全 文 ：盐胁迫是导致主要农作物减产达 50％以上的
最主要的非生物因素之一， 每年导致数亿美元的
损失 [1]。 土壤中大量的盐离子通过影响土壤溶液
的离子毒性、 离子平衡、 产生渗透胁迫 [2-4]， 以及
一些次级胁迫， 如导致作物营养代谢紊乱、 膜解
体、 毒性代谢、 抑制光合作用等， 影响作物的产
量和品质 [5-7]。 与甜土植物相比， 盐生植物在数百
万年的进化中保留了耐盐相关基因， 才能在极端环
境中繁衍生息 [8]， 盐生植物耐盐相关基因的研究有
助于培育耐盐的作物品系。
花花柴（Karelinia caspia（Pall.）Less.）又名胖姑
娘， 是菊科花花柴属多年生草本植物， 为泌盐植
物， 主要分布于内蒙古、 宁夏、 甘肃、 青海及新疆
等地， 一般生长在盐碱地、 盐化沙地上 [9]。 花花柴
长有肉质化叶片及发达的根系， 具有较强的耐盐
碱、 耐干旱、 耐极端温度以及抗虫的能力， 有较高
的研究及应用价值[10]。
水通道蛋白是一类跨膜蛋白[11]， 能进行高效的
水分运输 ， 在许多植物中 ， 甘油 、 尿素 、 NH3、
CO2、 H2O2、 硅、 硼以及砷酸盐等分子都能通过水
通道蛋白被转运 [12-16]， 水通道蛋白在水分平衡中起
着重要作用。 迄今为止， 已从不同植物中克隆了几
热带作物学报 2012， 33（1）： 89-93
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-10-08 修回日期： 2012-01-10
作者简介： 刘 陈（1987 年—）， 男， 在读硕士生。 研究方向： 植物分子遗传学。 *通讯作者： 彭世清， E-mail： shqpeng@163.com。
花花柴 KcPIP2;1基因的克隆及表达分析
刘 陈1，2， 李辉亮 2， 郭 冬 2， 王敏杰 3， 彭世清 2*
1 海南大学农学院， 海南海口 570228
2 中 国 热 带 农 业 科 学 院 热 带 作 物 生 物 研 究 所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室 海南海口 571101
3 湖北省襄阳市襄州区第二高级中学， 湖北襄阳 441111
摘 要 根据一个从差减杂交文库中获得的 EST 序列设计引物， 采用 3′RACE 技术从花花柴（Karelinia caspia）
中克隆了编码质膜内在蛋白的基因 PIP2；1， 命名为 KcPIP2；1， 并运用定量 PCR 技术对 KcPIP2；1 的表达模式进
行分析。 研究结果表明， KcPIP2；1 基因全长 1 095 bp， 包含 855 bp 的开放阅读框， 编码 284 个氨基酸。 Blast 分
析显示， KcPIP2；1与甜叶菊、 毛果杨、 胡桃、 橡胶树和蓖麻的水通道蛋白的同源性分别为 88％、 87％、 87％、
86％和 86％。 多序列比对及进化树分析表明， KcPIP2；1 属于 PIP2 亚家族。 表达分析结果显示； KcPIP2；1 在叶
组织中的表达量最高； 在 NaCl 胁迫下， 2 h 内 KcPIP2；1 的表达量上调至最高水平， 之后逐渐降低， 约 48 h 后
又升至较高水平。 这些结果表明， KcPIP2；1 可能与花花柴耐盐机制相关。
关键词 花花柴; 质膜内在蛋白; 盐胁迫
中图分类号 Q78 文献标识码 A
Isolation and Expression Pattern Analysis
of KcPIP2;1 from Karelinia caspica
LIU Chen1,2, LI Huiliang2, GUO Dong2, WANG Minjie3, PENG Shiqing2
1 College of Agronomy, Hainan University, Haikou, Hainan 570228， China
2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical
Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101， China
3 Xiangzhou No.2 High School， Xiangyang， Hu bei441111， China
Abstract The g ene KcPIP2;1 was isolated from Karelinia caspia by 3′RACE techniques based on the EST
sequence. The full length of KcPIP2;1 was 1095 bp, encoding 284 amino acids. The deduced amino acid
sequence shared 88% , 87% , 87% , 86% and 86% identity with aquaporins from Stevia rebaudiana, Populus
trichocarpa, Juglans regia, Hevea brasiliensis and Ricinus communis, respectively. Phylogenetic analysis revealed
that KcPIP2;1 belonged to PIP2 subfamily. Expression pattern analysis by Real Time PCR showed that the
abundance of KcPIP2;1 in leaves was the higher than root and stem. Under NaCl stress, an up-regulation of
KcPIP2;1 was observed after two hours, and then, the abundance was gradually down, however, it returned high
level at the forty-eighth hour. The KcPIP2;1 may be associated with the salt tolerant mechanism of K. caspia.
