全 文 ：细叶亚菊乙醇提取物体外抗氧化活性研究
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朱卫东１　浦俊燕１　钟扬１，２＊＊
（１．西藏大学生命科学系与生物多样性研究所，西藏　拉萨　８５００００；
２．复旦大学生命科学学院进化与生态学系，上海　２００４３３）
摘　要：对细叶亚菊全草７５％乙醇提取物进行了总酚总黄酮含量测定并系统的检测其体外抗氧化活
性。结果显示，细叶亚菊乙醇提取物所含总酚含量为３２．７±２．０μｇ／ｍｌ，总黄酮含量为１４．１９±１．２９μｇ／
ｍｌ．实验结果显示ＤＰＰＨ的ＩＣ５０值为２５３．１６μｇ／ｍｌ，ＡＢＴＳ的ＩＣ５０值为３４．４μｇ／ｍｌ．抑制脂质过氧化实
验结果显示浓度０．４ｍｇ／ｍｌ的细叶亚菊乙醇提取物的脂质过氧化抑制率为２９．２１％表现良好的抗氧化
生物活性。细叶亚菊抗氧化活性为传统药理作用和其开发成新药物提供了基础数据。
关键词：西藏　细叶亚菊　总酚　总黄酮　抗氧化活性
　　细叶亚菊Ａｊａｎｉａ　ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ（Ｊａｃｑ．）Ｔｚｖｅｌ多年生
草本，产甘肃中部、四川西北部、西藏东部及青海，印度
西北部也有分布［１］。细叶亚菊藏语为“坎巴嘎保”、“普
芒嘎布”，茎枝治痈疖、肾病、肺病、咽喉病、溃疡、炭疽
病［２，３］。该属中的许多植物在民间作为传统中药，有
祛风镇静、清热解毒、清肺止咳、消肿止血，消炎止痒，
驱蚊杀虫等功效，可用于小儿惊风、咽喉肿痛、头昏头
痛、虫病、溃疡、痈疖、阑尾炎等治疗。目前，国内外学
者已对亚菊属中的西藏亚菊、灌木亚菊、新疆亚菊、蓍
状亚菊、栎叶亚菊、细叶亚菊、细裂亚菊等植物进行化
学成分及生物活性的研究。现有文献报道，已从该属
植物中提取出倍半萜内酯类、黄酮类、香豆素类、三萜
类、甾醇、挥发油等化学成分［４－７］。但是关于其生物活
性的文章鲜见报道。
１　材料和方法
１．１　试剂
没食子酸，福林酚，乙醇，甲醇，芦丁，２，６－二叔丁
基对甲苯酚（ＢＨＴ），抗坏血酸钠（Ｖｃ）１，１－二苯基－２
－三硝基苯肼（ＤＰＰＨ），２，２－联氮－二（３－乙基－苯
并噻唑－６－磺酸）二铵盐（ＡＢＴＳ），邻苯三酚，β－胡
萝卜素，硫氰酸铁，亚油酸，三氯乙酸，２－硫代巴比妥
酸，六氰合铁酸钾，三氯化铁。
１．２　仪器
ＢＮ－０８２７型电子分子天平（北京赛多利斯仪器
系统有限公司）；ＳＥＮＣＯ－ＸＭＴＥ旋转蒸发仪（余姚
新波仪表公司）；ＨＨ－４数显恒温水浴锅（国华电器有
限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公
司）；仪器有限公司）；ＳＢ－５２００ＤＴ超声波清洗机（宁
波新芝生物科技有限公司）。
１．３　材料
细叶亚菊采自西藏定日县扎西宗乡，经鉴定为菊
科 亚 菊 属 植 物 细 叶 亚 菊，其 凭 证 标 本 号 为
ＤＤ２０１３０１７，收储藏于西藏大学理学院生命科学系植
物标本室。
１．４　试验方法
１．４．１　待测物质的提取
取细叶亚菊全草粉碎成粉末过筛，精密称细叶亚
菊粉末置具塞锥形瓶中，按照１：１０的比例用７５％的
乙醇超声波提取，摇匀。超声处理３０ｍｉｎ，取出、冷却，
再次称重，加７５％乙醇补足减失，摇匀。对提取液进
行浓缩、干燥，保藏于干燥器中待用。细叶亚菊７５％
乙醇提取物（ＥＥＡＴ）提取率为１５．７５±１％。
１．４．２　总酚含量的测定总黄酮含量测定
ＥＥＡＴ里总酚含量的测定用Ｆｏｌｉｎ–Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ
法，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，具体参照Ｚｏ－
ｅｃｋｌｉｎ的试验方法［８］。ＥＥＡＴ样品中总黄酮含量运用
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动植物研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　《西藏科技》２０１６年４期（总第２７７期）
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基金项目：西藏大学研究生创新培养项目，细叶亚菊（Ａｊａｎｉａ　ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）精油的抑菌试验（２０１３）
通讯作者
ＡｌＣｌ３ 显色法，芦丁作为标准品并绘制曲线绘制，实验
参照郑媛媛等的方法［９］。每份样品平行操作３次。
１．４．３　自由基清除实验
１．４．３．１　ＤＰＰＨ自由基清除实验。ＥＥＡＴ清除ＤＰ－
ＰＨ自由基实验方法参考Ｌｉｌｉａｎ等人的实验方法略有
改动［１０］。取０．３ｍＬ不同浓度的样品液，加入２．７ｍＬ
ＤＰＰＨ （０．２ｍＭ），摇震后避光静置 ３０ｍｉｎ，测定
５１７ｎｍ处吸光度。以加入同量的蒸馏水代替样品液
作为空白对照，以ＢＨＴ，Ｖｃ做阳性对照。
清除率计算公式：［（Ａｓ　Ａｉ／Ａｓ）］×１００％（Ａｓ＝空
白溶液吸光度；Ａｉ＝样品溶液的吸光度）．
１．４．３．２　ＡＢＴＳ 自由基清除实验。ＥＥＡＴ 清除
ＡＢＴＳ自由基实验方法参考Ｄｅｊａｎ等人的实验方法稍
有改动［１１］。配制 ＡＢＴＳ＋ 自由基储备液，使用前用
８０％乙醇稀释（约１：８０）成工作液，使其在室温下于
７３４ｎｍ处的吸光度为０．７００±０．００５。将样品用甲醇
配制成一系列浓度，取 ０．３ｍＬ 样品加入 ２．７ｍｌ
ＡＢＴＳ＋工作液为样品组，另取０．３ｍＬ甲醇加２．７ｍｌ
ＡＢＴＳ＋工作液为对照组，混合，在３０℃下反应３０ｍｉｎ
后，测定７３４ｎｍ处的吸光值。以ＢＨＴ、ＶＣ为参照物。
抗氧化样品对 ＡＢＴＳ自由基的清除率可表示公
式为：ＳＡ（％）＝（Ａｓ－Ａｉ）／Ａｓ×１００％
（Ａｓ：ＡＢＴＳ·与溶剂混合液的吸光度，Ａｉ：ＡＢＴＳ
·与样品反应后的吸光度。）
１．４．３．３　超氧阴离子自由基Ｏ２－清除实验。ＥＥＡＴ
（０．４ｍｇ／ｍＬ）清除超氧阴离子自由基实验方法参考周
高等 人 的 实 验 方 法 稍 有 改 动［１２］。取 ｐＨ８．２ 的
５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ盐酸缓冲液４．５ｍｌ于试管中，置２５℃
水浴预热２０ｍｉｎ后，先后加入ＥＥＡＴ溶液０．５ｍｌ和
４５ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚溶液１０μｌ，以加入邻苯三酚的瞬
间开始计时，每隔３０ｓ计一次数，计到第６ｍｉｎ，测
３２５ｎｍ处吸光度。以蒸馏水代替样品作为空白对照，
Ｖｃ为阳性对照。
邻苯三酚的自氧化速率常数（ＫＢ）的计算：ＫＢ＝
（△Ａ－△Ａｏ）／Ｔ（式中：ＫＢ为邻苯三酚的自氧化速率
常数；△Ａ和△Ａｏ分别为加入和未加入邻苯三酚样
品的吸光值）。
１．４．４　脂质过氧化实验
１．４．４．１　β－胡萝卜素褪色实验。实验参照Ｓｈｏｎ方
法稍有改动［１３］。取６ｍｇ的β－胡萝卜素到试管中，加
入２０ｍｌ的氯仿，混合均匀。然后取４ｍｌ的混合液到
５００ｍｌ的圆底烧瓶中，加入８０ｍｇ的亚油酸和８００ｍｇ
