全 文 ：糙叶败酱大孔吸附树脂提取物对荷瘤小鼠
红细胞膜 CD35和 CD44s的影响
王学习 1 ,赵健雄 1＊ ,程卫东1 ,陈　茹 1 ,白德成 2
(兰州大学 1.中西医结合研究所;2.附属肿瘤研究中心 ,甘肃兰州 730000)
　　摘要　目的:观察糙叶败酱大孔吸附树脂提取物对荷瘤小鼠红细胞免疫功能的调节作用。方法:D101大孔吸
附树脂分离糙叶败酱水提物 ,测定其组分;糙叶败酱提取物作用于荷瘤小鼠(S180),观察生命延长率 ,检测红细胞天
然免疫活性和红细胞膜 CD35、CD44s数量。结果:糙叶败酱大孔吸附树脂提取物中多糖含量为 8.4%, 皂苷含量为
48.4%,作用于荷瘤小鼠 , 生命延长率增加 ,红细胞天然免疫活性得到改善 , CD35和 CD44s数量增加。结论:糙叶
败酱大孔吸附树脂提取物有一定的红细胞免疫调节作用。
关键词　糙叶败酱;大孔吸附树脂;红细胞免疫;CD35;CD44s
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)11-1414-04
ErythrocyteImmunologicFunctionEffectsofPatriniascabraExtracts
byMacroporousAdsorptiveResinsonMiceBurdenedTransplantedTumor
WANGXue-xi1 , ZHAOJian-xiong1 , CHENGWei-dong1 , CHENRu1 , BAIDe-cheng2
(LanzhouUniversity1.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine; 2.AfiliatedRescarchCentreofTumor,
Lanzhou730000, China)
Abstract　Objective:ToresearchtheerythrocyteimmunoregulationefectsofPatriniascabraextractsbymacroporousadsorptive
resinsonmiceburdenedtransplantedtumor.Methods:ExtractsofPatriniascabraBungewereseparatedbymacroporousadsorptiveres-
ins, ingredientswereanalysised.Miceburdenedtransplantedtumorweregivenextracteddrugs.Lifeprolongationratewasobserved, e-
rythrocyteimmunologicfunctionandtheCD35, CD44scontentsofredbloodcelwereevaluated.Results:Polysaccharideandsaponin
accountedfor8.4% and48.4%.Extractscouldporolonglifeexpectancyofmice, improveerythrocyteimmunolgicfunctionandin-
creasetheCD35 andCD44scontentsofredbloodcel.Conclusion:ExtractsofPatriniascabraBungebymacroporousadsorptiveresins
haveerythrocyteimmunoregulationeffectsonmiceburdenedtransplantedtumor.
Keywords　PatriniascabraBunge;Mcroporousadsorptiveresins;Eythrocyteimmunologicfunction;CD35;CD44s
基金项目:国家中药管理局课题(04-05ZP61);甘肃省科技攻关项目(2GS042-A43-014-15)＊通讯作者:赵健雄 , Tel:0931-8915184, E-mail:zhaojx-01@126.com。
　　糙叶败酱(PatriniascabraBunge)为败酱科败酱
属植物 ,常与其同属植物异叶败酱 (Patriniahetero-
phylaBunge)混用 ,俗称墓头回。研究表明 ,其包括
多糖 、皂苷等在内的多种提取物均具有一定的体内
