全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1044−1050 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30370902)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 管荣展, E-mail: guanrzh@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: 2006101086@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-12-07; Accepted(接受日期): 2009-02-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01044
甘蓝型油菜与播娘蒿原生质体融合杂种后代的遗传
忻如颖 管荣展* 张丽君 姜淑慧 张红生 郑 秀
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 甘蓝型油菜(2n=38)与播娘蒿(2n=28)原生质体融合杂种 F1连续自交 3 代, 获得 F2、F3和 F4后代。用细胞学
和 SSR 分子标记方法, 分析杂种后代的染色体数目变异、减数分裂行为以及播娘蒿遗传成分的保留情况。结果表明
在 F2、F3和 F4代中, 根尖细胞染色体平均数分别为 38.47±3.17、37.65±3.23和 36.66±2.95, 随着自交世代增加呈减少
趋势; 在杂种后代减数分裂中, 观察到染色体桥、染色体落后、染色体周期不同步、不均等分离等现象; 杂种后代
F2、F3和 F4代中检测到播娘蒿特征条带的平均频率分别为 9.62%、2.99%和 0.31%, 呈减少趋势。因此要实现播娘蒿
种质向油菜渗入应该重视 F2世代的选择。
关键词: 甘蓝型油菜; 播娘蒿; 融合杂种; 染色体行为; 简单序列重复(SSR)
Genetical Studies on Progenies of Somatic Hybrids between Brassica napus and
Descurainia sophia
XIN Ru-Ying, GUAN Rong-Zhan*, ZHANG Li-Jun, JIANG Shu-Hui, ZHANG Hong-Sheng, and
ZHENG Xiu
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germpalsm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Somatic hybridization is an available way to create new germplasm and enrich breeding materials. Somatic hybridiza-
tion between B. napus and D. sophia has been finished by the authors in 2005. Present research is to continue progeny studies of
the somatic hybrids with the objective of carrying out desirable genes transfer from D. sophia to B. napus. Fertile progenies of the
somatic hybrids between B. napus (2n=38) and D. sophia (2n=28) selfed in three consecutive generations, resulting in F2, F3, and
F4 populations. The number of somatic chromosome, chromosome behavior and genetic components from D. sophia in these
progenies were observed and analyzed by cytological and SSR analyse. The average number of chromosomes in F2, F3, and F4
populations were 38.47±3.17, 37.65±3.23, and 36.66±2.95, respectively, and the maximum number was 56, 50, and 45, respec-
tively, showing that chromosome number tended to reduction with the generation progression. Abnormal chromosome behaviors,
such as chromosome bridges, lagging chromosomes, meiotic cycle asynchrony, chromosome unequal distribution at meiosis stage,
were often observed in the three populations. SSR marker detections with 22 pairs of primers showed that the average frequency
of plants with bands characteristic of D. sophia in the F2, F3, and F4 populations was 9.62%, 2.99%, and 0.31%, respectively.
Therefore, achieving germplasm of D. sophia filter into B. napus should attach importance to select progenies of the somatic hy-
brid in F2 population.
Keywords: Brassica napus; Descurainia sophia; Somatic hybrid; Chromosome behavior; SSR
在油菜遗传改良中, 种内遗传变异已在很大程
度上被充分利用。通过原生质体融合技术实现种间、
属间种质渗入, 是培育高产、优质、抗虫的优良新
品种的一个重要手段[1]。油菜原生质体培养体系研
究取得了重要进展。迄今为止, 芸薹属各物种的多
种外植体分离得到的原生质体培养再生植株已有成
功的研究报道[2]。在此基础上, 原生质体融合研究也
取得了较多成就。通过原生质体融合合成了甘蓝型
油菜(B. napus)、B. naponigra、B. napojuncea、B.
napooleracea、B. napocarinata 等[2-3]新种质(物种),
第 6期 忻如颖等: 甘蓝型油菜与播娘蒿原生质体融合杂种后代的遗传 1045


