全 文 ：植物生理学通讯 第4 3 卷 第3 期 , 2 00 7 年 6 月
花花柴 N a门压+ 反向运输载体的表达和抗血清制备
郑耀虎 , 张霞 , 张富春 ’ , 曾幼玲
新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 , 新疆生物资源基因工程重点实验室 , 乌鲁木齐 8 3 0 0 4 6
T h e G e n e E x P r e s s i o n o f aK
r e il n ia c a sP i
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+月匡+ A n t iP o r t e r a n d
P r e P a r a t i o n o f I t s A n t i s e r u m
z H E N G aY
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,
z H A N G x i a
,
z H A N G F u
一
C h u n
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z E N G oY
u 一L i n g
尤即 aL b o ra t o 尽 of M口 le e u l a r B i o lo gy, oC ll e g e of L诉 S e i e n c e a n d eT e h n o lo g y, iX nj ia n g nU i v e sr i yt, iX可 i a n g K e夕 L a b o r a t o尽
of B i
o lO g i e a l R e s o u cr e s a n d G e n e t ie nE g i
n e e r i
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, 口厂“ m q i 8 3O04 阮 hC i n a
提要 : 文章建立 了检测耐盐植物功能基因抗体制备和蛋白表达的方法 。
关键词 : 花花柴 ; N +a H/ 十反向运输载体 ; 原核表达 ; 尾静脉大容量快速注射法 ; 抗血清
在我们实验室克隆到花花柴液泡膜 N +a 爪十 反
向运输载体 1 基因 cK n瓜 1 (注册号 D Q 3 0 3 23 1 )( 张
霞等 2 0 0 6) 的工作基础上 , 为了探讨 N +a / H 十 反向
运输载体的表达情况并获得 K c N H X I 的抗体 , 本
文又将 K c N H X I C 端的 94 个氨基酸的编码序列克
隆到原核表达载体 , 并将 cK n hx l 全编码序列克隆
到真核表达载体 , 分别构建了 pM AL
一
p Z x
一
cK
n瓜 1 -
e 2 8 5 和 P e D N A 3 . 1一 cK n h x l 。 用大肠杆菌 B L Z I 表
达系统促使 p M A L 一 p xZ 一cK n瓜 1一 c 2 85 表达并纯化融
合蛋白M B P 一 K c N H X I一 C 9 4 ; 用尾静脉大容量快速
注射法 (h y d r o d y n a m i c s 一b a s e d t r a n s er e t i o n m e th o d ,
H D 法 )将 cP D N A 3 . 1一 cK o hxl 导入小鼠的肝细胞让
其表达 ( iL u 等 19 9 ) 。 以 pe D N A 3 . l 一cK n瓜了核酸免
疫小鼠 , 激发免疫反应后 , 再用 M B P 一 K c N H X I -
C 9 4 加 强免疫 , 制得效价高 、 特 异性好 的抗
K o N H X I 抗体 , 建立 了耐盐植物的功能基因制备
抗体和检测表达蛋 白的方法 。
材料与方法
1 材料
基因 cK n瓜 1 由本实验室克隆 。 引物合成由北
京奥科生物技术有限公司完成 。 昆明白小鼠购自
新疆医科大学实验动物 中心 。 T aq 酶 、 T 、 D N A 连
接酶 、 限制性 内切酶及 D N A 分子量标准 , 均为
大连宝生物工程公司产 品 。 D N A 片段回收试剂盒
及羊抗鼠 gI G 一H P R 为北京 IT A N G E N 公司产品 。 直
链淀粉琼脂糖凝胶树脂购 自美国 N E B 公司 。 质粒
cP D N A 3
.