外抗肿瘤作用和免疫调节作用 ,可用于治疗宫颈癌 、
白血病 、大肠癌等 〔1、2〕。
中药的药理作用是多种成分共同作用的结果 ,
提取分离中药中的单体成分进行药理作用研究 ,有
一定的难度和不可操作性 。该研究利用 D101净品
型大孔吸附树脂对糙叶败酱的水提物进行柱层析 ,
水洗去除大部分无药理活性物质 ,再用稀醇洗脱具
有药理活性部分进行实验 ,既有一定的可操作性 ,同
时又去除了传统中药服用剂量大 、作用成分模糊的
缺点。
1 　材料与方法
1.1 　实验样品　购入从甘肃庆阳地区采集的墓头
回根 20kg,经甘肃省医学科学研究院石长栓教授鉴
别为糙叶败酱 。水煎 3次 , 3 h/次 ,合并煎液浓缩 ,
浓缩液进行大孔吸附树脂柱层析 , 洗脱液依次为
H2O、20%乙醇 、50%乙醇 、80%乙醇 。其中 50%乙
醇洗脱液共计 1020个流份 , 500 ml/流份 ,经薄层层
析鉴别合并为 4个不同组分 ,浓缩 ,得干品。取第 3
个组分即 689 ～ 953流份 ,水溶解 , 0.22 μm微孔滤
膜过滤除菌 ,即得。
1.2　动物与细胞株　清洁级昆明种小鼠 96只 ,雌
雄各半 ,体重(18±2)g,兰州生物制品研究所提供。
S180肉瘤细胞株 ,中国医学科学院北京药物研究所引
种 ,本所传代保种。
1.3　试剂与仪器　D101净品型大孔吸附树脂 ,比
表面积≥400 m2 /g,购自兰州四方医药开发公司;酵
母菌 ,灭活 S180瘤细胞 ,由上海长海医院输血科免疫
室提供;羊抗小鼠 CD35sc-7604,兔抗小鼠 CD44 sc-
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.11.027
7964, Santacruzbiotechnology.inc产品;兔抗羊 IgG-
FITCBA1110,羊抗兔 IgG-FITCBA1105,武汉博士
德生物工程有限公司产品;环磷酰胺 ,上海华联制药
有限公司产品;流式细胞仪(美国 , oulterEPICS-XL
型)。
1.4 　样品成分测定
1.4.1　多糖含量测定:以分析纯葡萄糖为标准品 ,
苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量 。
1.4.2　皂苷含量测定:因糙叶败酱中含有多种皂
苷 ,且性质相近 ,其单体分离纯化困难 。文献报道其
皂苷元主要是齐墩果酸 。故以齐墩果酸为标准品 ,
香草醛 -高氯酸法测定样品总皂苷水解产物中齐墩
果酸的含量来测定糙叶败酱总皂苷含量。
1.5 　抗肿瘤作用
1.5.1　分组与给药:清洁级昆明种小鼠 56只 ,腹
腔注射 S180瘤细胞悬液(1×107个 /ml), 0.2ml/只 ,
随机分为 4组:阴性对照组(NS),阳性对照组(环磷
酰胺 , 0.01g/kg·d),治疗大剂量组(糙叶败酱提取
物 , 1 g/kg· d),治疗小剂量组(糙叶败酱提取物 ,
0.5g/kg· d)。造模 1 d后 ,所有动物等体积(0.1
ml/10 g),腹腔注射给药 , 1次 /d,连续 10 d。记录
小鼠死亡时间。待各组动物死亡至半数时 ,处死动
物 ,记录半数存活时间 。
另取清洁级昆明种小鼠 40只 ,造模 、分组与给
药同上。治疗结束次日 ,心脏采血 ,枸橼酸钠抗凝 ,
测红细胞免疫功能。
1.5.2　生命延长率:根据各组动物的半数存活时
间 ,计算生命延长率。
生命延长率 =实验组半数存活时间 -模型组半数存活时间模型组半数存活时间
×100%
1.5.3　红细胞天然免疫活性的测定:按郭峰法 〔3〕
检测红细胞 C3b受体花环率 、红细胞免疫复合物花
环率和红细胞肿瘤细胞花环率。
1.5.4 　红细胞膜 CD35和 CD44s测定:按郭峰
法〔3〕用流式细胞仪检测红细胞膜 D35和 CD44s平
均荧光强度。
1.6　统计学方法　用 SPSS13.0软件进行 Kaplan-
Meier生存分析和方差分析。
2　结果
2.1　样品成分测定　经测定 ,样品中多糖含量为
8.4%,皂苷含量为 48.4%。
2.2　生命延长率　见表 1。糙叶败酱提取物作用
于 S180荷瘤小鼠 ,可提高其半数存活时间 ,进行 Kap-
lan-Meier生存分析 ,与模型组比较 , 差异有显著性
(P<0.01);治疗大剂量组生命延长率为 48.1%,小
