全 文 ：［收稿日期］ 20120112(001)
［基金项目］ 十一五“重大新药创制”科技重大专项项目(2009ZX09103-394)
［第一作者］ 曹跃，硕士，从事中药有效成分提取分离研究，Tel:15998452608，E-mail:caoyue0412@ 126． com
［通讯作者］ * 许枬，博士，副教授，从事中药有效成分及活性研究，Tel:0411-87586014，E-mail:xudanbs@ 163． com
火绒草中总黄酮的纯化工艺优选
曹跃1，王丽1，周翎2，谢雪1，许枬1*
(1. 辽宁中医药大学药学院，大连 116600;2. 大连海港医院，大连 116101)
［摘要］ 目的:优选火绒草中总黄酮的大孔吸附树脂富集纯化工艺。方法:采用静态吸附 /解吸与动态吸附 /解吸相结合
的方法，用紫外-可见分光光度法测定火绒草中总黄酮含量，筛选最佳大孔吸附树脂，并对其纯化工艺进行优选。结果:确定采
用 HPD100 型大孔吸附树脂对火绒草中总黄酮进行富集纯化，其最佳工艺条件为以 2 BV 火绒草供试品溶液(生药质量浓度
0. 1 g·mL － 1)为最大上样量，吸附速率为 1 BV·h － 1，吸附 2 h，洗脱流速 4 BV·h － 1，5 BV 水洗脱，4 BV 30%乙醇洗脱，3 BV 50%
乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得。按上述最佳纯化工艺总黄酮洗脱率 ＞ 90%。结论:该优选工艺稳定可行，适合工业化
生产。
［关键词］ 大孔吸附树脂;火绒草;水溶性黄酮;纯化工艺
［中图分类号］ R283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)10-0038-03
Optimization of Purification Technology for Total Flavonoids
from Leontopodium leontopodioid
CAO Yue1，WANG Li1，ZHOU Ling2，XIE Xue1，XU Nan1*
(1. College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China;
2. Dalian Harbour Hospital，Dalian 116101，China)
［Abstract］ Objective: To optimize enrichment and purification technology of total flavonoids from
Leontopodium leontopodioid by macroporous resin． Method:Optimum macroporous resin and its purification
technology was optimized by static adsorption / desorption and dynamic adsorption / desorption． The content of total
flavonoids was determined by ultraviolet and visible spectrophotometry method． Result:HPD100 macroporous resin
showed good concentration and purification capabilities to total flavonoids from L． leontopodioid． Optimum
technology conditions were as follows:2 BV sample liquid (the concentration of raw drug was 0. 1 g·mL － 1)of L．
leontopodioid was passed through HPD-100 resin in 2 h with adsorption rate of 1 BV·h － 1，eluted by 5 BV water，
4 BV 30% ethanol，3 BV 50% ethanol， respectively，elution flow rate was 4 BV·h － 1 ． Eluate was collected to
concentrating under vacuum． Under this optimized technology， the elution rate of total flavonoids was more than
90% ． Conclusion:This optimized technology was stable，feasible，it was suitable for industrial production．
［Key words］ macroporous resin; Leontopodium leontopodioid;water-soluble flavonoids; purification