的Ｔｗｅｅｎ８０充分混合，然后蒸去氯仿，最后加２００ｍｌ
的蒸馏水，摇匀混合均匀。制备不同浓度的样品液，取
３．０ｍｌ的乳化液，加入０．２ｍｌ０．４ｍｇ／ｍｌ的样品液，
５０℃孵育，测４７０ｎｍ处吸光值，２ｈ内每３０ｍｉｎ测定一
次吸光度。以Ｖｃ和ＢＨＴ为阳性对照。
ＬＰＯ抑制率（％）＝１－（（ＡｓＡｏ）／Ａｓ×１００％
（Ａｏ：β－胡萝卜素最初吸光度；Ａｓ：β－胡萝卜素２ｈ后
吸光度）
１．４．４．２　硫氰酸铁（ＦＴＣ）法测定对亚油酸自氧化的
抑制活性和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）法。ＥＥＡＴ样品对
对亚油酸自氧化的抑制活性实验方法参考黄博等人的
试验方法稍有改动［１４］。将不同浓度的样品溶液１ｍＬ
分别放人具塞试管中，加人１ｍＬ　２．５％亚油酸，２ｍＬ
０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ７．０）和１ｍＬ无离子水，置
于４０士１℃电热恒温培养箱中，每隔２４ｈ用ＦＴＣ法
测定一次过氧化物生成量，以吸光度值表示。空白对
照用１ｍ］蒸馏水代替样液，以ＢＨＴ作为阳性对照。
取４０士１℃恒温培养液０．０５ｍＬ，分别加人４．８５
ｍＬ７５％乙醇和０．０５ｍＬ３０％硫氰酸铁，然后加人０．０５
ｍＬ０．０２ｍｏｌ／Ｌ硫酸亚铁铵３．５％盐酸溶液，准确反应
３ｍｉｎ，测５００ｎｍ处吸光值。
当用ＦＴＣ法测定空白吸光度由最大值开始变小
时测定，取０．５ｍＬ的培养液，加入１ｍＬ　０．６７％ＴＢＡ
和１ｍＬ　２０％三氯乙酸，混合液沸水浴１０ｍｉｎ，放冷，加
入４ｍＬ水饱和正丁醇溶液萃取，静置分层后取有机相
测５３２ｎｍ处吸光值。
１．４．５　还原力的测定
ＥＥＡＴ样品的总还原力测定方法参考 Ｏｙａｉｚｕ的
实验方法［１５］。取０．２ｍＬ样品于试管中，依次加入
１ｍＬ　ｐＨ＝６．６，０．２ｍｏ１／Ｌ磷酸盐缓冲溶液和１ｍＬ
１％六氰合铁酸钾溶液（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６），于５０℃水浴中
保温２０ｍｉｎ后快速冷却，再加入１ｍＬ　１０％三氯乙酸
溶液，以３０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１０ｍｉｎ，取上清液
２ｍＬ，依次加入２ｍＬ蒸馏水，０．４ｍＬ０．１％三氯化铁溶
液（ＦｅＣｌ３），充分混匀，静置１０ｍｉｎ后，测定７００ｎｍ处
吸光值，以ＢＨＴ、Ｖｃ作为阳性对照。
２　结果与讨论
２．１　结果
２．１．１　总酚和总黄酮含量
酚类和黄酮类在植物类提取物抗氧化活性中起重
要作用。ＥＥＡＴ中总酚含量相当于３２．７±２．０μｇ／ｍｌ
没食子酸。ＥＥＡＴ中总含黄酮含量相当于１４．１９±１．
２９μｇ／ｍｌ芦丁。
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《西藏科技》２０１６年４期（总第２７７期）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　动植物研究
图１　没食子酸标准曲线（ｎ＝３）
图２　芦丁标准曲线（ｎ＝３）
２．１．２　ＤＰＰＨ和ＡＢＴＳ自由基清除实验
ＤＰＰＨ和ＡＢＴＳ自由基清除模型是抗氧化活性
筛选中广泛应用的模型。如图３所示ＥＥＡＴ、ＢＨＴ、
Ｖｃ对ＤＰＰＨ和 ＡＢＴＳ自由基都有一定的清除作用，
且随着浓度的增加清除作用增强当浓度达到一定浓度
以后清除率不再增加。若以清除率达到５０％（Ｉｃ５０）时
