全 文 ：第４４卷　第４期
２０１６年４月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４４ Ｎｏ．４
Ａｐｒ．２０１６
网络出版时间：２０１６－０３－１４　０８：４５ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１６．０４．０１８
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１６０３１４．０８４５．０３６．ｈｔｍｌ
天名精内酯酮多克隆抗体的制备
　［收稿日期］　２０１４－０７－１６
　［基金项目］　国家自然科学基金项目（３１２７２０７４）；陕西省自然科学研究计划项目（２０１２ＪＱ３００４）；中央高校基本科研业务费专项
（ＺＤ２０１２００４）
　［作者简介］　何泽瑜（１９９０－），男，云南勐腊人，在读硕士，主要从事农药毒理学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｋｙｈｕｇｈ２０１２＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
　［通信作者］　冯俊涛（１９６７－），男，河南登封人，教授，博士，主要从事生物农药及植物保护研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｔｆｅｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
何泽瑜，韩立荣，刘雪茹，冯俊涛，张　兴
（西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心，陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】合成并鉴定天名精内酯酮人工抗原，制备天名精内酯酮多克隆抗体，为天名精内酯酮作用靶
标的免疫化学定位奠定基础。【方法】通过天名精内酯酮４位羰基和盐酸氨基脲氨基的亲核加成反应制备半抗原天
名精内酯酮缩氨基脲（ＣＮ），使用 ＭＳ和 ＮＭＲ对其结构进行鉴定；采用戊二醛法将半抗原和载体蛋白牛血清蛋白
（ＢＳＡ）和卵清蛋白（ＯＶＡ）偶联，合成天名精内酯酮免疫原（ＣＮ－ＢＳＡ）和包被原（ＣＮ－ＯＶＡ），采用紫外吸收扫描法、红
外光谱法对免疫原及包被原进行鉴定；用制备好的免疫原免疫健康ＢＡＬＢ／ｃ小鼠获得天名精内酯酮多克隆抗体，通
过间接非竞争ＥＬＩＳＡ法测定其效价。【结果】成功制备了天名精内酯酮免疫原（ＣＮ－ＢＳＡ）和包被原（ＣＮ－ＯＶＡ），获得
了效价为１２８　０００的天名精内酯酮多克隆抗体。【结论】成功制备了天名精内酯酮多克隆抗体。
［关键词］　天名精内酯酮；半抗原；人工抗原；酶联免疫吸附分析
［中图分类号］　Ｒ３９２．１１ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１６）０４－０１２９－０６
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ
ＨＥ　Ｚｅ－ｙｕ，ＨＡＮ　Ｌｉ－ｒｏｎｇ，ＬＩＵ　Ｘｕｅ－ｒｕ，ＦＥＮＧ　Ｊｕｎ－ｔａｏ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｎｇ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｂｉｏｒａｔｉｏｎａｌ　Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ
Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ，ａｎｄ　ｐｒｅ－
ｐａｒｅｄ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｙ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ　ａｎｄ　ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃ－
ｔｅｄ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｈａｐｔｅｎ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ　ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ＭＳ　ａｎｄ　ＮＭＲ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｔｈｅｎ，
ｔｈｅ　ｈａｐｔｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｔｏ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ａｎｄ　ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍ－
ｍｕｎｏｇｅｎ（ＣＮ－ＢＳＡ）ａｎｄ　ｃｏａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＮ－ＯＶＡ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｃｏａｔ－
ｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＵＶ　ａｎｄ　ＩＲ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ．ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＮ－ＢＳＡ　ａｎｄ　ｐｏｌｙ－
ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｓｅｒａ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｎｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ－
ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｈａｐｔｅｎ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ（ＣＮ－ＢＳＡ）ａｎｄ　ｃｏａｔｉｎｇ　ａｎ－
ｔｉｇｅｎ（ＣＮ－ＯＶＡ）ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　１２８　０００．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃａｒ－
ａｂｒｏｎｅ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃａｒａｂｒｏｎｅ；ｈａｐｔｅｎ；ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ；ＥＬＩＳＡ
　　天名精内酯酮是卡拉布烷型倍半萜内酯类化合
物，最早于１９６４年从天名精属植物天名精（Ｃａｒｐｅ－
ｓｉｕｍ　ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）的果实中分离得到［１］，并表现出
较好的医用生物活性［２－４］。西北农林科技大学无公
害农药研究服务中心前期对天名精内酯酮农用生物
活性的研究工作表明，天名精内酯酮是一种优秀的
广谱抑菌活性物质，对小麦全蚀病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏ－
ｍｙｃｅｓ　ｇｒａｍｉｎｉｓ　ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、小麦纹枯病菌（Ｒｈｉ－
ｚｏｃｔｏｎｉａ　ｃｅｒｅａｌｉｓ）、辣椒疫霉病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
ｃａｐｓｉｃｉ　Ｌｅｏｎｉａｎ）和番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）
等１２种病原菌均具有较好的抑制活性［５］；以其为先
导，通过结构改造，衍生合成出酯类［６］、肟酯［７］和腙
类［８］等一系列化合物，这些化合物中大部分均表现
出较强的抑菌活性；对作用机理的初步探索发现，天
名精内酯酮可抑制病原菌线粒体呼吸电子传递链复
合酶的活性，从而影响病原菌的生物氧化过程［９］，但
其具体的作用靶标仍不明确，这严重阻碍了天名精
内酯酮的开发利用。
免疫分析作为作用机理研究的重要手段之一，
已成功应用于苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
伴胞晶体蛋白作用靶标的定位［１０－１２］。同时，农药免
疫分析还应用于一些除草剂和杀菌剂作用机理的研
究，如Ｙｏｕｎｇ等［１３］利用免疫荧光显微技术确定了苯
酰菌胺对辣椒疫霉菌微管骨架的破坏作用，Ｔｒｅｓｃｈ
等［１４］利用免疫化学定位技术证明高效麦草氟甲酯
对微管组装具有抑制作用。本研究以天名精内酯酮
为原料合成天名精内酯酮人工抗原，通过免疫
ＢＡＬＢ／ｃ小鼠获得多克隆抗体，旨在为天名精内酯
酮作用机理的研究提供技术手段。
１　材料与方法
１．１　材　料
仪器：核 磁 共 振 谱 仪 （Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ　５００
ＭＨｚ）、红外光谱仪（Ｎｉｃｏｌｅｔ　Ａｖａｔａｒ　３３０ＦＴ－ＩＲ）、紫
外可见分光光度计（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ３３１０）、酶标仪
（ＴＥＣＡＮ　Ｓｕｎｒｉｓｅ）、 高 速 冷 冻 离 心 机
（ＭＩＫＲＯ２２Ｒ）、冻 干 机、超 纯 水 净 化 仪 （Ｄ８６１１
Ｂｒａｎｓｔｅａｄ）、洗 板 机 （Ｔｈｅｒｍｏ　ＷＥＬＬＷＡＳＨ
ＰＬＵＳ）、液质联用仪（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）。
试剂：天名精内酯酮（由西北农林科技大学无公
害农药研究服务中心提供）、牛血清蛋白（ＢＳＡ，Ｓｉｇ－
ｍａ）、卵清蛋白 （ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ）、弗氏完全佐 剂