Key words Karelinia caspica； PIP； Salt stress
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.01.019
第 33 卷热 带 作 物 学 报
引物 序列
3′RACE GSP1 5′-GTCACCGTCTTGACCGTCATCGGCTAC-3′
表达分析引物
KcPIP-F 5′-AACGAGCTCGCAGATGGTTACAGT-3′
KcPIP-R 5′-GTGGGAATCGCGTGCATTTCTCTT-3′
Actin-F 5′-AGGTCACGACCAGCAAGATCAAGA-3′
Actin-R 5′-TGCTGGATTCTGGAGATGGTGTGT-3′
GSP2 5′-GACCAGTGTGGCGGAGTCGGCATTCTT-3′
表 1 克隆和表达分析引物
十种水通道蛋白 [17-19]， 组成主要内在蛋白 （major
intrinsic protein， MIP）超家族。 MIP 家族分为 7 个
家族 ： 质膜内在蛋白 （plasma membrane intrinsic
protein， PIP）、 液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic
protein， TIP）、 类结瘤素 26 内在蛋白（nodulin 26-
like intrinsic protein， NIP） 、 小内在蛋白 （small
intrinsic protein， SIP）、 类 GlpF 内在蛋白 （GlpF-
like intrinsic protein， GIP） 、 杂 合 内 在 蛋 白
（hybrid intrinsic protein， HIP）和未分类内在蛋白
（uncategorized X intrinsic protein， XIP） [20-22]。 PIP
分为 PIP1 和 PIP2 两个亚家族， 其中 PIP2 具有较
强的水分运输能力 [23]。 近几年研究表明， PIP 还具
有许多其它生理功能， 如营养物质获取、 碳素固
定、 细胞信号传递、 胁迫响应等[24]。
本研究以花花柴为试验材料， 根据从差减杂交
文库中获得的 EST 序列设计引物， 通过 3′RACE
技术克隆了 KcPIP2;1， 并进行相关的生物信息学
分析和表达模式分析， 结果表明 KcPIP2;1 可能与
花花柴耐盐分子机制相关， 为进一步研究花花柴耐
盐分子机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 花花柴种子采自新疆阿拉尔市，
由塔里木大学生命科学学院王彦芹老师馈赠。 种子
经脱绒、 精选后， 0.1％ HgCl2 消毒， 接入 MS 培
养基， 25℃暗培养一周， 之后， 进行 16 h/8 h 光照
培养。 约 2 周后 ， 移栽至 1/2 Hoagland [25]营养液
中， 进行水培。 2~3 周后， 分 2 组进行如下处理：
第一组为对照组， 分别取根、 茎、 叶和全株； 第二
组进行 200 mmol/L NaCl 胁迫处理， 分别在第 1、
2、 4、 8、 12、 24、 48 h 取全株样品； 样品经液氮
速冻， -80 ℃保存或立即研磨后使用。
1.1.2 试剂与菌株 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit， Taq DNA Polymerase为Fermentas公司
产 品 ； SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，
pMDR19-T Simple Vector， SYBR R
Premix Ex TaqTM II为TaKaRa公司
产品； 其他试剂均为国产分析纯；
E.coli DH10B由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 花花柴总 RNA 的提取及
cDNA 第一链的合成 花花柴总
RNA 的提取参照文献 [26]进行 。
cDNA 第 一 链 的 合 成 按 照
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书
进行。
1.2.2 KcPIP2;1全序列的克隆 KcPIP2;1 的 EST
序列已在课题组前期研究中获得， 据此序列设计 2
条嵌套的 3′RACE 引物 （表 1） 。 3′RACE 按照
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 操作手册
进行。 获得的目标片段经 TA 克隆后， 送至北京诺
赛基因组研究中心有限公司测序。