的浓度进行比较，ＥＥＡＴ，ＢＨＴ，Ｖｃ对ＤＰＰＨ 的Ｉｃ５０
依次为２５３．１６μｇ／ｍｌ、９２．８６μｇ／ｍｌ和８０．２０μｇ／ｍｌ。
Ｖｃ，ＢＨＴ和ＥＥＡＴ对ＡＢＴＳ自由基的ＩＣ５０值依次为
２１．２μｇ／ｍｌ，１．８８μｇ／ｍｌ和３４．４μｇ／ｍｌ。
图３　不同浓度ＥＥＡＴ、ＢＨＴ、Ｖｃ对ＤＰＰＨ
自由基清除率（ｎ＝３）
图４　不同浓度ＥＥＡＴ、ＢＨＴ、Ｖｃ对ＡＢＴＳ
自由基清除率（ｎ＝３）
２．１．３　超氧阴离子实验
超氧阴离子自由基可以引起核酸链断裂，多糖解
聚和不饱和脂肪酸过氧化进而造成遗传突变酶系失
灵，线粒体氧化磷酸化作用改变。实验结果显示ＥＥ－
ＡＴ有明显抑制邻苯三酚的自氧化速率。空白组，ＥＥ－
ＡＴ组合Ｖｃ组邻苯三酚的自氧化速率（Ｋｂ）依次为８．
４±０．４＊１０－４，６．９±０．６＊１０－４，５．６±０．２＊１０－６。
２．１．４　β－胡萝卜素褪色实验
亚油酸在自养化过程中产生自由基使β－胡萝卜
素的双键断裂从而使其氧化褪色，而抗氧化剂可以保
护β－胡萝卜素延缓其氧化。浓度为０．４ｍｇ／ｍｌ的
ＢＨＴ和ＥＥＡＴ的脂质过氧化抑制率分别为６４．７５％，
２９．２１％。
图５　不同时间ＥＥＡＴ、ＢＨＴ、Ｖｃ抑制β－胡萝卜
素褪色关系曲线（ｎ＝３）
２．１．５　硫氰酸铁（ＦＴＣ）法测定对亚油酸自氧化的抑
制活性和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）法
油脂加热形成氧化物或者过氧化物可将Ｆｅ２＋氧
化成Ｆｅ３＋，Ｆｅ３＋与ＳＣＮ－形成血红色硫氰酸铁。从图
６看到从第一天到第九天溶液的吸光值逐渐上升，从
第十天开始吸光值开始下降。加了ＢＨＴ和ＥＥＡＴ的
溶液吸光值缓慢上升即ＢＨＴ和ＥＥＡＴ溶液均有长时
间抑制自由基形成的功效。通过图７显示ＢＨＴ组和
ＥＥＡＴ组对空白组比较吸光值有明显的下降，且ＥＥ－
ＡＴ和ＢＨＴ吸光值没有明显的下降趋势。实验结果
显示ＢＨＴ和ＥＥＡＴ可以抑制反应中丙二醛的形成从
而抑制脂质过氧化从而起到抗氧化的效果。
图６　ＦＴＣ法检测ＥＥＡＴ抗氧化活性（ｎ＝３）
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动植物研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　《西藏科技》２０１６年４期（总第２７７期）
图７　ＴＢＡ法检测ＥＥＡＴ抗氧化活性
（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．００１）
２．１．６　还原力的测定
通过还原力测定，可以检测样品是否为良好的电
子供体。还原力强的物质可以提供更多的电子，其供
应的电子除了可使Ｆｅ３＋还原为Ｆｅ２＋外，也可参与自由
基反应，使自由基形成稳定的物质。以Ｖｃ和为ＢＨＴ
参照，测定了ＥＥＡＴ的总还原力。图３显示ＥＥＡＴ和
ＢＨＴ的还原力从０～１０００μｇ／ｍｌ随着浓度的增加而
增强。Ｖｃ的还原力在０～１００μｇ／ｍｌ快速增加，２００～
４００μｇ／ｍｌ还原力缓慢增长，从４００μｇ／ｍｌ开始达到稳
定值。还原力大小为ＥＥＡＴ＜ＢＨＴ＜Ｖｃ。
图８　不同浓度ＥＥＡＴ的还原力（ｎ＝３）
２．２　讨论
生物体内氧自由基通过酶促反应、膜电子传递泄
露、自动氧化不断产生，包括·ＯＨ、Ｏ２－˙和Ｒ˙，
而各种氧自由基中，·ＯＨ是已知的最强的氧化剂，它
几乎可以和所有的细胞成份发生反应，引起膜脂、蛋白
质和核酸氧化损伤、导致细胞衰老、死亡、机体病变［１６］
·ＯＨ能直接攻击ＤＮＡ分子导致链断裂，毒害性最
大［１７－１９］。油脂的自动氧化是油脂和含油脂食品最主