1和 pM A L一p Z x 及大肠杆菌 B L ZI 由本实验
室保 存 。
2 重组质粒表达载体的构建
以含有花花柴 [而 er l in i a e a 印 ie a (p a l l . ) L e s s · ]
N +a 爪 + 反向运输载体基因开放阅读框 (叩 en er 耐 ign
斤 a m e , o R F )的质粒 p Y E S 一价 n h x l 为模板 , 用弓I
物 5 ’ G C G G G A T C C T T A C T A C C T C A C T C A G A A G
3
,和夕 G C C G A A TT C T C A A T G G A T C A C A T C C A T G T
3
`
(分别带有 B a m H I和 E co R I 的酶切位点 )扩增出
K c n h x l 末端从 1 3 3 5一 1 6 2 0 b p 的片段 K c n h x l -
e 2 8 5
, 回收后用 B a m H I和 cE o R I双酶切 , 与带此
2 种勃性末端的原核表达载体 pM A L 一 p xZ 连接 。 用
KP ln 和 E co R I 直接酶切 p Y E S 一cK n hx l , 回收目的
片段 K 。 。 hxl , 与真核表达载体 cP D N A 3 . 1 连接 。
将连接产物分别转化大肠杆菌 B L 2 1和 D H 5 a , 在
含有 10 0 m g’ L 一 ’ 氨节青霉素的 L B 平板上筛选阳性
重 组子并进行酶切鉴 定 。
3 目的片段 cK n hx l 一 c 2 8 5 的原核表达
挑取含有质粒 pM AL
一
p xZ
一
cK
n瓜1 一 c 2 8 5 的大肠
杆菌 B L ZI 单菌落 , 3 7 ℃ 培养过夜后 , 按 l% 的
收稿 2 0 0 7 一 0 1一 2 6 修定 2 0 0 7 一0 5 一 2 2
资助 国 家自然科学基金 ( 3 0 4 6 0 0 1 5 ) 、 教 育部科学技术研
究重点项 目 ( 2 0 5 1 7 8 )和新疆高校 创新研究群体基金
( X J E D U 2 0 0 4 G 0 2 )
。
通 讯作者 ( E 一 m a i l : z f e x z u @ x j u . e d u . e n ; T e l : 0 9 9 1 -
8 5 8 3 5 1 7 )
。
DOI : 10. 13592 /j . cnki . ppj . 2007. 03. 015
植物生理学通讯 第 3 4卷 第 3期 , 20 07 年 6 月
C 9 4 用间接酶联免疫吸附测定 ( e n z y m e 一 l i n k e d
im m
u n o s o r b e n t a s s a y
,
E L I s A )法检测血清中的抗
体水平 。 将产生 了抗体的小鼠用融合蛋白加强免
疫 。 加强免疫的过程为 : 用等体积弗 氏佐剂将
M B P
一
K e N H X I
一
C 9 4 完全乳化皮下多点注射免疫 ,
每只小鼠的注射剂量为 3 0 林g , 每 2 周免疫 1 次 ,
共免疫 3 次 , 第 1 次免疫抗原用弗氏完全佐剂乳
化 , 后 2 次用弗氏非完全佐剂 。 第 3 次免疫后 2
周 , 摘取眼球放血 , 分离血清 , 于 一 20 ℃下冻存 。
7 抗 cK N H X I 抗体特性鉴定
效价检测采用间接 E IL S A 法 , 特异性鉴定采
用 W es t e m bl ot 分析 。 用尾静脉大容量快速注射
法将 p e D N A 3 . l 和 p c D N A 3 . l 一cK n hx l 两种质粒转入
小鼠体内。 s h 后取肝脏 , 置于液氮中充分研磨 ,
悬浮于 3 倍体积的 P B S 中 , 加入 1巧 体积的 s x 终
止缓冲液 ( 2 0% 甘油 、 10 % s n s 、 2 50 m m o l · mL
一 ’
T r i s
一
H C I
,
p H 6
.