（ＦＣＡ，Ｓｉｇｍａ）、弗氏不完全佐剂（ＦＩＣＡ，Ｓｉｇｍａ），四
甲基联苯胺（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ分装进口）、辣根过氧化
物酶标记羊抗鼠ＩｇＧ（ＨＲＰ－ＩｇＧ，北京康维）、盐酸氨
基脲、无水乙酸钠、无水乙醇、戊二醛、Ｎ、Ｎ－二甲基
亚砜均为分析纯。试验动物为６周龄的ＢＡＬＢ／ｃ小
鼠（购于西安交通大学实验动物中心）。
１．２　方　法
１．２．１　天名精内酯酮半抗原的合成　参照李江
华［１５］的方法并做适当的改动，具体合成路线见图１。
图１　天名精内酯酮半抗原的合成路线
Ｆｉｇ．１　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｒｏｕｔｅ　ｆｏｒ　ｈａｐｔｅｎ　ｏｆ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ
　　向１．２ｍｍｏｌ盐酸氨基脲水溶液中加入１．４
ｍｍｏｌ乙酸钠，在搅拌条件下，向混合物中加入含有
１ｍｍｏｌ天名精内酯酮的甲醇溶液，６０℃下水浴反
应。出现大量白色沉淀后（约４ｈ）终止反应。静置
冷却，抽滤。用甲醇和水混合溶剂重结晶，得白色固
体物质，并用ＮＭＲ和 ＭＳ进行结构鉴定。
１．２．２　天名精内酯酮人工抗原的合成和鉴定　采
用戊二醛法将带有游离氨基的天名精内酯酮半抗原
和载体蛋白ＢＳＡ和ＯＶＡ偶联［１６－１７］，制备天名精内
酯酮人工抗原，具体如图２所示。
　　将２０ｍｇ牛血清蛋白溶于２ｍＬ　ｐＨ＝７．４的
ＰＢＳ（磷酸盐缓冲溶液）中，缓慢滴加１０ｍｇ半抗原
天名精内酯酮缩氨基脲（ＣＮ）溶液和９０μＬ　２５％戊
二醛溶液。室温下搅拌反应４ｈ后，取出反应物，用
ＰＢ（磷酸缓冲溶液）于４℃下透析３ｄ。透析完毕
后，冷冻干燥，－２０℃保存，即得免疫原ＣＮ－ＢＳＡ。
用同样的方法制备包被原ＣＮ－ＯＶＡ。
使用红外光谱法［１８］和紫外吸收扫描法［１９］鉴定
人工抗原。
０３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
图２　天名精内酯酮人工抗原的合成路线
Ｆｉｇ．２　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｒｏｕｔｅ　ｆｏｒ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｃａｒａｂｒｏｎｅ
１．２．３　天名精内酯酮多克隆抗体的制备　参照张
静［２０］的方法免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。用生理盐水稀释
免疫原至４００μｇ／ｍＬ，用等体积的弗氏完全佐剂
（ＣＦＡ，首次免疫时使用）或弗氏不完全佐剂（ＦＩＣＡ，
加强免疫时使用），采用涡旋振荡法乳化制备免疫原
乳剂。选取３只健康的６周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，用制
备好的免疫原乳剂按照表１的方法免疫小鼠。取血
前３ｄ，冲击免疫。摘除眼球取血，并用硫酸铵／辛酸
沉淀法［１７］纯化抗血清，向抗血清中加入终浓度为
０．０１％的叠氮钠，分装，－２０℃保存。
表１　小鼠免疫方案
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ
操作
Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ
免疫时间／ｄ
Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｄａｔａ
佐剂
Ａｄｊｕｖａｎｔ
免疫剂量／（μｇ·只－１）
Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｄｏｓｅ
免疫部位
Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ
首次免疫Ｉｎｉｔｉａｌ　ｉｍｍｕｎｅ　 ０ ＣＦＡ　 ２００ 背部皮下Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ
第一次加强免疫Ｓｅｃｏｎｄ　ｉｍｍｕｎｅ　 １４ ＦＩＣＡ　 ２００ 背部皮下Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ
第二次加强免疫 Ｔｈｉｒｄ　ｉｍｍｕｎｅ　 ２８ ＦＩＣＡ　 ２００ 背部皮下Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ
断尾取血测效价 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｔｅｒ　 ３６ － － －
冲击免疫Ｌａｓｔ　ｉｍｍｕｎｅ　 ５２ － ４００
腹腔注射
Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
　　注：“－”表示未加佐剂或未注射免疫原。
Ｎｏｔｅ：“－”ｍｅａｎｓ　ｎｏ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｏｒ　ｎｏ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．
