14, F26, F41, F48, F6: Transgenic T. kok-saghyz Rodin. *Indicates significant difference of FPS expression level
compared to WT(P<0.05)

图 10 转 FPS 橡胶草的橡胶含量检测
Fig. 10 Rubber content detection of regenerated transgenic T. kok-saghyz Rodin plants


3 讨论
本研究以新疆橡胶草为研究对象，通过 RT-PCR
技术克隆获得 TKFPS 的全长 cDNA 序列。序列分析
表明，TKFPS同苜蓿、鹰嘴豆、甘草、黄芪、橡胶树
等 18 种高等植物 FPS 氨基酸序列同源性高达 88%以
上，具有 2个高度保守的天冬氨酸区域（DDXXD，
Ⅱ和Ⅴ区），说明克隆的 TKFPS属于 FPS基因家族。
同时，19种植物都具有 FPS的 5个保守结构域，表明
结构域在分析进化过程中具有较高的稳定性，这可能
与其在生物代谢中行使同一功能相关。2个富含天冬
氨酸的结构域 DDXXD 被认为是酶与底物的结合位
点，是这一类酶的活性中心[6]。橡胶草 FPS编码的蛋
白质具有植物法尼基焦磷酸合酶的一般特征：在蛋白
的二级结构中，主要以 α-螺旋和无规卷曲为主，三
维立体结构由 α-螺旋形成空间性状为中心一个大空
洞的结构，这是法尼基焦磷酸合酶共有和必须的萜合
酶结构[12]。橡胶草 FPS 氨基酸序列进化分析表明，
橡胶草 FPS序列与橡胶树、丹参、人参等聚为一类，
而橡胶、丹参酮以及人参皂苷的生物合成都通过依赖
于甲羟戊酸的类异戊二烯代谢途径，FPS在合成过程
中发挥重要作用，这说明序列相似的基因可能在植物
的生命活动中发挥相似的功能。多数分离的 FPS 为
可溶性分子，已有的研究表明，该酶存在于细胞质、
线粒体[13-17]、叶绿体和过氧化物酶体[18]。研究通过
TMHMM跨膜结构预测和 TargetP亚细胞定位分析得
知，TKFPS蛋白无跨膜区域，可能定位于细胞质中发
挥功能。
将 TKFPS片段连接原核表达载体 pET-30a(+)，构
建橡胶草原核表达载体 pET-30a-TKFPS，IPTG诱导重
组蛋白的表达，得到约为 39 kD的蛋白电泳条带，与
预测蛋白分子量大小吻合。
国内外学者研究认为，植物 FPS 表达具有组织
特异性[19-21]，并且伴随着类异戊二烯衍生物含量而
增加[22]。陆地棉 FPS在棉花的叶片中表达量最高，铃、
蕾、茎中次之，根中表达量最低；建泽泻中的 FPS在
各个器官都表达[23]，其中，叶片具有较高的表达量，
叶柄、块茎和根中的表达量较低。而棉酚在成熟种子
中含量最高，建泽泻的块茎是其主要药用部位。有证
据表明次生代谢产物的合成和积累部位不同。Wink[24]
发现苦参碱型生物碱主要在叶片的天线绿色组织中
合成，然后通过韧皮部运输到植株的其他部分，主
要累积在树干和树枝的表皮和外表皮细胞组织中。
刘智等[25]也发现紫杉醇及其前体物质在中国红豆杉
体内存在转移现象。北柴胡中柴胡总皂苷含量变化
规律为根＞叶＞茎，而 FPS作为柴胡皂昔合成基因之
一，在花中表达量最高，叶子中表达量最低[26]；刺五
加的皂苷仅存在于叶片中，而不同器官中表达量的
分析结果表明，刺五加 FPS在幼茎中的表达量最高，
叶柄和根次之，叶片中的表达量最低[27]。橡胶草橡
胶主要存在于根中，本研究中基因组织特异性表达
结果显示，橡胶草 FPS 在不同器官中的相对表达量
从高到低依次是叶、根、叶柄，种子中 FPS 表达量
最低，这可能与植物体内物质的运输作用有关，即
具体的中间代谢产物与代谢终产物的合成可能在不
1044 中 国 农 业 科 学 49卷

同的器官中进行[23]。TKFPS 在不同时期根中表达结
果显示，TKFPS 在橡胶草不同时期根中都有表达，
表达量先上升后下降的趋势，其中，在橡胶草生长
至 6 个月时表达量最高，即结实期时根中 FPS 大量
表达，说明本研究克隆得到的 TKFPS可能主要在橡
胶合成中发挥作用。
基因过表达研究表明，FPS 能够提高转化植株
中类异戊二烯物质的含量。Daudonnet 等[28]将酵母
FPS 转入烟草，发现转基因植株中甾醇和类胡萝卜
素含量显著增加。Waleerat 等[29]和 Chen 等 [30]将棉
花 FPS的 cDNA转入青蒿中，发现在 5个转基因株
系中得到表达，青蒿素含量比对照高出 2—3 倍。
Han 等[31]将青蒿法尼基焦磷酸合酶基因 FPS1 在青
蒿中过量表达，发现转基因青蒿 FPS活性比非转基
因青蒿活性高 2—3倍，在转基因青蒿中最高青蒿素
含量约为干重的 0.9%，比非转基因青蒿高 34.4%。
本研究构建植物过表达载体 pCAMBIA2300-
35S-TKFPS，使 TKFPS在橡胶草中超量表达，得到
6株转基因植株。转基因植株实时荧光定量 PCR检
测发现，与野生型相比，转基因株系 FPS的相对表
达量水平明显升高。6株转基因株系 TKFPS表达量
结果显示，其中，F9 是野生型的 5.54 倍，F14 为
3.0 倍，平均约是野生型的 2.8 倍。碱煮法提取橡
胶草根部的橡胶，与野生型相比，转基因橡胶草根
中橡胶质量分数都有不同程度的提高，其中 4株分
别提高 7.48%、3.39%、6.38%和 4.15%，6 株转基
因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了
3.92%。
研究 FPS对橡胶草的遗传转化，使其在橡胶草植
株中超量表达，进而研究橡胶生物合成的机理及调控
途径，为利用基因工程手段来提高橡胶草橡胶产量奠
定了基础。
4 结论
将获得的 TKFPS转化野生型橡胶草使其在转基
因植株中超量表达，获得产胶能力提高的橡胶草遗
传体系，与野生型相比，转基因株系 FPS的相对表
达量水平明显升高，橡胶含量显著增加。说明 FPS
在橡胶草产胶途径中发挥重要功能，促进了橡胶草
的产胶。

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（责任编辑 李莉）