7 )混匀后于冰浴中 , 2 5 0 W 超声
5 m i n
。
s 0 0 0 x g 离心 5 m i n 后 , 取上清液 , 加
入 5% p一 琉基 乙醇和微量嗅酚蓝 , 于沸水浴中作
用 1 0 m i n 后 , 上样进行 W e s t e r n b l o t 分析 。 一
抗用抗 M B P一cK N H X I 一C 94 的小鼠血清 , 二抗用羊
抗鼠 I g G 一 H P R 。
实验结果
1 重组质粒的酶切鉴定
用 B a m H I 和 石 e o IR 酶切 pM A L 一 p Z x 一cK n h x l -
e 2 8 5
,
KP
n l 和 cE o IR 酶切 p e D N A 3 . 1一cK n瓜1 。 琼
脂糖凝胶电泳结果显示 , 前者切出一条 2 85 b p 的
片段 (图 l) , 后者切 出一条 1 6 2 0 b p 的片段 (图 2) ,
2 8 5 b P
nU门ù八钊们门卜钊钊ùU几nU05一b八UóU01勺2月`比J,目.且
比例接种于 6 m L 的含有 5 0 林g’ m L 一 ’ 氨节青霉素的
L B 培养基中 , 3 7 ℃下震荡培养 , 当菌液的吸光
度 o D 60 o 达到 0 . 5司 . 7 时 , 加异丙基 一 p一 D 一 硫代半
乳糖昔 ( IP T G )至终浓度 0 . 5 m ol · L 一 ’ , 继续培养 4
h ; 与此同时 , 保留一份不加 I P T G 诱导的阴性
对照 。 诱导结束后 , 取 1 . 5 m L 菌液 , 离心得细
菌沉淀 。 将沉淀用磷酸缓冲液 (P B )S 洗涤后再悬浮
于 4 0 匹 的 BP S 中 , 加等体积的 Z x S D S 一以GE 上
样缓冲液 ( 0 . 2 m o l · L 一 , p一 琉基乙醇 、 4% S D S 、 20%
甘油 、 0 . 2% 嗅酚蓝 、 0 . 1 m o l · L 一 ’ T r i s 一 H e l , p H
6
.
8) 混匀后 , 沸水浴中作用 10 m in 后置于冰浴中
冷却 , 4 oC 下以 1 2 o o o x g 离心 1 0 m i n , 取上清
液进行 S D S . P A G E 分析 ; 同时处理诱导和未诱导
的含有质粒 p M A L 一p xZ 的大肠杆菌 B L ZI 作对照 。
4 融合蛋白 M B P 一cK N H X 卜C 94 的纯化
将经鉴定能够诱导出融合蛋白M B P一cK N H X I -
C 9 4 的菌落按上述条件大量 (5 0 0 m )L 扩繁并诱导
后 , 于 4 oC 下以 8 0 0 0 x g 离心 5 m i n , 取沉淀悬
浮于过柱缓冲液 ( 2 0 m m o l · L 一 ` T r i s 一 H C I 、 2 0 0
uon
l
·
L ” N aC I
、
1
uon
l
·
L
一
, 乙二胺四乙酸 , pH 7 . 4 )
中 , 于冰浴中超声波 ( 1 8 0 w )破碎细胞 。 再于 4 ℃
下以 12 0 0 0 x g 离心 一5 m i n , 取上清液过直链淀粉
琼脂糖凝胶亲和层析柱 (柱长 1 . 5 c m , 柱径 0 . 8
c m )
, 具体步骤参照 N E B 公司说明书进行 。
5 目的基因在小鼠肝细胞中瞬时表达的检测
将构建好的质粒 ep D N A 3 . 1一cK n瓜1 提取并纯
化 , 用 0 . 9% 生理盐水制备成 1 2 . 5 林g’ m L 一 ’ 的溶
液 。 用注射器将 2 m L 溶液在 5 ~ 8 5 的时间里从
小鼠的尾静脉全部推入小 鼠的体内 。 s h 后 , 将
小 鼠处死 , 提取肝脏的总 R N A 。 以总 R N A 为模