为油菜育种提供了新的种质资源。芸薹属物种的原
生质体融合及融合后代育种研究的主要目的之一是
将抗病、耐冷、抗线虫、锌积累等有益性状转移到
油菜中, 实现优异种质资源的渗入, 这方面也有许
多研究。通过原生质体融合和后代选择, Hansen等[4]
成功地将白芥抗白菜黑斑病菌基因转移到甘蓝中 ;
Kirti等[5]将抗黑斑病基因从 Trachystoma ballii中转
移到芥菜型油菜; Brewer等[6]将 Thlaspi caerulescens
富集超量锌的特性转移到甘蓝型油菜中 ; Peletier
等[7]获得了抗 triazine的甘蓝型 Ogu cms胞质雄性不
育系; Sigareva等[8]得到了耐寒性好的甘蓝 Ogu cms;
胡琼等[9]获得了甘蓝型油菜品种中双 4 号与新疆野
生油菜野油 18 的对称性体细胞杂种, 再经回交, 创
建了改良的细胞质雄性不育系 Nsa cms。众多研究表
明 , 原生质体融合技术的应用可以在转移抗性性
状、创建新细胞质等方面发挥重要作用。
本实验室也开展了甘蓝型油菜与播娘蒿
(Descurainia sophia)、蔊菜[Rorippa indica (Linn.) Hiern]
属间原生质体融合研究, 获得了融合杂种[10-13], 目前
已经获得一些具有特色的新材料, 如新型细胞质雄
性不育系 NJ65A[14]。本文报道甘蓝型油菜与播娘蒿
原生质体融合杂种自交后代材料的染色体观察结果,
并且利用播娘蒿 EST序列设计 SSR引物, 追踪自交
后代播娘蒿种质的遗传情况, 试图为种质渗入提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2005年, 通过原生质体融合, 获得了甘蓝型油
菜与播娘蒿原生质体融合杂种植株[10]。移至大田后,
由于生长势比较弱, 只做了初步观察[11]。用 11株正
常开花的杂种植株(F1)当年套袋自交得第二代(F2),
依次自交得到 F3、F4。从杂种后代 F2、F3和 F4中均
匀随机抽取种子或植株代表上述 3 个世代, 研究细
胞遗传行为并作 SSR分子标记分析。
1.2 有丝分裂观察
在 F2、F3和 F4中随机抽取种子, 发芽后剪取根
尖, 冰水混合物处理 24 h 后, 用卡诺固定液固定,
改良苯酚品红染色液压片观察。每粒种子观察的有
效细胞数约为 5, F2、F3和 F4群体观察的根尖细胞总
数分别为 203、235和 306个。
1.3 减数分裂观察
在 F2、F3和 F4群体中随机选取幼蕾, 以卡诺固
定液固定后, 剥出花药, 用改良苯酚品红染色液压
片观察染色体减数分裂行为并拍照。每个花药观察
细胞数约为 5, F2、F3和 F4群体观察的花粉母细胞总
数分别为 567、626和 673个。
1.4 SSR分子标记分析
EST 序列来源为 NCBI 上已公布的 403 条播娘
蒿 EST 序列。利用 SSRIT 软件搜索含有 SSR 重复
位点的 EST序列, 用 Primer 5.0软件设计引物(引物
由上海英骏生物公司合成)。设计选定引物的条件是
引物长度范围为 19~21 bp; 退火温度在 50~65℃之
间; 扩增片段长度在 150~350 bp 之间, 最长不超过
500 bp。对 F2、F3和 F4群体随机取样, 用 SDS法提
取 DNA (F2、F3和 F4群体分别提取 96、157和 149
份, 共 402份)用于 SSR标记分析。采用 TD-PCR程
序进行扩增, 扩增产物经 6%非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离, 银染法检测并照相。
2 结果与分析
2.1 杂种后代染色体数目的变化
为调查融合杂种后代的染色体数目, 观察了杂
种后代的根尖有丝分裂中期细胞(图 1), 并对数据

图 1 油菜与播娘蒿杂种后代根尖细胞染色体数
Fig. 1 Chromosome number of root-tip cell in progenies of the somatic hybrid
A~C示根尖细胞染色体数分别为 2n=50、2n=38和 2n=35。
Chromosome number of root-tip cell in A–C was 2n=50, 2n=38, and 2n=35, respectively.
1046 作 物 学 报 第 35卷