technology
火绒草为菊科火绒草属植物火绒草的干燥全
草，在我国东北和青藏高原等地产量丰富。以往主
要作为民间用药，近年来由于其在治疗小儿急慢性
肾炎、急性肾炎、小儿复发性肾病综合症、糖尿病等
症中取得很好的疗效，受到很多学者的关注，临床用
量逐年提高［1-5］。
·83·
第 18 卷第 10 期
2012 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 10
May，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.10.022
火绒草水提取物对四氧嘧啶引起的糖尿病有明
显的防治作用，能明显对抗肾上腺素和外源葡萄糖
引起的小鼠血糖升高［6］。采用酸碱水半仿生提取
工艺获得的火绒草水溶性提取物也有很好的抗糖尿
病作用［7］。火绒草水提物还有抗炎和抑制肝细胞
损伤等活性［8］。化学研究显示，火绒草中富含黄
酮，包括槲皮素、芹菜素、山奈酚、芦丁、芹菜素-7-O-
β-D-吡喃葡萄糖苷［9］、金圣草素-4-O-β-D-葡萄糖
苷［10］、大波斯菊苷［5］等。本试验考察 6 种不同型号
大孔吸附树脂对火绒草中水溶性黄酮类化合物进行
富集纯化，并对其纯化工艺进行优选。
1 材料
FA1004B 型 1 /万分析天平(上海精密科学仪器
有限公司) ，U3010 型紫外分光光度计(日本日立公
司) ，AB-8 型树脂(安徽三星树脂科技有限公司) ，
D101 型树脂 (天津欧瑞生物科技有限公司) ，
HPD100，HPD700，HPD450，DM130 型树脂均由河北
沧州宝恩化工有限公司提供。芦丁对照品(中国药
品生物制品检定所，批号 100080-200707) ，火绒草
采集于辽宁新民县，经辽宁中医药大学王冰教授鉴
定 为 火 绒 草 Leontopodium leontopodioid (Wild)
Beauv．，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
2 方法与结果
2. 1 供试品溶液的制备 取火绒草 50 g，加 10 倍
量 75%乙醇回流提取 1 h，提取液浓缩至干膏，加水
溶解并定容至 500 mL 量瓶中，滤过，取续滤液，即得
(生药含量为 0. 1 g·mL － 1)。
2. 2 对照品溶液的制备 取干燥至恒重的芦丁对
照品适量，精密称定，制成 0. 2 g·L － 1的芦丁甲醇溶
液，即得。
2. 3 紫外吸收光谱的测定 精密吸取对照品溶液
5 mL，供试品溶液 1 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，加
甲醇至 6 mL，加 5% NaNO2 溶液 0. 3 mL，摇匀，静置
6 min，加 10% Al(NO3)3 溶液 0. 3 mL，摇匀，静置 6
min，加 4% NaOH 溶液 3 mL，加甲醇至刻度，摇匀，
静置 15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光
光度法(2010 年版《中国药典》一部附录 VA) ，在
400 ～ 800 nm 进行扫描，供试品和对照品吸收谱图
相近，且均在 520 nm 处有最大吸收，故选定 520 nm
为测定波长。
2. 4 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液
0. 25，0. 5，1，2，4 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，按
2. 3 项下方法，自“加甲醇至 6 mL”起依法测定吸光
度，测定波长为 520 nm。以吸光度(Y)为纵坐标，芦
丁质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。得回归
方程 Y = 8. 439 5X + 0. 032 4(r = 0. 999 2) ，线性范
围 3. 15 ～ 79. 34 mg·L － 1。
2. 5 树脂型号筛选 量取已处理好的 6 种大孔吸
附树脂各 4 mL，分别置 50 mL 具塞烧瓶中，精密加
入供试品溶液 2. 5 mL，充分振摇后，室温下静置 12
h，滤过，取续滤液 2 mL，置10 mL量瓶中，按标准曲
线制备项下的方法，自“加甲醇至 6 mL”起依法测
定溶液中的总黄酮含量。取上述吸附饱和后的树
脂，分别精密加入 95% 乙醇 25 mL 解吸，充分振摇
后，室温下静置 12 h，滤过，取续滤液 1 mL，置 10 mL
量瓶中，按标准曲线制备项下方法，自“加甲醇至 6
mL”起依法测定解吸液中总黄酮含量。计算各型
号树脂的吸附率、吸附量、解析率、解吸量及回收率，
结果见表 1。
吸附率 = (上样总黄酮 － 未吸附黄酮) /上样总黄酮;
吸附量 = 上样总黄酮 － 未吸附黄酮;解吸率 = 解吸液中黄