１．２．４　抗血清效价的测定　使用间接非竞争
ＥＬＩＳＡ 法测定抗血清效价［２１］。用质量浓度为５
μｇ／ｍＬ的包被原包被酶标板，１００μＬ／孔，４℃过夜，
用ＰＢＳＴ（含０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０ＰＢＳ溶液）洗板３
次；加入质量分数１％ ＯＶＡ 溶液封闭１ｈ，２００
μＬ／孔，再次洗板；以４　０００倍为起点，倍比稀释抗血
清，加入相应酶标板孔内，１００μＬ／孔，每个质量浓度
２个平行孔，并设置空白孔和阴性对照孔，３７℃孵育
１ｈ，洗板；加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠ＩｇＧ
（１∶３　０００），１００μＬ／孔，３７℃孵育１ｈ，洗板；加入
ＴＭＢ（四甲基联苯胺，ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）底物溶
液显色１０ｍｉｎ，１００μＬ／孔；加入２ｍｏｌ／Ｌ的 Ｈ２ＳＯ４
终止反应，５０μＬ／孔。于４５０ｎｍ下用酶标仪测定
ＯＤ值。以待测孔 ＯＤ值（Ｐ）／阴性对照孔 ＯＤ值
（Ｎ）≥２．１（即Ｐ／Ｎ≥２．１）的最大稀释倍数作为抗
血清的最终效价。
２　结果与分析
２．１　天名精内酯酮半抗原结构的鉴定
通过 ＭＳ和 ＮＭＲ对天名精内酯酮半抗原，即
天名精内酯酮缩氨基脲（ＣＮ）的结构进行鉴定，结果
如下。
１　Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ：６．２７（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｈ－１３），５．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ－
１３），４．７９～４．８４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－８），３．１６～３．２２（１Ｈ，
ｍ，Ｈ－７），２．３２～２．３７（２Ｈ，ｍ，Ｈ－３），２．２５～２．２８
（２Ｈ，ｍ，Ｈ－２），１．８６（３Ｈ，ｓ，Ｈ－１５），１．４８～１．５５
（２Ｈ，ｍ，Ｈ－９），１．１２（３Ｈ，ｓ，Ｈ－１４），０．９１～０．９８
（２Ｈ，ｍ，Ｈ－６），０．４７～０．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５），０．３７～
０．４１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１）。
１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ：１７０．４５（Ｃ－１２），
１５７．８５（Ｃ－４），１４９．９７（Ｃ－１６），１３９．０３（Ｃ－１１），１２２．６１
（Ｃ－１３），７５．５９（Ｃ－８），３８．７６（Ｃ－３），３７．６８（Ｃ－７），
３７．３１（Ｃ－９），３４．４０（Ｃ－１），３０．７５（Ｃ－６），２５．９３（Ｃ－２），
２３．０２（Ｃ－５），１８．３８（Ｃ－１５），１７．１４（Ｃ－１０），１５．４１（Ｃ－
１４）。
ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ：３０６．１５ Ｃ１６ Ｈ２３ Ｏ３Ｎ３ （［Ｍ ＋
Ｈ］＋）。
２．２　天名精内酯酮人工抗原的鉴定
采用紫外吸收扫描法和红外光谱法对半抗原－
载体蛋白偶联物进行鉴定，结果如图３～６所示。由
图３和４可知，载体蛋白ＢＳＡ和ＯＶＡ的最大紫外
１３１第４期 何泽瑜，等：天名精内酯酮多克隆抗体的制备
吸收波长出现在２７８ｎｍ处，半抗原在２３５～２９５ｎｍ
未发现明显的特征吸收峰，而经戊二醛法偶联合成
的人工抗原ＣＮ－ＢＳＡ和ＣＮ－ＯＶＡ的最大吸收波长
分别出现在２６９ｎｍ和２６７ｎｍ处。２种人工抗原
ＣＮ－ＢＳＡ和ＣＮ－ＯＶＡ的紫外吸收光谱是半抗原天
名精内酯酮缩氨基脲与载体蛋白吸收光谱的整合，
表明半抗原和载体蛋白偶联成功。
由图５可以看出，ＣＮ－ＢＳＡ的红外图谱中包含
了载体蛋白ＢＳＡ的特征吸收谱带，如１　６５５ｃｍ－１处
的ＢＳＡ酰胺谱带Ⅰ和１　５４３ｃｍ－１处的酰胺谱带Ⅱ，
以及２　９２９ｃｍ－１处较弱的－ＣＨ２－吸收。同时在
ＣＮ－ＢＳＡ的红外光谱中还存在半抗原ＣＮ 和ＢＳＡ
偶联后的１　４３９ｃｍ－１处的－ＣＨ２－的δＣＨ吸收，以及
１　７２０ｃｍ－１处的半抗原分子的羰基吸收，由此可判
断免疫原ＣＮ－ＢＳＡ合成成功。由图６可以看出，包
被原ＣＮ－ＯＶＡ的红外图谱中包含了载体蛋白ＯＶＡ
的特征吸收谱带，如１　６５３ｃｍ－１处的酰胺谱带Ⅰ和
１　５３９ｃｍ－１处的酰胺谱带Ⅱ，以及偶联后的１　４３９
ｃｍ－１处－ＣＨ２－的δＣＨ吸收，１　７２４ｃｍ－１处的半抗原
分子的羰基吸收，由此表明包被原ＣＮ－ＯＶＡ合成成
功。
结合上述２种鉴定方法，可以确定半抗原和载
体蛋白偶联成功，合成出了免疫原ＣＮ－ＢＳＡ和包被
原ＣＮ－ＯＶＡ。
图３　半抗原ＣＮ、免疫原ＣＮ－ＢＳＡ和载体
蛋白ＢＳＡ的紫外光谱扫描图
Ｆｉｇ．３　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ
ＣＮ，ＣＮ－ＢＳＡ　ａｎｄ　ＢＳＡ
图４　半抗原ＣＮ、包被原ＣＮ－ＯＶＡ和