进行次数分布分析(图 2)。F2代群体根尖细胞染色体
平均数为 38.47±3.17, 染色体数分布范围为 32~56;
染色体数集中在 36、38 和 39, 分别占 15.27%、
28.57%和 13.30%; 染色体数大于 38 条的细胞占
38.91%, 小于 38 条的占 32.51%。F3代群体根尖染
色体平均数为 37.65±3.23, 染色体数分布范围为
29~50; 染色体数仍集中在 36、38 和 39, 分别为
10.64%、38.72%和 10.21%; 染色体数大于 38 条的
细胞有所减少, 占 26.82%, 小于 38条的占 34.47%。
F4 代群体根尖染色体平均数为 36.66±2.95; 染色体
数分布范围为 28~45; 染色体数集中在 38, 所占比
例为 46.08%; 染色体数大于 38条的细胞占 12.09%,
小于 38条的细胞有所增加, 占 41.84%。以上数据表
明随着世代的增加, 根尖细胞染色体数呈减少趋势;
各个世代仍然存在染色体数目多于甘蓝型油菜染色
体数的个体。


图 2 油菜与播娘蒿融合杂种后代根尖细胞染色体数频率的次数分布
Fig. 2 Frequency distribution of chromosome number in root-tip cells in progenies of the somatic hybrid

2.2 杂种后代的染色体行为
在杂种后代 F2、F3和 F4群体的减数分裂时期,
观察到染色体桥(图 3-F)、染色体落后(图 3-G)、染
色体周期不同步(图 3-E)、不均等分离(图 3-H)等现
象, 统计了这些现象的频率(表 1)。
对 F2群体花粉母细胞减数分裂时期观察表明,

图 3 油菜与播娘蒿融合杂种后代减数分裂期染色体行为观察
Fig. 3 Observations on chromosome behavior at meiosis stages in progenies of the somatic hybrid
A: 中期 I, 箭头指向单价体; B: 中期 I, 箭头指向环状二价体; C: 中期 I, 箭头指向棒状二价体; D: 中期 I, 箭头指向四价体; E: 后期
I, 分裂周期不同步; F: 后期 I, 箭头指向染色体桥; G: 箭头指向落后染色体; H: 后期 I, 染色体不均等分离。
A: metaphase I, arrow indicates the univalent; B: metaphase I, arrow indicates the ring bivalent; C: metaphase I, arrow indicates the bar
bivalent; D: metaphase I, arrow indicates quadrivalent; E: anaphase I, meiotic cycle asynchrony; F: anaphase I, arrow indicates the chromo-
some bridge; G: anaphase I, arrow indicates lagging chromosome; H: anaphase I, chromosome unequal distribution.
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表 1 油菜与播娘蒿融合杂种后代减数分裂期染色体行为
Table 1 Chromosome behaviors at meiosis stages in progenies of somatic hybrid
F2 F3 F4 染色体行为
Chromosome behavior 细胞数
No. of cell
百分比
Percentage (%)
细胞数
No. of cell
百分比
Percentage (%)

细胞数
No. of cell
百分比
Percentage (%)
三价体 Trivalent 13 2.29 9 1.44 7 1.04
四价体 Quadrivalent 19 3.35 15 2.40 6 0.89
落后染色体 Lagging chromosome 185 32.63 167 26.68 86 12.78
染色体桥 Chromosome bridge 228 40.21 143 22.84 125 18.57
染色体不均等分离
Chromosome unequal distribution
249 43.92 188 30.03 79 11.74
分裂周期不同步
Meiotic cycle asynchrony
43 7.58 36 5.75 15 2.23
总和 Total 567 — 626 — 673 —