剂量组 37.0%。按照 1983年全国抗癌协会制定的
《抗肿瘤药物体内筛选规程 》判定 ,糙叶败酱提取物
具有一定的抗肿瘤作用 。
　表 1　　　　糙叶败酱提取物对荷瘤小鼠生命
延长率的影响( x±s, n=14)
组别 半数存活时间(d) 生命延长率(%)
NS 13.5 -
环磷酰胺 22.5＊＊ 66.7
糙叶败酱提取物大剂量 　　20＊＊ 48.1
糙叶败酱提取物小剂量 18.5＊＊ 37.0
　　注:与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。下表皆同
2.3　糙叶败酱提取物对红细胞天然免疫活性的影
响　见表 2。糙叶败酱提取物作用于 S180荷瘤小鼠 ,
可提高红细胞 C3b受体花环率和红细胞肿瘤细胞花
环率 ,减少红细胞免疫复合物花环率 ,与模型组比
较 ,差异有显著性(P<0.05或 P<0.01)。
　　表 2 　糙叶败酱提取物对红细胞天然免疫活性的影响( x±s, n=10)
组别 红细胞 C3b受体花环率(%) 红细胞免疫复合物花环率(%) 红细胞肿瘤细胞花环率(%)
NS 9.20±2.33 13.60±3.30 16.60±3.14
环磷酰胺 5.20±2.39＊ 16.30±4.29 12.60±3.40＊
糙叶败酱提取物大剂量 12.48±3.67＊＊ 10.34±3.54＊ 26.42±6.04＊＊
糙叶败酱提取物小剂量 10.84±3.11 12.28±4.44 21.48±4.74＊
2.4 　糙叶败酱提取物对红细胞膜 CD35和 CD44s
分子数量的影响　见表 3。糙叶败酱提取物作用于
S180荷瘤小鼠 ,可提高红细胞膜表面 CD35和 CD44s
分子数量 ,与模型组比较 ,差异有显著性(P<0.05
或 P<0.01)。
3 　讨论
本研究用 D101型大孔吸附树脂柱层析 ,分离
糙叶败酱有效部位进行荷瘤小鼠(S180腹水型)抗肿
瘤实验 ,结果表明其可提高小鼠生命延长率 ,调节红
细胞天然免疫活性 , 提高红细胞表面 CD35和
CD44s分子表达数量。
　　大孔吸附树脂吸附分离技术是采用适宜的大孔
1415中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
　表 3　　　　糙叶败酱提取物对红细胞膜 CD35和
CD44s分子数量的影响( x±s, n=10)
组别 CD35(荧光强度) CD44s(荧光强度)
NS 10.27±2.89 50.44±8.71
环磷酰胺 7.61±3.20＊ 40.74±6.90＊
糙叶败酱提取物大剂量 15.34±6.85＊ 71.14±18.19＊＊
糙叶败酱提取物小剂量 11.98±4.06 60.47±15.89
吸附树脂 ,通过物理吸附从中药提取液中有选择的
吸附其中的有效成分 ,去除无效部分的一种提取纯
化的新工艺 ,可以达到分离 、富集中药有效部位
(群)或有效成分(群)的目的 ,使有效部位(群)或
有效部分(群)的含量(纯度)提高 6 ～ 7倍 ,有明显
的去粗取精作用 〔4〕。该技术近年来已被逐渐应用
于中药有效部位或有效成分的提取分离 、中药新药
的开发研制与中成药的生产中。实验证明 D101型
大孔吸附树脂吸附范围广 ,吸附容量大 ,可从中药水
提液中选择性的吸附各种生理活性成分 ,从而使有
效成分和无效成分分开。大量的中药及中药复方对
比研究证明 ,用 D101型大孔吸附树脂所得产品与
传统制剂在活性成分 、药理作用及临床效果方面一
致 〔5〕。
　　肿瘤患者在放化疗后期由于肿瘤本身和肿瘤术
后放化疗的原因 ,常出现机体免疫功能的严重下降 ,
包括白细胞和红细胞功能和数量的改变 ,进而发生
的肿瘤细胞血行转移会危及 90%肿瘤病人的生命 。
因此 ,机体的免疫状态直接影响到疾病的转归 。白
细胞数量的下降常受到临床医师的高度重视 ,而红
细胞免疫功能的紊乱未受关注 。
红细胞是血循环中最重要的固有免疫细胞 ,其
细胞膜上有许多与免疫有关的物质 (如 CD35、
CD44s、CD58、CD59、SOD酶等),自成系统 ,具有识
别 、粘附 、浓缩 、杀伤抗原 、清除循环免疫复合物
(CIC)的能力 ,并参与机体免疫调控 ,有完整的自我
调控系统。
正常红细胞膜上存在大量的具有免疫活性的
CRI,即 CD35,其与循环免疫复合物 、抗原物质及其
它机体细胞接触的机会是白细胞的 500 ～ 1000倍 ,