酮 /上样总黄酮;解吸量 =解吸液中黄酮;转移率 =实际测得
黄酮 /理论上样黄酮。
表 1 不同型号树脂的考察指标
树脂型号
吸附率
/%
吸附量
/mg
解吸率
/%
解吸量
/mg
转移率
/%
AB-8 92. 4 19. 47 80. 4 15. 7 68. 2
HPD100 93. 5 19. 96 96. 7 19. 3 84. 1
D101 91. 7 19. 15 91. 9 17. 6 76. 7
HPD700 90. 5 18. 61 81. 7 15. 2 66. 2
HPD450 89. 0 17. 44 86. 9 15. 2 66. 0
DM130 91. 8 19. 19 85. 5 16. 4 71. 5
由表 1 可见，HPD100 对供试品溶液具有易吸
附，易解吸的特点，故选用 HPD100 大孔吸附树脂富
集纯化火绒草中总黄酮成分。
2. 6 富集纯化工艺
2. 6. 1 泄露曲线的绘制 量取 10 mL 已处理好的
HPD100 大孔树脂，湿法装柱，供试品溶液上样，流
出速度 1 BV·h － 1，收集流出液，每 5 mL 收集 1 流
份，共收集 16 份，分别取 0. 2 mL 至 10 mL 量瓶中，
按标准曲线制备项下方法测定吸光度，计算黄酮含
量，绘制泄露曲线(图 1)。
由图 1 可知，上样量 30 mL 时，泄漏率达
12. 2%;上样量 20 mL 时，泄漏率仅为 2. 6%，故确
定每 mL 树脂最大上样量为 2 mL 供试品溶液。
2. 6. 2 洗脱溶媒及其用量的确定 取 10 mL 已处
理好的 HPD100 大孔树脂，湿法装柱，以流速 1 BV·
h － 1上样 20 mL，吸附 2 h，5 BV 水洗至 molish 反应阴
性，依次用 30% 乙醇，50% 乙醇，70% 乙醇，90% 乙
·93·
曹跃，等:火绒草中总黄酮的纯化工艺优选
图 1 火绒草中总黄酮 HPD100 大孔树脂泄露曲线
醇各 4 BV 以4 BV·h － 1流速洗脱，每 1 BV 收集 1 流
份，减压浓缩，加甲醇定容至 10 mL。分别取 0. 5 mL
至 10 mL 量瓶中，按照标准曲线制备项下方法，测定
总黄酮含量，分别计算洗脱率，结果见表 2。
洗脱率 =洗脱液中黄酮含量 /树脂吸附黄酮量 × 100%
表 2 火绒草中总黄酮 HPD100 大孔树脂洗脱溶媒及其用量考察
乙醇体积
分数 /%
总黄酮洗脱率 /%
1 BV 2 BV 3 BV 4 BV
30 5. 75 28. 85 21. 72 9. 79
50 4. 41 6. 83 4. 10 0. 68
70 0. 26 0. 41 0. 56 0. 51
90 0. 47 0. 44 0. 49 0. 51
由表 2 结果可知，4 BV 30%乙醇和 3 BV 50%
乙醇可将约 81. 4%的总黄酮洗脱下来，故确定洗脱
溶媒及其用量为 4 BV 30%乙醇和 3 BV 50%乙醇。
综合上述试验结果可知，HPD100 大孔吸附树
脂富集火绒草中总黄酮成分的最佳工艺为以流速
1 BV·h － 1将 2 BV 样品溶液上样，吸附 2 h，5 BV 水
洗，4 BV 30%乙醇及 3 BV 50%乙醇以 4 BV·h － 1的
流速洗脱，合并洗脱液，即得火绒草中总黄酮成分。
2. 7 验证试验 取 50 mL 已处理好的 HPD100 大
孔树脂，湿法装柱，按优选的最佳工艺进行纯化，洗
脱液浓缩，测定总黄酮含量。结果火绒草中总黄酮
成分洗脱率为 94. 2%。试验表明工艺经放大 5 倍
后，结果与实验室小试结果重复性良好(RSD ＜
3%) ，证明该优化工艺条件稳定可行。
3 讨论
本实验显示 HPD100 型大孔吸附树脂对火绒草
中水溶性黄酮类成分有较好的富集纯化能力，预试
验结果表明，吸附时间和样品质量浓度是影响大孔
吸附树脂富集纯化火绒草中总黄酮的主要因素，经
反复试验最终确定最佳吸附时间为 2 h，最佳样品质
量浓度为生药含量 0. 1 g·mL － 1。
本文采用的总黄酮含量测定方法为 NaNO2-
Al(NO3)3 -NaOH法
［11-12］，加入显色剂时，应充分摇
匀，且放置一定时间，以确保显色反应完全。每次量
瓶中残留 NaOH 必须在实验结束后清洗干净，以免
影响下一次测定结果。正常显色反应后，溶液呈粉
红色;在有 NaOH 残留的量瓶中进行显色，溶液则呈
橙红色。为避免因残留 NaOH 造成误差，清洗量瓶
时应用 10%醋酸浸泡 2 h，再用蒸馏水冲洗干净。由
于火绒草中总黄酮主要为黄酮和黄酮醇类化合物，
芦丁为其主要成分之一。故本文采用芦丁作为对照
品，测定火绒草中总黄酮的含量。
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［责任编辑 仝燕］
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第 18 卷第 10 期
2012 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 10
May，2012