40.21%的花粉母细胞在后期 I或后期 II出现染色桥;
32.63%的花粉母细胞在后期 I和后期 II中有 1~5条
落后的染色体; 7.58%的细胞存在分裂周期不同步现
象 ; 43.92%的花粉母细胞中有不均等分离的现象 ;
2.29%和 3.35%的细胞分别有三价体和四价体 (图
3-D)。在 F3群体减数分裂时期观察到落后染色体和
染色体桥, 其发生率分别为 26.68%和 22.84%; 在
5.75%的细胞中观察到分裂周期不同步现象 ;
30.03%的细胞有染色体不均等分离现象; 在 1.44%
和 2.40%的细胞中分别观察到三价体和四价体。从
F4 群体中期 I 染色体配对情况来看, 细胞染色体构
型以环状二价体(图 3-B)为主 ; 棒状二价体细胞(图
3-C)较少 , 占 5.20%; 偶尔观察到单价体(图 3-A)、
三价体和四价体(约 5%)。此外 , 分别在 12.78%和
18.57%的细胞中观察到落后染色体和染色体桥 ;
2.23%的细胞中观察到分裂周期不同步现象, 11.74%
的细胞中观察到染色体不均等分离; 这些染色体行
为出现的频率比前两代有所减少。
在杂种后代 F2、F3和 F4群体花粉母细胞中观察
到单价体、多价体等异常现象, 这可能是由于甘蓝
型油菜和播娘蒿亲缘关系较远, 基因组间的染色体
行为和周期不相同, 因而在减数分裂过程中染色体
不正常联会或不均衡联会。
2.3 SSR分子标记分析
利用 SSRIT软件搜索到 102条含有 SSR重复位
点的 EST序列, 占总 EST的 25.31%。用 Primer 5.0
软件设计了 42 对 SSR 引物。用油菜和播娘蒿亲本
DNA 对 42 对播娘蒿核基因组引物进行筛选, 结果
表明有 22对引物能够在双亲间扩增出清晰、明显的
差异带, 多态性引物获取率为 52.38%。这 22对引物
对应的播娘蒿 EST-SSR 类型中, 二核苷酸重复, 共
有 16个, 在全部中的出现频率为 64%; 其次是三核
苷酸重复 , 出现频率为 36%。可见 , 在播娘蒿的
EST-SSR 类型中, 二、三核苷酸重复占主导。这些
引物在两个亲本中共扩增出 69条带, 平均每对引物
扩增出 3.23条带, 其中播娘蒿多态性带有 47条, 多
态性程度达到 68.11%(最低为 28.6%, 最高为
100%)。双亲共有带型较少, 只有 7条, 说明油菜和
播娘蒿亲缘关系较远, 而引物特异性较好。可见, 这
些引物能够鉴别播娘蒿遗传成分的存在。
如引物 DP43 (Sense: 5′-TGTCGTTGCAGCTCC
TCG-3′; Antisense: 5′-GGGCGTTATGCGGTGTTTT-
3′)在播娘蒿中有 4条特征带(图 4), 分别为 230、240、
390和 460 bp; 在甘蓝型油菜中无扩增条带。该引物
从 F2代的 1号杂种株DNA中扩增到 390 bp和 460 bp
两条播娘蒿特征带及 160 bp和 490 bp两条新增带; 2
号杂种株中扩增到 390 bp的播娘蒿特征带, 还得到
170 bp和 260 bp两条新增带; 6号杂种株中扩增到
230 bp和 240 bp两条播娘蒿特征带, 无新增带; 4号
杂种株中没有扩增到播娘蒿特征带, 但有一条 260
bp新增带; 7号和 10号杂种株的扩增条带与播娘蒿
特征带相似 , 但分子质量稍大 , 故也属于新增带 ;
在其余杂种株中没有扩增到任何条带。扩增结果表
明, 1、2、6号杂种株存在播娘蒿遗传成分。引物 DP25
(Sense: 5′-CTTAGGTTAGGAATGGAA-3′; Antisense:
5′-ATGTTGGGAGATTAGGAC-3′)的扩增结果(图 5)
表明, F2代的 3~5号杂种株, F3代的 6号和 8号杂种
株以及 F4代的 10号和 11号杂种株存在播娘蒿遗传
成分。其余的 20对引物在杂种后代群体中扩增, 也
能够鉴定杂种株中是否有播娘蒿遗传成分。
1048 作 物 学 报 第 35卷


