全 文 ：第 25 卷 第 1 期 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 Vol.25, No.1
2007 年 2 月 J. Radiat. Res. Radiat. Process. February 2007
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中国科学院西部之光基金（XL050616）资助
第一作者：董喜存，男，1974 年 3 月出生，1998 年毕业于新疆石河子大学，现为中国科学院近代物理研究所博士研究生,主
要从事辐射生物学的研究
收稿日期：初稿 2006-09-15，修回 2006-11-27
用随机扩增多态性 DNA 技术对重离子辐照大丽花
花色突变体的初步研究
董喜存 1,2 李文建 1 余丽霞 1 周利斌 1 马 爽 1,2 颉红梅 1
1（中国科学院近代物理研究所 兰州 730000）
2（中国科学院研究生院 北京 100049）
摘要 品系为“大雪青”的大丽花幼枝，经兰州重离子加速器提供的 80MeV/u 12C6+束辐照后，种植在甘肃
省定西市临洮新兴花卉公司基地。辐照 8Gy 的幼枝有一株花色突变体，用随机扩增多态性 DNA（Random
amplified polymorphic DNA，RAPD）技术对突变体和野生型进行检测分析。琼脂糖凝胶电泳结果表明，所用
的 10 条引物中，有 7 条引物共扩增出 78 条带，其中 5 条引物扩增出了 11 条多态性片段，从而在 DNA 水平
上证实了两者之间存在着差异，为进一步探讨重离子诱变机理打下基础。
关键词 碳离子束，花色突变体，大丽花，随机扩增多态性 DNA
中图分类号 Q691.2 , Q691.8, Q319+.3

大丽花（Dahlia pinnata Cav）是菊科大丽花属
的观赏植物，其花型各异，花色丰富，花朵硕大，
品种甚多。大丽花具有多倍性和杂合性，辐照后能
引起花色基因的广泛变异，是非常有希望的突变育
种植物。
植物诱变育种方式包括物理诱变和化学诱变。
而物理诱变简单实用、效果明显、应用广泛。物理
诱变法主要包括紫外线、X 射线和 γ 射线，而重离
子辐照是寻求新的物理诱变源的一种尝试[1]。重离
子束具有高传能线密度（Line energy transfer，LET）、
尖锐的电离峰（Bragg 峰）及低氧增比，并可精确
控制入射深度和部位。重离子束用于诱变育种，有
望在轻损伤前提下获得较高的突变率和较宽的突变
谱[2]。本工作用兰州重离子加速器提供的中能碳离
子束照射大丽花幼枝，以改良一些当地主栽品种，
创造出其它育种方式难以获得的新的基因型。
利用分子标记技术在分子水平上鉴定植物突变
体、检测基因组结构、建立植物基因图谱，在植物
育种中是极其重要的。随机扩增多态性 DNA
（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技
术可用于 DNA 损伤和变异的检测[3]。RAPD 技术是
Williams 等[4]采用随机核苷酸序列为引物，扩增基
因组 DNA 的随机片断的分子标记技术，即以一个
寡聚核苷酸序列（通常为 10 碱基）为引物，对基因
组 DNA 随机扩增，从而得到多态性图谱作为遗传
标记的方法。RAPD 技术在 DNA 多态性检测应用
中有简便、快速、准确、灵敏度高等特点，受到广
泛重视，已在鉴定突变体和野生型多态性方面（如
大豆[3]、苜蓿[5]、日本扁柏等[6]植物）得到广泛应用。
本文用RAPD技术研究大丽花野生型和花色突变体
基因组之间的变异情况，旨在筛选出与花色目标性
状连锁的 RAPD 标记，从而为分子标记辅助花色方
向的育种和花色相关基因的定位、克隆奠定初步基
础，也为分子水平上探讨重离子诱变育种机理提供
依据。
1 材料和方法
1.1 材料
选用品系为“大雪青”的大丽花幼枝为实验材
料，用兰州重离子加速器的 80MeV/u 12C+6 离子束，
2005 年 3 月进行 2、4、6、8、10Gy 照射，照射后
立即扦插育苗，2005 年 4 月底移栽于甘肃省定西市
临洮新星花卉公司的种植基地。8Gy 照射株有一花
色突变体：正常植株为淡紫色，主生长点未消失，
而突变体同一株上出现淡紫色和粉红色，且主生长
点消失（见图 1）。
第 1 期 董喜存等：用随机扩增多态性 DNA 技术对重离子辐照大丽花花色突变体的初步研究 63






Fig.1 Dahlia flower color mutant (right, the arrow) induced
by 12C6+ ion irradiation, and the control (left, wild
dahlia)
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 大丽花基因组 DNA
的提取参照文献[7]方法并稍作修改。
1.2.2 RAPD-PCR 分析 参考文献[3]—[6]在苜蓿、
大豆、日本扁柏中成功进行 RAPD 扩增的方法，设
计了 10 条引物，由上海生物工程中心合成，记为
P-1 到 P-10，其碱基顺序及特性见表 1。Taq 酶、
DL2000 和 dNTP 均购自大连宝生物公司。
Table 1 Primers with corresponding DNA sequences
(10 bases) and characters
Primer Sequence(5′-3′) GC / %
P-1 GTTTCGCTCC 60
P-2 TGGGGGACTC 70
P-3 CTGCTGGGAC 70
P-4 GGACCCTTAC 60
P-5 CAGGCCCTTC 70
P-6 AGTCAGCCAC 60
P-7 GGTCCCTGAC 70
P-8 GGGTAACGCC 70
P-9 GTTGCGATCC 60
P-10 GGACCCAACC 70