要的变质现象，其机理是油脂尤其是含有不饱和脂肪
酸的油脂在光、热和金属催化剂作用下形成游离基，然
后迅速吸收空气中的氧形成过氧化游离基，进一步形
成氢过氧化物（５０℃以下）或环状过氧化产物，造成含
油脂食品的酸败。在生物体内氧化作用会造成必需脂
肪酸破坏，从而引起细胞和组织的损伤［２０，２１］。
人们已经发现酚类化合物其化学结构与抗氧化活
性有着直接的关系（Ｖｅｌｉｏｇｌｕ　ｅｔ　ａｌ１９９８）。一般情况
下，酚类物质（类黄酮，酚酸等等）的自由基清除及抗氧
化活性是取决于芳香环上羟基的数量及位置，也受到
其他像糖基化和苷配基位置的影响。因此体内外抗氧
化活性可能与ＥＥＡＴ内酚类化合物有关。除此之外
根据薛敬，卢永昌，薛楠研究得知细叶亚菊甲醇提取物
中含有绿原酸，其具有抗氧化抗肿瘤细胞，抗菌，提高
中枢兴奋等作用，这与ＥＥＡＴ有一定的抗氧化作用相
符。ＥＥＡＴ抗氧化活性机理及其与化学结构之间的
关系仍需进一步阐明，进而做细叶亚菊提取物在体内
的抗氧化剂保护活性，系统的评价细叶亚菊提取物抗
氧化活性和阐明抗氧化机理。最终将细叶亚菊开发出
一个天然抗氧化药物。
致谢：感谢西藏大学研究生创新人才培养基金项
目对本论文的资助，感谢武汉大学药学院中药和天然
产物研究所提供实验条件。
参考文献
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〔４〕　Ｍｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｕ，Ｙ．Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｔａｎ，
Ｒ．Ｘ．Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｈｉｇｈｌｙ　ｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ　ｇｕａｉａｎｏｌｉｄｅｓ　ａｎｄ
ｏｔｈｅｒｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａｊａｎｉａ　ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ〔Ｊ〕　，Ｐｈｙ－
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，５８：１１４１－１１４５．
〔５〕　ＺｈａｎｇＬ．Ｘ．，ＨｅＺ．Ｗ．，Ｚｈｕ　Ｙ，Ｔｈｅ　ｌｉＰｏｐｈｉｌｉ　ｅｅ－
ｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａ．ｊａｎｉａ　ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉ．Ｌａｎ　ｚｈｏｕ　ｄａｘｕｅ
ｘｕｅｂａｏ，Ｚｉｒａｎ　Ｋｅｙｕｅ　Ｋｅｘｕｅｂａｎ　２００６，４２，６５－６８．
〔６〕　张占欣．三种菊科植物和一种玄参科植物化学成
分及其生物活性研究［Ｄ］．兰州大学：２００８：７９－９５．
〔７〕　张丽霞，何自伟，祝英．细裂亚菊中亲脂性化学成
分的研究〔Ｊ〕　．兰州大学学报（自然科学版），２００６，４２
（６）：６５－６７．
〔８〕　薛敬，卢永昌，薛楠．ＨＰＬＣ测定细叶亚菊中的
绿原酸［Ｊ］．华西药学杂志，２０１０：２５（１），７４－７５．
（略）
编校　洛桑次仁
７７
《西藏科技》２０１６年４期（总第２７７期）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　动植物研究