板 , 以特异性引物 p l ( 5 ’ T A e A G T A o T o o T -
G T T T C A T C C T 3
’
)和 PZ (5 , C T T T A T G T T G G T A T G -
G A C T C A 3
’
)进行 R T 一P C R 检测 。
6 抗 K c N H X I 抗体的制备
将纯化的质粒 ep D N A 3 . 1一孟全”瓜 1用生理盐水
稀释至 1 林.g m L 一 , 。 取四周龄雌性昆明白小鼠随机
分为 2 组 (每组 8只 ) : 第一组 以 ep D N A 3 . 1免疫 ;
第二组以 cP D N A 3 . 1一 cK n hx 了。 采用后肢内侧肌肉
三点注射法给小鼠注射 10 匹质粒溶液 (每次注射
前 2 4 h 同位点注射 10 0 林g 的盐酸普鲁卡因 ) , 每
2 周免疫 1 次 。 每次免疫前从眼眶小量采血 , 分
离血清 。 免疫 3 次后 , 取纯化的 M B P 一K c N H X I -
图 1 pM A L一 p Zx 一 cK n hx l 一c 28 5 的酶切鉴定
l
:
D L 1 5 0 0 o + 2 0 0 0 分子量标准 ; 2 : p M A L 一 p Z x 一 K e n 入x z -
e 2 8 5 以 B a m H I 和 E c o R I 双酶切 。
5 2 6 植物生理学通讯 第 4 3卷 第 3期 , 20 07 年 6 月
k D a
, 是融合蛋白 M B P一 p一 半乳糖普酶 一 a 片段 ,
为 m al E 和 al c Z a 融合表达产物 。 由于蛋白M B P -
cK N HX I
一
C 94 的 N 端带有 M B P (分子量为 4 2 kD a ) ,
故能用带有麦芽糖的直链淀粉琼脂糖凝胶树脂亲和
层析柱纯化 。 纯化后的蛋白经 S D S 一 P A G E 分析
后 , 其纯度达 9 5 % 以上 (图 4) 。 经定量测定 , 纯
化蛋白的浓度为 1 . 1 m g’ m L 一 ’ 。
图 2 p c D N A 3 . l 一cK n hx l 的酶切鉴定
z
:
o L 1 5 0 0 o + 2 0 0 0 分子量标准 ; 2 : p e o N A 3 . 1 一尤 c n 入x z
以 KP n l 和 石 e o R I 双酶切 。
均与预计 的大小相一致 。 其中 cK n hxl 一 c 2 85 连接
在 m al E (编码麦芽糖结合蛋白 M B )P 的 3 ’ 端 ,
人七刀瓜 I的O RF 直接插入在真核表达载体 C M V 启动
子之 后 。
2 目的蛋白的诱导表达及纯化
将含有重组子 pMAL 一 pxZ 一cK n瓜 I 一c2 85 的大肠杆菌 B L 2 1 诱导表达后 , 进行 S D S 一 P A G E 分析 ,
发现在分子量为 52 kD a 处有一条带 , 即为融合蛋
白M B p 一K c N H x l 一C 9 4 所显示的带 (图 3第 4 泳道 ) 。
图 3 中第 1泳道和第 2 泳道的差异带大小为 5 0 . 8
图 4 融合蛋白 M B P一cK N H X I 一C 9 4 纯化的 S D S 一 P A G E 检测
卜 蛋白质分子量标准 : 2 : 含有 pM A L 一 p Z x 一 K cn h xl 一 c 28 5
的大肠杆菌 B L 2 1经 I P T G 诱导 , 超声波破碎 , 离心所得上清
液 ; 3 : 含有 pM ^ L 一 p Z x 一 尤 e n h x z 一 。 2 5 5 的大肠杆菌 B L Z I 经
I P T G 诱导 , 超 声波破碎 , 离心所得的沉淀 : 4 : 纯化的融
合蛋白 M B P 一 K e N H X I 一C 9 4 。