图 4 引物 DP43 在亲本和部分杂种后代 F2 中的扩增情况
Fig. 4 Amplification results of parents and part of hybrid progenies with SSR primer DP43
M: DNA标准分子量; 1~12: 杂种后代; 13: 甘蓝型油菜; 14: 播娘蒿。箭头指向播娘蒿特异片段。
M: DNA marker; 1–12: hybrid progenies; 13: B. napus; 14: D. sophia. The arrows indicate specific bands of D. sophia.


图 5 引物 DP25 在亲本和部分杂种后代 F2、F3 和 F4 中的扩增
Fig.5 Amplification result of parents and part of hybrid
progenies with SSR primer DP25
M: DNA标准分子量; 1~5: 杂种后代 F2; 6~8: 杂种后代 F3; 9~11: 杂
种后代 F4; 12: 甘蓝型油菜; 13: 播娘蒿。箭头指向播娘蒿特异片段。
M: DNA marker; 1–5: hybrid progenies F2; 6–8: hybrid progenies
F3; 9–11: hybrid progenies F4; 12: B. napus; 13: D. sophia. The
arrow indicates specific band of D. sophia.
统计了 22 对引物在融合杂种后代 F2、F3和 F4
中扩增的带型情况(表 2)。在 F2代杂种中有 13对引
物扩增到播娘蒿特征带。这些引物共扩增出 56条带,
其中有播娘蒿征带 22 条, 占 39.29%; 新增带为 13
条, 占 23.21%; 缺失播娘蒿特征带为 25条, 占原始
亲本播娘蒿多态性带的 53.19%。在 F3 代杂种中有
11对引物扩增到播娘蒿特征带。这些引物在群体中
共扩增到 52 条带, 其中播娘蒿特征带 18 条, 占
43.90%; 新增带为 11条, 占 28.83%; 缺失播娘蒿特
征带为 29 条 , 占原始亲本播娘蒿多态性带的
34.61%。在 F4代杂种中只有 4对引物扩增到播娘蒿
特征带, 这些引物在群体中共扩增到 19 条带, 其中
有播娘蒿特异性 6 条, 占 31.58%; 新增带为 13 条,
占 68.42%; 缺失播娘蒿特异性带为 41条, 占原始亲
本播娘蒿多态性带的 87.23%。新增带型和缺失带型
产生的原因可能是原生质体融合后, 基因组发生剧
烈的变化。

表 2 22 对引物在融合杂种后代 F2、F3 和 F4 中扩增的带型情况
Table 2 Amplification results of band types in somatic hybrid progenies detected with 22 SSR primer pairs
杂种后代
Hybrid progeny
播娘蒿特征带型
No. of specific bands
of D. sophia
新增带型
No. of novel bands
缺失带型
No. of deleted bands
总带型
No. of total bands
F2 22 13 25 56
F3 18 11 29 52
F4 6 13 41 19

统计了融合杂种后代 F2、F3和 F4中扩增到播娘 蒿特征条带的植株频率(图 6)。结果表明, 杂种后代
第 6期 忻如颖等: 甘蓝型油菜与播娘蒿原生质体融合杂种后代的遗传 1049


F2、F3和 F4代中检测到播娘蒿特征条带的平均频率
分别为 9.62%、2.99%和 0.31%, 能扩增到播娘蒿特
异性片段的植株比例和引物数, 随着世代的增加有
减少的趋势, 至杂种后代 F4, 只有 4 对引物在少数
植株(6株)中扩增到播娘蒿特异性片段。这可能是由
于双亲的亲缘关系较远, 核质之间的相互作用, 使
得播娘蒿遗传物质在杂种胞质环境中难以稳定, 杂
种细胞中的播娘蒿染色体逐代减少。

图 6 融合杂种后代 F2、F3 和 F4 中扩增到播娘蒿特征条带的植
株频率
Fig. 6 Frequency of plants with specific bands of D. sophia in
the F2, F3, and F4 populations detected with SSR primers

