全 文 ：北方园艺 2009(3):75～ 77 ·试验研究·
第一作者简介:阚雪芹(1982-),女,江苏人 ,硕士研究生,研究方向
为园林植物与生物技术。
通讯作者:谈建中(1957-), 男, 江苏省苏州市人 ,博士, 教授, 现从
事园林植物资源与生物技术方面研究工作。 E-mail:szutjz@ho t-
mail.com。
收稿日期:2008-11-10
大丽菊杂合花色突变体的发现及 RAPD鉴定
阚雪 芹 , 方 向明 , 贾俊 丽 , 郑 必平 , 谈建 中
(苏州大学 城市建设学院,江苏苏州 215123)
　　摘　要:以新发现的大丽菊花色突变体为材料 ,选取10个具有10个碱基长度的随机引物 ,对
5种突变个体的基因组 DNA进行了 RAPD分析。结果表明:10个随机引物共扩增出 152条
DNA条带 ,分子量大小在250～ 1 600 bp之间 ,其中有4个引物的扩增结果中检测到了差异性条
带 ,在DNA水平上初步证实了 5种花色突变体是由于遗传因素导致的稳定变异。
关键词:大丽菊;花色突变体;随机扩增多态性 DNA
中图分类号:S 682.1+9;Q 944.58　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2009)03-0075-03
　　大丽菊(Dahlia pinnata Cav)为菊科大丽菊属多年
生草本植物 ,花朵硕大 ,色泽鲜艳 ,花期长 ,具有很高的
观赏价值 ,是世界名花之一。大丽菊园艺品种多达 3000
多种 ,其植株高矮 、花色 、花型 、花径都有很多变化 ,这与
菊科植物的生物学特性有关。菊属植物(Dendranthe-
ma)是天然异花授粉植物 ,在自然界常有种间杂交现象
发生[ 1] 。并且 ,菊花易发生芽变 ,由芽变育成的新品种
基本都属于花色变异[ 2] 。另一方面 ,随着植物分子生物
学研究技术的进步 ,随机扩增多态性 DNA(Random am-
plified polymorphic DNA , RAPD)技术[ 3] 在植物突变体
鉴定及基因组DNA 分析上的应用受到了广泛重视 ,迄
今为止在兰科等多种植物上已有一系列的相关报
导[ 4-9] 。
试验以新发现的大丽菊杂合花色突变体为材料 ,应
用 RAPD技术对几种突变体基因组 DNA进行了分析 ,
以便在DNA分子水平上鉴定大丽菊花色突变体 ,筛选
与花色变异相关的 RAPD分子标记 ,为研究大丽菊花色
变异机理 、花色相关基因克隆及分子标记辅助育种等提
供新的试验依据。
1　材料与方法
1.1　植物材料
大丽菊原始材料购于苏州市木渎花卉市场 ,从其侧
枝上选取5种不同花色变异的花瓣和叶片为试验材料 ,
分别记为D01、D02 、D03、D04和D05。
1.2　突变体基因组 DNA的提取
参照文献[ 10] 的 CTAB 法提取大丽菊基因组
DNA ,从 5 种花色突变体的侧枝上采取鲜叶 0.1 ～
0.2 g ,洗净晾干后加液氮研磨 ,加入预热的 2%CTAB 提
取缓冲液振荡混匀 ,65℃水浴30～ 40 min(期间振荡4 ～
5次),冷却至室温后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),
置水平摇床处理 15 min ,3 000 r/min离心 10 min ,吸取
水相再加2/3倍体积的异丙醇 ,沉淀并钩取絮状 DNA ,
风干后 TE溶解 ,于-20℃保存备用。
1.3　RAPD分析
1.3.1　随机引物　随机引物购自上海生工生物工程有
限公司 ,均为 10个碱基的寡聚核苷酸 ,供试引物编号及
其序列见表 1。
　　表1　　　RAPD扩增的随机引物及序列
　　Table 1　Random primers and the DNA sequences for RAPD
引物编号
P rimer No.
碱基序列
Base sequence
引物编号
Primer No.