3 目的基因在小鼠肝细胞中瞬时表达
特异性引物扩增的区域为 cK n瓜 I 的 5 1 ~9 7
b p
, 共 4 6 6 b p 。 如图 5 所示 , 将转染过 p c D N A 3 . l -
图 3 融合蛋白 M B P ~ K c N H X I 一 C 9 4 表达的 S D S 一 P A G E 检测
1
: 未经 IP T G 诱导的含有 p M A L 一 ZP x 的大肠杆菌 B L ZI 的
总蛋白 ; 2 : 经 IP T G 诱导的含有 p M A L 一 p Z x 的大肠杆菌 B L 21
的总蛋 白 : 3 : 蛋 白质分子量标准 ; 4 : 经 I P T G 诱导的含有
p M A L
一
p Z x
一尤 e n 人x 了一 e 2 8 5 的大肠杆菌 B L 2 1 的总蛋白 : 5 : 未
经 I p T e 诱导的含有 pM ^ L 一 p Z x 一价 n 人x 了一 e Z s s 的大肠杆菌 B L Z I
的总 蛋白 。
图 5 p c D N A 3 . 1一 cK n hx l 在小鼠肝细胞中瞬时表达的检测
l
:
D L 1 5 0 0 0 + 2 0 0 0 分子量标准 : 2 : P C R 阴性对照 ;
3
:
R T
一
P e R 阴性对照 ; 4 : 提取转染过 p e o N A 3 . l 一尤 e n 儿x z 的
肝脏的总 R N A 后 , 用 R T 一 P C R 检测的结果 。
植物生理学通讯 第 4 3卷 第 3期 , 2 007 年 6 月
cK
n瓜 I 的肝脏的总 RN A 反转录成 c D N A , 再用特
异性引物进行 P C R , 得到一条 4 6 6 b p 的特异性条
带 。 以总 R N A 为模板直接进行 P C R , 没有扩增
出条带 (图 5) 。 说明用 DH 法将 ep D N A 3
.
1水七川众 I 转
入小鼠肝细胞后 , 外源基因能在小鼠体内转录 。
4 鼠抗 K c N HX I 抗体效价的测定
以纯化的 M B P一 K e N H X I 一C 9 4 作抗原 , 间接
队 Is A 法检测 p e D N A 3 . l 和 p e D N A 3 . l 一cK n放 1两种
质粒每次免疫昆明白小鼠后的血清 (稀释 10 0 倍 ) 。
如图 6 所示 , 核酸免疫 3 次后 , 实验组产生 了抗
K c N H X I 的抗体 , 而未经免疫的没有 ; 蛋白加强
免疫后 , 实验组小鼠的血清中抗体急剧增加 , 远
高于未经免疫的 。 说明核酸免疫时 , cP D N A 3 . 1 -
cK
n
hx 了在实验组小鼠肌肉细胞中表达 , 小鼠免疫
系统产生了针对 K c N H X I 记忆细胞 , 再用蛋白加
强免疫 , 相应的抗体水平即增加 。 测定抗血清效
价约为 l : 3 2 0 0 0 。
图 7 小鼠肝细胞表达的 cK N H X I 的 W es et m b lot 分析
1
: 蛋白质分子量标准 ; :2 被质粒 p c D N A 3 . 1转染的小
鼠肝脏处理液 ; 3 : 被质粒 cP D N A 3 . 1 一 K o n h xl 转染的小 鼠肝
脏处 理液 。
图 6 昆明白小鼠中 cK N H X I 抗体水平的检测
5 小鼠肝细胞表达 cK n h x l 的 W e s t e r n b l o t 分析
将分别用 cP D N A 3 . 1和 ep D N A 3 . 1店七九瓜 I两种
质粒转染的小鼠肝脏处理后 , 用所得的抗血清对
其进行 W es et rn bl ot 检测 的结果表明 , 后者在分
子量 6 0切 a 处出现一条特异性条带 , 前者没有 (图
7)