3 讨论
播娘蒿具有良好的抗逆性和脂肪酸构成特异等
优点, 利用甘蓝型油菜与播娘蒿原生质体融合杂种
后代, 筛选获得新材料是有意义的。本实验室利用
甘蓝型油菜播娘蒿融合杂种后代的不育株, 回交已
经获得了不育系, 其线粒体 ORF222 基因发生了重
组[14], 本研究进一步利用 SSR 分子标记, 追踪该播
娘蒿融合杂种后代群体, 研究播娘蒿核基因组成分
保留。根据播娘蒿 EST 设计的 42 对引物中, 有 22
对引物能区分这些杂种的双亲, 且引物的特异性和
多态性都比较好, 能够鉴定播娘蒿遗传成分存在与
否, 也为异附加系等的鉴定奠定了基础。在 22对有
多态的引物中, 最多只有 13对引物能在杂种后代扩
增到播娘蒿特征带, 这可能与杂种后代染色体的丢
失有关。由于可利用的引物较少, 在未能检测到播
娘蒿染色体的杂种株中, 不排除存在播娘蒿遗传成
分的可能。杂种后代群体的扩增结果中出现了大量
新增条带和缺失带, 这与 Bhaskar 等[15]在油菜杂种
鉴定中的结果类似, 其原因可能是播娘蒿遗传物质
的进入引起了基因组的变化, 从而发生了染色体重
排或消除, 也可能是原生质体融合造成杂种基因组
DNA 含量和结构改变(染色体缺失、重复和易位),
从而表现为杂种后代扩增谱带的变化。本研究发现,
播娘蒿遗传成分在杂种后代中逐步减少, 因此应该
在融合杂种的早世代通过形态选择、细胞遗传鉴定、
分子标记选择、化学指标选择等方式, 选择具有播
娘蒿染色体或者基因组成分的材料, 开展育种研究
工作。而分子标记辅助选择技术具有有效和简易的
特点, 有助于提高选择效率。
播娘蒿的基因克隆研究表明, 播娘蒿的基因序
列和拟南芥的基因序列相似性很高, 而与油菜的基
因序列相似性相对较低[16], 说明甘蓝型油菜与播娘
蒿染色体组间的亲缘关系较远, 染色体间同源性较
低。甘蓝型油菜与播娘蒿远缘融合杂种 F1生活力弱,
融合杂种后代植株减数分裂过程中, 联会和分离不
规则, 导致部分染色体散落在赤道板外, 形成 1~5
个单价体。后期 I, 这些单价体随机移向两极或不移
动而成为落后染色体; 部分能配对的染色体形成染
色体桥, 染色体桥断裂可能产生重复或缺失染色体;
同时, 配子染色体数随机不等, 从而造成染色体数
目的变异[17]。
杂种后代 F2、F3和 F4代中根尖细胞染色体平均
数分别为 38.47±3.17、37.65±3.23和 36.66±2.95, 随
着自交世代增加呈减少趋势, 这可能是由于播娘蒿
遗传物质与油菜的遗传物质不协调, 或者染色体数
量过多不利于生存, 导致杂种后代染色体逐渐减少,
这一现象与前人报道的关于甘蓝型油菜和诸葛菜融
合杂种后代中出现染色体消除的现象类似[18]。虽然
SSR 分子标记结果只能说明播娘蒿遗传物质减少的
趋势, 但本研究中观察到大量染色体数小于甘蓝型
油菜染色体数(38条)的根尖细胞 , 说明细胞内的播
娘蒿和油菜染色体可能都随机减少, 导致减数分裂
时期同源染色体减少, 染色体不能正常配对。
4 结论
甘蓝型油菜与播娘蒿融合杂种自交后代根尖细
胞染色体数逐代减少。融合杂种后代花粉母细胞减
数分裂期, 出现大量单价体及染色体桥和落后染色
体等现象。具有播娘蒿特异性扩增条带的个体频率
逐代减少, 因此要实现播娘蒿种质向油菜渗入应该
重视 F2世代的选择。
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