全 文 ：84 2016 年第 57 卷第 1 期
收稿日期:2015-11-04
基金项目:承德市财政局项目 (CZ2014004)
作者简介:刘晓光 (1980 － ) ，女，河北石家庄人，博士，讲师，从事野生植物资源开发与利用方面的研究，E-mail:zaosy126
@ 126. com。
文献著录格式:刘晓光，徐岩岩，刘璐，等． 山杏初代培养影响因素研究 ［J］． 浙江农业科学，2016，57 (1) :84-86．
DOI:10. 16178 / j. issn. 0528-9017. 20160132
山杏初代培养影响因素研究
刘晓光1，徐岩岩1，刘 璐1，杨晓歌2
(1. 河北民族师范学院 化学系，河北 承德 067000;2. 北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 朝阳 100124)
摘 要:以山杏幼嫩茎尖为外植体，研究在 75%的酒精及 75%酒精和升汞不同处理时间下，茎尖的污染率
和成活率，以及不同植物生长调节剂配比下的诱导率和生长情况。结果表明，使用 75%酒精 (20 s) + 0. 1%
HgCl2 (3 min)处理山杏外植体成活率最高;6-BA可有效促进外植体的萌发，1. 2 mg·L
－1时萌发率最高。6-BA
1. 2 mg·L －1与不同浓度的生长素 IBA和 NAA组合，可促进外植体的萌发生长，萌发率最高为 94. 16%。山杏茎
尖外植体初代培养最适宜的培养基为 MS + 6-BA 1. 2 mg·L －1 + IBA 1. 0 mg·L －1。
关键词:山杏;灭菌时间;植物生长调节剂;初代培养
中图分类号:S665. 1 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2016)01-0084-03
山杏 (Prunus sibirica)为蔷薇科杏属灌木或小
乔木，主要分布在黑龙江、内蒙古、河北等地区，
是造林绿化的先锋树种，具有优良的水土保持和防
风固沙功能，同时山杏具有很高的经济价值和药用
价值。目前山杏栽培中的难题是优良品种的利用，
利用组织培养快速繁殖可获得大量与母株性状一致
的无性系组培苗。本研究以山杏幼嫩茎尖为外植体，
用酒精和升汞灭菌处理，探索出最适合的灭菌时间，
筛选出适合山杏外植体灭菌的流程;探究 6-BA浓度
及与 IBA和 NAA浓度组合对初代培养的影响，筛选
出适宜的培养基，为山杏工厂化育苗提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
以山杏的幼嫩茎尖作为外植体，2014 年 7 月
采自承德市冯营子镇野生山杏林。
1. 2 方法
1. 2. 1 材料预处理
将采集后的幼嫩茎尖，剪去多余带有木质部的
枝条，剩下的茎段具有嫩叶且长度为 2 ～ 3 cm，先
用清水冲洗 2 ～ 3 次，再用流水冲洗 30 min，然后
将其放置在超净台上备用。
1. 2. 2 灭菌方式
酒精灭菌方法。选取冲洗好的外植体分别用以
下 5 种方法进行灭菌:质量分数 75%酒精浸泡 5 s;
质量分数 75%酒精浸泡 10 s;质量分数 75%酒精
浸泡 15 s;质量分数 75%酒精浸泡 20 s;质量分数
75%酒精浸泡 30s。灭菌后，分别用无菌水冲洗 3
次，然后将幼嫩茎尖的叶和多余的茎段切取，接种
到 MS培养基上。每个处理接种 30 株，重复 3 次。
接种 8 d 后统计污染率、死亡率、存活率、生长
情况。
升汞灭菌方法。选取山杏幼嫩茎尖作为外植
体，在流水下冲洗 30 min，用最适酒精灭菌时间
进行处理后，无菌水冲洗 3 次，再用 0. 1%升汞
进行灭菌处理。灭菌时间处理分别为:0. 1%
HgCl2 浸 泡 1 min、0. 1% HgCl2 浸 泡 3 min、
0. 1% HgCl2 浸泡 5 min、0. 1% HgCl2 浸泡 7 min;
随后无菌水冲洗 5 次，将幼嫩茎尖接种在 MS 培
养基中。每处理接种 30 株山杏外植体，重复 3
次。20 d后统计污染率、死亡率、存活率、侧芽
萌发率、生长情况。
1. 2. 3 培养基