碱基序列
Base sequence
S91 TGCCCGTCGT S115 AATGGCGCAG
S92 CAGCTCACGA S118 GAATCGGCCA
S93 CT CTCCGCCA S176 TCTCCGCCCT
S94 GGATGAGACC S178 TGCCCAGCCT
S95 ACTGGGACTC S179 AATGCGGGAG
1.3.2　RAPD反应与电泳检测　RAPD扩增采用25μL
反应体系:10×PCR buffer 2.5 μL , dNTP 2.5 μL ,10碱
基随机引物(10 μmol/L)1 μL , DNA 模板(50 ng/μL)
1.5μL ,Taq 酶(5 U/μL)0.125μL ,其余用 ddH2O补充
至25μL。RAPD反应参数按照文献[ 10]的方法:94℃预
变性2 min;94℃ 30 s ,34℃2 min ,72℃1 min , 40个循
环;最后 72℃延伸 10 min ,4℃保存。PCR仪为德国 bi-
ometra公司 050-811。RAPD产物的检测:用 1.6%琼脂
糖凝胶在 TAE 缓冲液中 ,50 V 电压下电泳约 60 min。
电泳结束后 ,采用凝胶成像系统(GIS-2007 ,上海天能科
技有限公司)检测分析。
2　结果与分析
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·试验研究· 北方园艺 2009(3):75～ 77
2.1　大丽菊杂合花色突变体的特征
该试验所用的大丽菊原始材料购于苏州市木渎花
卉市场 ,在盆栽植株生长与开花过程中 ,先后在不同侧
枝上发现了5种不同杂合花色的突变体 ,这些花色各异
的花朵是同一植株上经过多次摘心处理后由不同腋芽
发育而形成的 ,其花瓣基色调为紫色—紫红色 ,但花瓣
上部产生不同程度的白色变异 ,外观上花瓣颜色表现出
很大差异(图 1)。
图 1　大丽菊突变体植株上的杂合花色变异
Fig.1　The versicolor f lowers of dahlia mutant
　　注:D01:花瓣紫红色 , 少数花瓣白边;D02:花瓣下部紫色,上部白色;D03:多数花瓣下部紫色 ,上部白色;D04:花瓣紫红色 , 花瓣下部有浅条纹;D05:
花瓣紫色,少数花瓣上部白边。
　　Note:D01:Patals are amaranthine ,and a few of them have w hi te border;D02:The under parts of the petals are purple , the upper part s are w hi te;D03:Many
under parts of the petals are purple , the upside are white;D04:Petals are amaranthine , and the parts have light st ripes;D05:Petals are purple ,and a few of them
have w hite border on the upper side.
2.2　突变体基因组 DNA的提取
从大丽菊叶片中提取的 5 种基因组 DNA , 其
OD260/OD280值都在 1.6 ～ 1.8之间 ,纯度较高。琼脂糖
凝胶电泳(图 2)也显示 ,提取的 DNA 具有较好的完整
性 ,片段较大 ,降解少 ,质量较好 ,符合 RAPD分析的条
件。
M:DNA分子量标记(λ/Hind Ⅲ)
图2　大丽菊基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig.2　Elect rophoresi s of the genomic DNA samples of the dahlia leaves
2.3　RAPD扩增结果
用 10个随机引物对5种大丽菊花色突变株基因组
DNA进行多态性分析 ,结果检测到了 152条 DNA 片
段 ,片段大小多在 250 ～ 1 600 bp范围内 ,平均每个引物
每种材料产生3.04条 ,其中最多的产生了 8条 ,最少的
仅 1条。图3显示了 RAPD分析的部分结果 ,在所用的
10个随机引物中 ,引物 S93 、S94、S95、S115的扩增结果
中检测到了差异性条带 ,5种突变体材料各有1 ～ 2条带
明显缺失 ,显示这些花色突变体的基因组 DNA发生了
某些变化 ,推测这种变化可能与花色变异有关。
3　讨论
植物花的颜色主要由类黄酮 、类胡萝卜素及甜菜色
素类等三大色素决定 ,其中类黄酮色素中的花色素苷是
花瓣的主要色素 ,与花色素苷代谢相关酶类的编码基因
或调节基因的突变都将导致花瓣颜色发生变化 ,而利用
DNA分子标记技术可以在基因组 DNA 水平上鉴别这
种花色突变体是属于遗传变异抑或非遗传变异[ 5 , 7-9] 。
该研究用 RAPD技术对新发现的大丽菊杂合花色突变
株的基因组 DNA进行了初步研究 ,结果在突变体之间
检测到了差异性条带 ,说明5种突变个体的基因组DNA
的确发生了某些变化 ,可能是属于遗传因素导致的稳定
变异。
RAPD扩增的 DNA多态性是基于序列变化的分子
表型 ,从某种意义上反映基因组序列的多态性 ,在突变
体的分子鉴定方面具有快速灵敏的优点 ,但也存在着稳
定性差 、可能产生非基因组DNA扩增的假带等不足[ 7] ,
因此 ,今后仍有必要选择更多的随机引物进行 RAPD分
析 ,并分离和测序获得的特异性条带 ,以便对花色变异
相关的功能基因与分子标记等方面进行深入研究。
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图 3　大丽菊花色突变体 RAPD扩增的差异性条带
Fig.3　The differential band pat terns amplif ied by RAPD of the dahlia f lower color mutants
1:D01;2:D02;3:D03;4:D04;5:D05;M:DNA 分子量标记(λ/ Hind Ⅲ)
The Molecular Identification of a Novel Versicolor Mutant in
Dahlia pinnata Cav Using RAPD Technique
KAN Xue-qin , FANG Xiang-ming , JIA Jun-li ,ZHENG Bi-ping , TAN Jian-zhong
(School of U rban Construction , Soochow University , Soochow , Jiang su 215123 , China)
Abstract:The RAPD analysis of genomic DNA , generated by 10 random primers , 10 nt in every one , discriminated 5
flower color mutants of novel versicolor mutants in Dahlia pinnata Cav.The results showed that 152 bands were ampli-
fied in 10 primers , and each molecular weights range f rom 250～ 1 600 bp.Among them particular bands were produced in
4 primers , which suggested primarily in the DNA level that 5 flower color mutants varied due to the genetic factors.
Key words:Dahlia pinnata Cav;Versicolor mutant;Random amplified polymorphic DNA
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