, 说明 cP D N A 3 . 1一 cK n h xl 转入小鼠肝细胞后 ,
cK
n瓜1 能够在肝细胞中表达 , 所制备的 cK n放1抗
血清中含有抗 K c N H X I 的特异性抗体 。
讨 论
花花柴 N a 十 /H + 反向运输载体蛋白共 539 个氨
基酸 , 1 0 个跨膜区 , 位于液泡膜上 。 与其他植
物的 N +a 肚 ` 反向运输载体蛋 白相 同 , 在花花柴耐
盐生 理过程中起作用 。 但作为一种代谢调控蛋
白 , 直接分离和纯化非常困难 , 要制备抗原只能
用基因工程表达的手段 。 用 D N A M A N 软件对该蛋
白的特性进行预测 , 其 C 端 1 0 0 个残基有 5 个预
测的抗原肤 , 亲水性较强且位于膜外 。 从理论上
讲 , 此段有较好的抗原性和特异性 , 因此选择它
通过原核表达可以获得特异性的抗原 。 H田旧 a d a 等
(2 0 1) 在制备滨黎 N a + lH 十反向运输载体蛋白多抗血
清时也曾做了类似的选择 。
本文制备抗血清采用的是核酸免疫的方法 。
核酸免疫既能激起体液免疫应答 , 又能激起细胞
免疫应答 。 目的基因在小鼠肌肉细胞中表达后 ,
产生的蛋白会被蛋白酶体降解成小分子的抗原肤 ,
抗原肤与 M H C 一 I分子在细胞表面形成复合物递呈
给 C D +S T 细胞识别 , 从而刺激多个 B 淋巴细胞分
化并产生免疫记忆 (H a be l 等 2 0 0 0 ) 。 用核酸免疫的
方法制备抗体的例子 己有报道 (胡太蛟等 2 0 0 6 ) 。
核酸免疫抗体滴度往往不理想 , 因为单纯的核酸
免疫产生的抗体水平很低 。 为了改变这种境况 ,
提高抗体滴度 , 很多增强核酸免疫的策略被相继
提出 , 其中 “ D N A 初始免疫 一 蛋白刺激加强 ” 的
策略就是其中的一种 (R a m s ay 等 19 99) 。 本文用原
核表达的蛋白加强免疫 , 抗体水平明显增加 , 这
种增加不仅是量的增加 , 更是质的差异 。 核酸免
疫产生抗体中 gI G 很少 , 它主要是 T 辅助细胞刺
激 B 细胞活化的过程 ; 蛋 白加强免疫产生大量抗
体是由于特异性抗原刺激记忆细胞所致 。 传统的
植物生理学通讯 第 43 卷第 3期 , 2 00 7 年 6 月
制备抗血清的方法采用蛋白抗原或多肤抗原免疫的
方法 , 但首要条件是制备比较纯的抗原 , 而蛋白
或多肤的提取和纯化是相当烦琐和 困难的 。 即使
将本研究中己经得到的纯融合蛋白酶切 , 分离
K c N H X I
一
C 9 4 成本也会大大增高 , 而且产率很
低 。 所以 , 本文借鉴核酸免疫的思路来制备抗
体 , 减少 了一些烦琐的过程 , 节 约 了成本 。
本文对 K c n h x l 进行真核表达所用的方法是
H D 法 。 此法是在小鼠尾静脉快速注射大容量的质
粒溶液 (约占小鼠体重的 8% 一 10 % ) , 要求快速的
注射时间为 5一 8 5 , 这样就能够使肝门静脉产生高
压 , 导致肝窦的孔径增大 , 肝细胞膜产生瞬时穿
孔 , 通透性增加 , 所以外源质粒就被压入肝细胞
(Z h a n g 等 2 0 0 4 ) 。 金振晓等 (2 0 0 2 )将带有人甘露糖
结合凝集素的真核表达载体 cP D N A 3一对召L 用此法
导入小鼠肝脏 , s h 后在血清中检测到人甘露糖结
合凝集素 。 贺晨霞等 ( 2 0 0 3) 也用 同样的方法表达
过人凝血 因子 I X 。 用此法进行的研究很多 , 但
表达植物基因尚未见报道 。 本文对 cK n瓜 I 进行了
真核表达 , 目的在于检测真核表达载体 pe D N A 3 . 1-
cK
n放1 能否在小鼠的体内表达 , 进而确立其作为
核酸免疫的可行性 , 结果证 明真核表 达载体
p c D N A 3
.