6-BA基本培养基。采用MS培养基 +蔗糖 30 g·
L －1 +琼脂 g·L －1。采用不同浓度 6-BA 进行处理，
浓度梯度设为 0，0. 4，0. 8，1. 2 mg·L －1，接种
20 d后统计萌芽率、芽萌发天数、生长情况。
6-BA分别与 IBA 和 NAA 组合处理。在对 6-
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BA浓度的考察基础上，将上一步所得到的最适宜
的 6-BA浓度分别与 IBA和 NAA组合处理，IBA和
NAA浓度均设 3 个梯度:0，0. 5，1. 0 mg·L －1。
1. 2. 4 培养条件
培养温度 24 ～ 26 ℃，光照强度设为 2 500 ～
3 000 lx，光暗周期 14 /8 h，空气相对湿度 60% ～
70%，培养基的 pH值 5. 8。
1. 2. 5 数据分析
在培养基中出现各种颜色的菌斑或外植体附近
有黏液状和发酵泡沫状物质或培养基出现浑浊和云
雾状痕迹，这些都视为污染植株。
生长情况的评价标准分 3 个等级:第一等级为
山杏外植体叶色浓绿，长势健壮，有新芽萌发
(+ + +) ;第二等级为组培苗叶色发黄，生长缓慢
(+ +) ;第三等级为嫩叶或茎尖被褐化，茎段是绿
色 (+)。
外植体出现白化现象，不再生长，整株组培苗
全部严重褐化，无生命迹象视为死亡。
用 Excel和 SPSS进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2. 1 酒精灭菌时间对山杏外植体成活率的影响
由表 1 得知，75%酒精对山杏外植体进行灭菌
处理，处理 5 ～ 15 s，山杏外植体成活率逐渐下降，
最低成活率仅 50%。灭菌处理 20 s 时成活率达到
最高，为 93. 3%。灭菌处理 30 s，成活率下降，
为 86. 7%。其原因是随着时间的延长，酒精灭菌
会加大山杏茎尖细胞水分流失，导致山杏茎尖表面
细胞脱水，进而降低茎尖组织生物活性，导致成活
率降低［1］。灭菌 15 s 山杏外植体的死亡率最高，
其次是 5，10 s的灭菌处理，死亡率最低的灭菌处
理是 20，30 s。因为短时间的灭菌处理不能杀死菌
体，导致成活率下降。灭菌处理5 ～ 15 s，山杏茎
尖生长健壮，嫩芽萌发，叶色浓绿。20，30 s的灭
菌处理因为酒精长时间的处理，破坏了茎尖组织细
胞内的生物活性，表现出叶色发黄，生长缓慢的状
态，但不会导致外植体死亡。综合考虑成活率、污
染率、死亡率和生长情况，用 75%酒精灭菌处理
20 s时效果最好。
表 1 酒精灭菌时间对外植体成活率的影响
灭菌时间 /
s
污染率 /% 死亡率 /% 成活率 /%
生长
情况
5 66. 7 ± 14. 91 a 26. 6 ± 6. 66 ab 73. 4 ± 6. 66 ab + + +
10 60. 0 ± 19. 44 a 33. 3 ± 18. 26 ab 67. 7 ± 18. 26 ab + + +
15 68. 3 ± 10. 68 a 50. 0 ± 16. 67 a 50 ± 16. 67 b + + +
20 33. 3 ± 14. 91 a 6. 7 ± 6. 66 b 93. 3 ± 6. 66 a + +
30 33. 3 ± 7. 26 a 13. 3 ± 8. 16 b 86. 7 ± 8. 16 ab + +
注:LSD多重比较，表中同列数据后无相同小写字母表示处理
间差异显著。下同。
2. 2 升汞灭菌时间对山杏外植体成活率的影响
用 75%酒精灭菌 20 s 后，再用 0. 1%升汞处
理。由表 2 可知，灭菌处理 1，3 min 萌芽效果高，
达 26. 7%;灭菌处理 5，7 min 萌芽率较低。灭菌
处理 1 min 污染率最高，达 40%;处理 3，5，
7 min时，外植体污染率效果不显著，污染率最低
为 0%。随处理时间的延长，污染率逐渐下降。山
杏外植体的成活率最高的是灭菌 3 min，成活率达
93. 3%;其次为 1，5 和 7 min。观察中发现，用
0. 1%升汞灭菌处理，山杏茎尖生长状况因升汞的
影响，绝大多数茎尖褐化，经过一段时间后，处理