1.2.3 KcPIP2;1的生物信息学分析 测序结果经
DDBJ Vector Screening System 去除载体序列后 ，
使用 CAP3 Sequence Assembly Program 进行拼接，
然后采用 ORF Finder 进行开放阅读框分析 。 取
ORF 部分进行 Blastx 比对分析， 并在 GenBank 中
查询其他物种的 PIP， 进行多序列比对分析并构建
进化树 ， 确定基因命名 。 分别采用 ExPASy、
TMHMM 和 SWISS-MODEL 对 KcPIP2;1进行分析。
1.2.4 NaCl 胁迫处理下 KcPIP2;1 的表达分析 根
据花花柴的 PIP2;1 序列 ， 使用 PrimerQuest 和
Primer-Blast 设计一组定量 PCR 引物（表 1）。 定量
PCR 参照 SYBRR Premix Ex TaqTM II 说明书进行。
2 结果与分析
2.1 KcPIP2;1的克隆与生物信息学分析
在本课题组前期研究中， 已从差减杂交文库中
获得 431 bp 的 EST 序列， 含有 5′非翻译区和部分
的阅读框， Blast分析显示， 该EST编码的氨基酸序
列与蓖麻的 PIP2;2同源性较高。 根据 EST序列设计
两条嵌套的 RACE 引物， 3′RACE 获得约 900 bp 的
片段 。 经测序 、 拼接以及 ORF 分析后 ， 获得
KcPIP2;1全长序列， 共 1 095 bp， 包含 855 bp的开
放阅读框， 编码 284 个氨基酸（图 1）。
Blast分析显示， KcPIP2;1推导得到的氨基酸序
列与甜叶菊（Stevia rebaudiana ABB88840）、毛果杨
（Populus trichocarpa XP_002326182）、 胡桃（Juglans
regia AAO39007）、 橡 胶 树 （Hevea brasiliensis
ACX37450）和蓖麻（Ricinus communis XP_0025195
90- -
第 1 期
KcPIP2；1， 花花柴 PIP2；1(GenBank 登录号 JN206682)； JrPIP2;1， 胡桃 PIP2；1（GenBank 登录号 AAO39007）； JrPIP2；2，
胡桃 PIP2；2（GenBank 登录号 AAO39008）； RcPIP2；2， 蓖麻 PIP2；2 （GenBank 登录号 XP_002519539）； PcPIP2；1， 西洋梨
PIP2； 1（GenBank 登录号 BAB40141）； MpPIP2；3， 含羞草 PIP2；3（GenBank 登录号 BAD90699）； AtPIP1；1， 拟南芥 PIP1；1
（GenBank 登录号 NP_001078323）； RsPIP1；1， 萝卜 PIP1；1（GenBank 登录号 BAA32777）； AtPIP1；2， 拟南芥 PIP1；2 （GenBank
登录号 NP_182120） ； RsPIP1;2， 萝卜 PIP1；2 （GenBank 登录号 BAA92258） ； VvPIP1；2， 葡萄 PIP1；2 （GenBank 登录号
ABN14348）； FePIP1；1， 白蜡树 PIP1；1（GenBank 登录号 AAT74898）
图 2 KcPIP2;1 的进化树分析
39）的水通道蛋白相比 ， 同源性分别为 88％ 、
87％、 87％、 86％和 86％。 KcPIP2；1与胡桃、 蓖
麻、 砂梨（Pyrus communis）、 含羞草（Mimosa pudica）、
拟南芥（Arabidopsis thaliana）、萝卜（Raphanussativus）、
葡萄（Vitis vinifera）和白蜡树（Fraxinus excelsior）的
PIP 进行多序列比对及进化树分析 ， 结果表明 ，
KcPIP2；1与蓖麻和胡桃的同源性最高， 属于 PIP2亚
家族（图 2）。 KcPIP2；1单体分子量为 30.3 ku， 等电点
图 1 KcPIP2;1 核酸及推导的氨基酸序列
刘 陈等： 花花柴 KcPIP2;1基因的克隆及表达分析
KcPIP2；1 (Karelinia caspia, JN206682)
JrPIP2;1 (Juglans regia, AAO39007）
JrPIP2；2 (Juglans regia, AAO39008）
RcPIP2；2 (Ricinus communis, XP_002519539)
PcPIP2；1 (Pyrus communis, BAB40141)
MpPIP2；3 (Mimosa pudica, BAD90699)
AtPIP1；1 (Arabidopsis thaliana, NP_001078323）