1
一
K o n h x l 能够在小鼠的肝细胞中表达 ,
这对核酸免疫生产抗血清是一个验证 。 而传统的
方法是将真核表达载体在体外转染 H el a 细胞后进
行检测 (J in 等 2 0 0 4) , 这就需要在体外培养细胞 ,
还要用脂质体介导 。 两者 相 比 , 检测的效果相
当 , 而前者技术难度小 , 实验周期短 , 消耗经
费少 , 这 一点体现出很大的优越性 。 此外 , 表
达 出完整的 K c N H X I , 可 以用作抗原检测所制备
的抗体 。 本文用 原核表达的抗原制备获得的抗
体 , 能够与真核表达的 K c N H X I 特异性结合 , 说
明所获抗体具有特异性 。 如果用天然的蛋白作抗
原检测 , 其效果虽然好 , 但由于植物液泡膜蛋 白
占细胞总蛋白的比例很小 , 分离起来很困难 。 因
此用真核表达的 K c N H X I 与天然的 K c N H X I 蛋白
具有相同的抗原决定簇的特性 , 以之作功能蛋白
的表达检测具有其明显的优越性 。 因此 , 本文所
建立的特异性的 K c N H X I 抗体制备和蛋白表达检
测的新方法 , 为研究盐生植物功能蛋白抗体制备
提供了技术基础 , 同时对研究 cK hn xl 钠离子区隔
化的生理过程中的基因表达定位定量可能也有意
义 。
参考文献
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G a u d u in M C
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H u r t r e l B
,
G u i l l e t J G e t a l (2 0 0 0 )
.
D N A v a e e i n e P r o t e c t i o n a g a in s t e h a ll e n g e w i th s i m i a n /h u
-
m a n i m m u n o d e if e ie n e y v i r u s 8 9
.
6 i n r h e s u s m a e a q u e s
.
D e v
B 10 1
,
10 4 ( 6 ) : 1 0 1~ 1 0 5
H a m a d a A
,
S h o n o M
,
X ia T
,
O h t a M
,
H a y a s h i Y
,
T a n 盖互k a 气,
H a y a k a w a T ( 2 0 0 1 )
.
I s o l a t io n a n d e h a r a e t e r i z a t i o n o f a
N a
+
/H
+ a n t i P o r t e r g e n e f r o m th e h a lo Ph y t e A r r iP l
e x g m e li , , 1
.
P l a n t M o l B i o l
,
4 6 : 3 5~4 2
J in HL
,
L i Y J
,
M a Z H
,
Z h a n g F C
,
X i e QG
,
G u D F
,
W
a n g B `2 0 0 4 )
.
E fe
e t o f e h e m i
e a l a dj
u v a n t s o n D N A v a e e i n a t i o n
.
V ;、 e e in e ,
2 2 : 2 9 2 5 ~ 2 9 3 5
L iu F
,
S o n g Y K
,
L i u D ( 19 9 9 )
.
Hy d r o d y n am i e s
一
b a s e d t r a n s fe e
-
t io n i n a n im a ls b y s y s t e m i e a d m in i s t r a t i o n o f P la s m id D N A
.
G e n e T h e r
,
6 : 12 5 8 ~ 1 2 6 6
R a m s a y A J
,
K e n t S J
,
S t r u g n e l l R A
,
S u h r b i e r A
,
T h o m s 〕` n S A ,
R a m s h a w I A ( 1 9 9 9 )
.
G e n e t i e v a e e in a t io n s t r a t e g i e s fo
r e n
-
h a n e e d e e l l u la r
,
h u m o r a l a n d m u e o s a l i m m u n i ty
.
Im m u n o l
R e v
,
17 1 ( 2 ) : 2 7一4 4
S h i HZ
,
Z h u K ( 2 0 0 2 )
.
R e g u la t i o n o f e x P r e s s i o n o f th e v ; , c u o la r
N +a H/
+ a n t i P o rt e r g e n e A tN月X l b y s al t s etr s s an d a b s e i s ic a e id
P la n t M o l B i o l
,
5 0 : 5 4 3 ~ 5 5 0
hZ
a n g G
,
G a o X
,
S o n g Y K
,
V o l lm e r R
,
S t o lz D B
,
G a s io r o w s k i J Z
,
D e a n D A
,
L i u D ( 2 0 0 4 )
.
H y d r o P o r a t i o n a s th e m e e h a n i s m
o f h y d r o d y n a m i e d e l iv e r y
.
G e n e T h e r
,
1 1: 6 7 5一6 8 2