载体蛋白ＯＶＡ的紫外光谱扫描图
Ｆｉｇ．４　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ
ＣＮ，ＣＮ－ＯＶＡ　ａｎｄ　ＯＶＡ
图５　载体蛋白ＢＳＡ与免疫原ＣＮ－ＢＳＡ的红外光谱扫描图
Ｆｉｇ．５　ＩＲ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ＢＳＡ　ａｎｄ　ＣＮ－ＢＳＡ
２．３　抗血清效价的测定
使用免疫原ＣＮ－ＢＳＡ冲击免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠
后３ｄ，摘除眼球取血，纯化后获得抗血清，进行适当
稀释后用酶标仪测定其在４５０ｎｍ波长处的ＯＤ值，
确定抗血清效价，结果如表２所示。由表２可知，经
免疫原ＣＮ－ＢＳＡ免疫后的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠对半抗原
ＣＮ产生了较好的免疫应答，而当抗血清稀释至
１２８　０００倍时，Ｐ／Ｎ 值为２．７２９＞２．１，即获得的抗
２３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
血清效价为１２８　０００。较高效价抗血清的获得表明 人工抗原的成功合成和多克隆抗体的成功制备。
图６　载体蛋白ＯＶＡ与包被原ＣＮ－ＯＶＡ的红外光谱扫描图
Ｆｉｇ．６　ＩＲ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ＯＶＡ　ａｎｄ　ＣＮ－ＯＶＡ
表２　抗血清效价的测定结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｕｍｍａｒｙ　ｏｆ　ｔｉｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｓｅｒａ
血清稀释倍数
Ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
ＯＤ值ＯＤ　ｖａｌｕｅ
待测血清
Ｔｅｓｔｅｄ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
阴性对照
Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ Ｐ
／Ｎ
４　０００　 １．５４４　 ０．２９８　 ５．１８１
８　０００　 １．２１７　 ０．２６２　 ４．６４５
１６　０００　 ０．９４４　 ０．２３４　 ４．０３４
３２　０００　 ０．７１７　 ０．２１２　 ３．３８２
６４　０００　 ０．６３２　 ０．１９１　 ３．３０８
１２８　０００　 ０．４５３　 ０．１５９　 ２．７２９
２５６　０００　 ０．３０１　 ０．１５８　 １．９０５
５１２　０００　 ０．２２３　 ０．１５８　 １．１４１
３　讨　论
３．１　半抗原和载体蛋白偶联位点的选择
通常小分子半抗原不具有免疫原性，必须与载
体蛋白偶联形成人工抗原，借助载体蛋白的Ｔ细胞
表位间接诱导Ｂ细胞激活、分化增殖，产生针对半
抗原分子的特异性抗体［２２］。研究表明，相同的半抗
原分子，不同的偶联位点所形成的人工抗原的空间
结构不同，即与载体结合后产生的人工抗原表面所
暴露出的抗原决定簇不同，导致产生的抗体在效价、
亲和力和特异性上均存在差异［２３］。根据免疫系统
通常对载体远端结构识别能力最强，而对连接位点
部分特异性较弱的原则［２４］，要制备高效价和高特异
性的抗体，半抗原分子中的偶联位点应远离半抗原
分子的特征结构和官能团（如苯环或杂环等），使半
抗原分子特征结构部分得以充分暴露，易于被动物
免疫系统识别，同时还可避免载体蛋白对半抗原分
子特征结构的屏蔽作用。在选择偶联位点时还应避
免对半抗原分子的电子分布的影响［２３］。本试验以
半抗原天名精内酯酮缩氨基脲１６位Ｃ作为偶联位
点，该偶联位点的选择远离了天名精内酯酮特征结
构α－亚甲基－γ－丁内酯环结构，对天名精内酯酮的电
子分布影响较小，易于免疫系统对该特征结构的识
别，从而产生高效价和高特异性的抗体，效价
１２８　０００抗血清的获得，证明了该设计思路的合理
性。
３．２　免疫分析是鉴定人工抗原的必需步骤
人工抗原的制备是为了能够引起动物的免疫反
应，从而获得能识别半抗原分子的高特异性和高效
价的抗体，因而人工抗原是否合格的评判标准应该
为是否有特异性抗体产生。然而，通常采用的人工
抗原的鉴定方法有ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法、红外光谱法、紫
外吸收扫描法、同位素标记法等［２５］，但这些方法均
仅能证明半抗原和载体蛋白是否成功偶联，并不能
３３１第４期 何泽瑜，等：天名精内酯酮多克隆抗体的制备
最终确定所制备的人工抗原是否能够引起动物的免
疫反应从而获得满足要求的抗体。故除了要使用上
述检测方法确定偶联是否成功外，还必须进一步使
用免疫检测法对人工抗原的质量进行评价。本试验
采用红外光谱法和紫外吸收扫描法２种方法对免疫
原和包被原进行鉴定，证明半抗原和载体蛋白偶联
成功，并使用间接非竞争ＥＬＩＳＡ法测定了抗血清的
效价，高效价抗血清的获得证明了人工抗原的成功
制备。
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