通过该受体的免疫粘附作用 ,红细胞得以发挥其携
带清除免疫复合物 、识别储存抗原 ,促进吞噬细胞吞
噬 ,促进 T、B细胞活化等功能 〔6〕。肿瘤细胞可旁路
激活和粘附补体 C3b分子 ,而与红细胞 CD35粘附 ,
因此红细胞在阻止癌细胞血行扩散中可能起重要作
用 〔7〕。实验证明 ,机体在荷瘤状态下 ,红细胞膜表
面 CRI数量和活性降低 ,其免疫粘附肿瘤细胞的能
力亦随之下降 〔8〕。
红细胞表达的 CD44分子是一个高度异质性的
单链跨膜糖蛋白 , 称为标准型 CD44(CD44s)。
CD44s分子数量是 CD35分子表达数量的 3 ～ 20
倍 ,是红细胞上表达数量最多的膜分子 。它参与 T、
B细胞分化发育过程 ,调节淋巴细胞免疫功能 ,而且
与肿瘤细胞的转移有重要关系。研究表明〔9〕 ,发生
转移的恶性肿瘤患者红细胞 CD44s数量明显低于
未发生转移的肿瘤患者和正常对照人群 。
因此 ,红细胞作为数量庞大的细胞群 ,其介导的
免疫清除反应及免疫调节功能〔10〕 ,是机体整体功能
的具体体现。通过平衡红细胞免疫活性可纠正淋巴
细胞的病理状态 ,可增强白细胞对抗原的识别能力 ,
同时可增强抗原对白细胞 (包括淋巴细胞 、NK细
胞 、树突状细胞 、粒细胞)等的激活和效应作用 ,调
节机体的免疫功能 ,可防止肿瘤的复发和转移〔11〕。
本研究中 ,糙叶败酱提取物可提高红细胞 C3b
受体花环率和红细胞肿瘤细胞花环率 ,减少红细胞
免疫复合物花环率 , 增加红细胞膜表面 CD35、
CD44s分子的数量 ,调节红细胞免疫功能。红细胞
免疫功能的改善 ,可以进一步纠正淋巴细胞的病理
状态 ,改变机体的免疫状态 ,减少肿瘤细胞的免疫逃
逸 ,从而起到对抗肿瘤细胞的作用 。
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基金项目:广东省科技计划项目(2005B33001040);广东省中医药局资助项目(1040056和 301014)＊通讯作者:陈泽雄(1964-), 男, 医学硕士 , 副教授 ,主要从事中药对肝胆病的防治研究;Tel:020-87332200-8385, E-mail:zexiong333@
163.com。
复方中药对裸鼠肝癌模型的抗癌作用研究
孙保国 ,陈泽雄＊ ,张诗军 ,刘泳冬 ,黄红中 ,尹丽荣
(中山大学附属第一医院 ,广东广州 510080)
　　摘要　目的:探讨复方中药对间接原位移植肝癌裸鼠模型的干预作用。方法:采用人肝细胞癌细胞株 Bel-7402
间接原位移植 , 造雄性肝癌裸鼠模型 48只 , 造模后 24 h随机分 4组 ,即复方中药低(A)、中(B)、高(C)3个浓度组
和 FT207化疗组(D), 4周后处死裸鼠 ,观察各组荷瘤裸鼠的生存时间 、瘤体积 、瘤指数 、肝内转移情况等 , 并用二步
法免疫组化检测肝组织 、肝癌旁组织 、肝癌组织中 PTEN蛋白的表达。结果:四周时 , 中药组(A+B+C)总存活率
为 50.0%,高于化疗组 0%(P<0.01);A组存活率虽高于 D组 , 但无显著性意义(P>0.05);B组和 C组生存率均
明显高于 D组(P<0.05或 P<0.01)。中药组的瘤体积和瘤指数与化疗组相比无明显差异(P>0.05)。经中药治
疗的癌鼠肝内转移少于化疗组癌鼠(P<0.05)。瘤体积与模型生存时间负相关 , 与脾指数正相关(P<0.01)。
PTEN蛋白表达强度以癌旁组织最高 ,癌组织最低 , 正常肝组织次之(P<0.01)。中药治疗相对于 FT207化疗而言
可明显增加 PTEN蛋白的表达强度 ,中药组组间比较提示中浓度组效果最好(P<0.05或 P<0.01),低浓度和高浓
度差别不大(P>0.05)。结论:本方能延长实验癌鼠的生存时间 , 减少癌灶的肝内转移 , 肿瘤体积过大是瘤鼠的主
要死因 , 其治疗肝癌的部分机制可能是通过增强 PTEN蛋白表达来实现的。
关键词　复方中药;裸鼠肝癌模型;生存时间;肝内转移;PTEN
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)11-1417-05
StudyofAntitumousEfectoftheComplexPrescriptionofChinese
CrudeDruginAthymicMicewithHCC