采用 20μL 的 PCR 反应体系，内含：10mmol/L
Tris-HCL (pH8.3)，10mmol/L 的 KCl，2mmol/L
MgCl2，100μmol/L 的 dNTP，0.2μmol/L 引物，40 ng
模板 DNA，0.5U Taq 酶。
PCR 扩增程序：94℃ 5min，94℃ 1min，36℃
1min，72℃ 1min，45 个循环后，72℃ 10min，4℃
10min。扩增产物经 1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，
并用凝胶成像系统观察照相。
1.2.3 统计分析 随机扩增 DNA 片段的相似性，
据 Jaccard 公式[8]，相似性系数
F＝2Nxy / Nx + Ny
式中，Nx 和 Ny为 X 和 Y 个体拥有的 RAPD 标
记数，Nxy 为两样品共同具有的 RAPD 标记数，遗
传距离 D＝1－F。
2 结果与讨论
2.1 基因组 DNA 的质量
从叶片中提取的基因组 DNA 经 1.0%的琼脂糖
凝胶电泳分离见图 2。结果表明，提取的 DNA 具有
较好的完整性，经紫外分光光度计检测，
OD260/OD280约为 1.8。




Fig.2 Electrophoresis (in a 1.0% agarose gel) of the DNA
samples from RAPD of the dahlia leaves
2.2 RAPD 扩增结果
用 10 个引物对大丽花野生型及花色突变株基
因组进行随机扩增，共产生 78 条 DNA 片段，平均
每个引物每个个体产生 3.9 条，其中最多的产生了
10 条，引物 P-1、P-7、P-8 未扩增出任何条带。大
多数片段分子量范围为 250－1000kb。其中 5 个引
物扩增产生了 11 条多态性 DNA 片段。图 3 为 3 个
引物对大丽花野生型及花色突变体的扩增谱。















Fig.3 Amplified band patterns of wild type and flower color
mutant by 3 primers
1) Wild dahlia, 2) The flower color mutant, M:
DL2000. a:p-2; b:p-3; c:p-4 The white arrows indi-
cate the polymorphic bands
64 辐 射 研 究 与 辐 射 工 艺 学 报 第 25 卷

2.3 突变体与野生型的差异程度
为进一步说明突变体与野生型基因组差异的大
小，对所有引物扩增的电泳谱带进行了统计分析，
并按公式计算了相似性系数和遗传距离，结果列于
表 2。
Table 2 Calculated similarity index and genetic distance
Nxy Nx Ny F D
27 38 40 0.692 0.308
3 讨论
离子束诱变开始于离子束和植物体的相互作
用。离子束诱导产生的遗传变异主要是由于 DNA
分子活化基团的离子化，同时离子束诱导了大量的
化学变化。遗传材料主要产生两种重离子辐照效应：
基因突变和染色体断裂[3]。本研究用 10 个随机引物
对大丽花野生型和花色突变株的基因组 DNA 进行
了初步研究，分析了其基因组 DNA 之间的多态性。
结果显示其多态性程度较高，说明突变体的基因组
结构的确发生了变化。但相比之下同源性程度更高，
这是因为花色突变体毕竟是从野生型变化而来。由
一些引物扩增出的分子量相同的条带有强弱的差
异，说明 RAPD 技术在检测突变体基因组变化时的
敏感性不同。RAPD 技术的最大不足是重复性较差，
因此有必要进一步分离、纯化一些特异性条带，克
隆测序，再与美国国家生物技术信息中心（National
Center for Biotechnology Information, NCBI）服务器
与控制花色素代谢的结构基因和调节基因进行序列
比对，以探讨大丽花花色变异和重离子诱变育种的
分子机理。
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Preliminary study on flower color mutant induced by 80MeV/u 12C+6 ions
in Dahlia pinnata Cav using RAPD technique
DONG Xicun1,2 LI Wenjian1 YU Lixia1 ZHOU Libin1 MA Shuang1,2 XIE Hongmei1
1(Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000)
2(Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049)
ABSTRACT Young shoots of Dahlia pinnata Cav (Daxueqing) cultivar were irradiated by 80MeV/u 12C6+ ions.
The as-irradiated shoots were planted in the field of Lintao Flower Corporation in Dingxi City, Gansu Province.
Flower color mutant was induced by 8Gy irradiation. Mutant and wild type of Dahlia pinnata Cav were detected for
their DNA level differences using RAPD (Random amplified polymorphic DNA) method. The spectra of electropho-
resis in agarose gel indicated that among 10 primers used, the 78 bands are produced in 7 primers. Among them 11
polymorphic bands are produced in 5 primers, which substantiated the differences in the DNA level between them.
Mutation mechanism by heavy ion beams will be further studied on basis of the results.
KEYWORDS Carbon ion beam, Flower color mutant, Dahlia pinnata Cav, Random amplified polymorphic DNA
CLC Q691.2, Q691.8, Q319+.3