RsPIP1；1 （Raphanus sativus, BAA32777）
AtPIP1；2 (Arabidopsis thaliana, NP_182120）
RsPIP1;2 （Raphanus sativus, BAA92258）
VvPIP1；2（Vitis vinifera, ABN14348）
FePIP1；1（Fraxinus excelsior, AAT74898）
91- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
图 3 KcPIP2;1 蛋白的跨膜螺旋结构预测分析
为 6.88， 有 6 个跨膜螺旋结构（图3）， 符合 MIP 家
族共有特征[27-28]， 高级结构为四聚体。
2.2 KcPIP2;1的表达
定量 PCR 分析结果表明， 在正常生长情况下
叶组织中 KcPIP2;1 表达量最高， 根中的表达量次
之， 茎中的表达量最低（图 4A）。 NaCl 胁迫处理约
0.5 h 后， 花花柴发生萎蔫， 约 12~24 h 后逐渐恢
复正常形态， 约48 h后恢复正常生长， 能观察到营
养液水位下降。 KcPIP2;1 的表达量在 NaCl 胁迫后
2 h 上调至最高水平， 之后， 逐渐降低， 12~24 h
时， 恢复至接近对照水平， 但在 48 h 时又回到较
高水平（图 4B）。
3 讨论与结论
水分平衡对于植物的生长、 繁殖起着至关重要
的作用。 干旱、 半干旱以及盐碱化地区的植物， 其
整个生命周期内都面临着严峻的水分平衡的挑战，
盐胁迫和干旱都会导致其缺水， 较强的水分运输和
平衡能力是盐生植物最基本的生存能力之一。 植物
中， 不同组织器官在不同情况下， 各种水通道蛋白
具有不同的表达丰度， 分别起着不同的生理功能，
例如， 在盐胁迫下， 部分水通道蛋白表达量上调，
有的则下调 [29]， 鉴别不同水通道蛋白的功能， 能更
好的阐明植物中此类蛋白的分子作用机制。
PIP 在爪蟾卵母细胞中表达时发现， PIP1 不具
有水通道蛋白功能 [23]。 在源于萝卜的 PIP1;1 和
PIP2;1转化桉树的研究中发现， RsPIP2;1 转化株系
比 RsPIP1;1 的拥有更高的光合作用活性和生长速
率[11]。 然而， Horie[22]等的最新研究结果发现： 在爪
蟾卵母细胞中单独表达 PIP1， 检测不到水分运输
活性， 但当 PIP1 和 PIP2 共表达时， 检测到较单独
表达 PIP2 时更强的水分运输活性 。 Horie 认为 ，
PIP1 与 PIP2 发生异聚化后具有更强的水分运输能
力。 因此， 在应用 PIP等水通道蛋白时， 基因材料
的选择十分重要， 相关 MIP 家族基因功能方面的
基础研究需提前进行。
10
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0
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A. KcPIP2；1在不同组织中的表达； B. NaCl 胁迫处理后， KcPIP2；1表达模式分析。
图 4 KcPIP2；1的表达模式分析
Stem Root Leaf CK 1 2 4 8 12 24 48
A B
时间/h
92- -
第 1 期
本研究从盐生植物花花柴中克隆了 PIP2。 表
达分析结果表明， KcPIP2;1 在叶组织中表达量最
高， 这与蒸腾作用时水势梯度递减趋势相符， 即水
势顺着根、 茎、 叶依次递减， 可能与 PIP2 亚家族
蛋白具有较强的水分运输能力有关。 根据 NaCl 胁
迫处理花花柴后的现象及表达分析结果推断， NaCl
胁迫处理后花花柴失水萎蔫， 叶片气孔关闭， 蒸腾
作用停止， 花花柴通过启动一系列盐胁迫响应机制
来适应环境的改变， 处理 2 h 后， KcPIP2;1 的表达
量上调至最高水平， 增强根系从含盐的营养液中吸
水的能力； 处理 12~24 h 后， 花花柴逐渐适应了高
盐环境， 逐渐恢复正常形态， 细胞液与营养液渗透
压的差值逐渐缩小， KcPIP2;1 的表达量逐渐降低；
48 h时， 花花柴完全适应了高盐环境， 能进行正常
的生命活动， 气孔张开， 此时， 需从低渗的营养液
中吸收大量的水用于蒸腾作用， KcPIP2;1 表达量
再次上调。 NaCl 胁迫处理后正常生长的花花柴与
对照组相比较 ， KcPIP2;1 的表达量上调 ， 表明
KcPIP2;1 可能与花花柴耐盐机制相关， 但 KcPIP2;
1 的水分运输特性以及表达调控模式等方面需更进
一步的研究。
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责任编辑： 高 静
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