SUNBao-guo, CHENZe-xiong, ZHANGShi-jun, LIUYong-dong, HUANGHong-zhong, YINLi-rong
(TheFirstAfiliatedHospitalofSunYat-senUniversity, Guangzhou510080, China)
Abstract　Objective:ToresearchthetreatmenteffectofacomplexprescriptionofChinesecrudedruginBALB/cathymicmice
Methods:48 maleBALB/cathymicmousemodelswerebuiltbyBel-7402 withanindirectmethod.After24 hoursofpostoperation,
theyweredistributedrandomlyinto4 groupswhichweretreatedbyintragastricadministrationwithcomplexprescriptionofChinese
crudedrugofdiferentdensityasthelow, middle, highandFT207(Tegafur)for4weeks.Atlast, athymicmicewereputtodeathand
survialtime, volumeoftumors, exponentoftumorsandthetumormetastasisinliverswereobserved;andPTENwasdetectedinhepatic
tissue, latero-cancertissueandcancertissuebyimmunohistochemistry.Results:4 weekslater, thetotalsurvivalrateintreatment
group(A+B+C)was50% andmorehigherthanthecontrolgroup(0%)treatedbyFT207, P<0.01.ThesurvivalrateingroupA,
B, CwashigherthangroupD, exceptgroupA, therewassignificantdifferences, P<0.05 or0.01.Andnodiferenceswereobserved
betweenthetreatmentgroupsandthecontrolgroupinvolumeoftumorsandexponentoftumors, P>0.05.Tumormetastasisinlivers
ofthetreatmentgroupislessthanthecontrol s, P<0.05.Negativecorrelationbetweenvolumeoftumorsandsurvivaltime, positive
correlationbetweentumorsvolumeandspleenexponentwereobserved, P<0.01.Theresultofimmunohistochemistryrepresentedthat
theintensityofPTENinlatero-cancertissuewasthehighest, andthenthehepatictissue, thelowestwascancertissue, P<0.01.It
alsorepresentedthattheintensityofPTENintreatmentgroups(A, B, C)wasmorehigherthanthecontrolgroup(D), andgroupBwas
thehighestinthetreatmentgroups, P<0.05 orP<0.01.However, therewasnosignificantstatisticdifferencebetweengroupAand
groupC, P>0.05.Conclusion:ThiscomplexprescriptionofChinesecrudedrugcanprolongthesurvivaltimeanddecreasetumorme-
1417中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月