1，3 min的茎尖，生长状况发生转变，褐化部分长
出新的嫩芽，叶色也转绿，但生长仍缓慢。综合考
虑萌芽率、污染率、成活率、死亡率和生长情况，
用 0. 1%升汞对山杏外植体灭菌，最佳灭菌时间为
3 min。
表 2 升汞灭菌时间对山杏外植体成活率的影响
灭菌时间 /min 萌芽率 /% 污染率 /% 成活率% 死亡率 /% 生长情况
1 26. 7 ± 3. 33 a 40 ± 5. 78 a 60. 0 ± 10. 00 b 40. 0 ± 10. 00 b + +
3 23. 3 ± 12. 02 a 6. 7 ± 3. 33 b 93. 3 ± 6. 67 a 6. 7 ± 6. 67 c + +
5 0 ± 0 ab 0 ± 0 b 23. 3 ± 3. 33 bc 76. 7 ± 3. 33 a +
7 6. 7 ± 3. 33 b 0 ± 0 b 20. 0 ± 5. 80 c 80. 0 ± 5. 80 a +
2. 3 6-BA浓度对山杏外植体生长的影响
在山杏初代培养基上添加不同浓度的细胞分裂
素 6-BA。由表 3 可知，6-BA 浓度为 0 时，其萌芽
率比 0. 4 mg·L －1时的萌芽率高，但前者的萌芽天
数为 8 d，后者萌芽天数为 4 d。空白培养基上外植
体的萌发率为 49. 91%，芽生长缓慢，长势一般;
使用 6-BA处理，随着浓度的升高，腋芽的萌发率
依次升高，分别为 39. 65%，59. 73%，74. 92%，
其中浓度为 1. 2 mg·L －1时萌发率最高，长势最
好。综上，山杏初代培养用 6-BA 处理，最适宜的
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培养基为 MS +1. 2 mg·L －16-BA。
表 3 6-BA浓度对山杏外植体生长的影响
处理
6-BA /
(mg·L －1)
萌芽率 /
%
芽萌发
天数 /d
生长
情况
1 0 49. 91 ± 15. 85 ab 8 + +
2 0. 4 39. 65 ± 11. 10 b 4 + +
3 0. 8 59. 73 ± 17. 65 ab 4 + +
4 1. 2 74. 92 ± 14. 20 a 5 + + +
2. 4 6-BA 与生长素共同作用对山杏初代培养的
影响
在山杏初代培养基上添加 1. 2 mg·L －1 6-BA
与不同的生长素。
由表 4 可知，接种 3 ～ 4 d 时外植体开始萌发，
NAA处理比 IBA 处理的外植体萌发早。20 d 后，
用 6-BA 与 IBA 共同处理的外植体萌发率为
86. 24%，94. 16%;用 6-BA与 NAA共同处理的外
植体萌发率为 83. 43%和 83. 8%，各处理间差异不
显著。4 组处理中外植体均长势良好，30 d 时腋芽
伸长生长明显且部分出现增殖的现象。综上，山杏
初代培养最适宜的培养基为 MS + 6-BA 1. 2 mg·
L －1 + IBA 1. 0 mg·L －1。
表 4 6-BA与生长素共同作用对山杏初代培养的影响
处理
浓度 / (mg·L －1)
6-BA IBA NAA
萌发率 /
%
芽萌发
天数 /d
1 1. 2 0. 5 0 86. 24 ± 9. 05 a 4
2 1. 2 1. 0 0 94. 16 ± 14. 88 a 4
3 1. 2 0 0. 5 83. 43 ± 13. 58 a 3
4 1. 2 0 1. 0 83. 80 ± 6. 82 a 3
3 小结与讨论
本研究以山杏幼嫩茎尖为植株材料，研究了不
同灭菌时间对山杏外植体成活率的影响。结果表明，
用 75%的酒精 (20 s) +0. 1% HgCl2 (3 min)成活
率最高。对山杏外植体进行初代培养时，最适宜的
培养基为MS +6-BA 1. 2 mg·L －1 + IBA 1. 0 mg·L －1，
试验结果各项指标均优于郑可等［2］的研究。
外植体是进行组培时从植物体上切取下来的组
织或器官［3］，通常采用 75%酒精和 0. 1%升汞交叉
对外植体进行灭菌［4-5］。本试验得到的结果与齐高
强等［6］和郭晖
［7］
的研究有所不同，用升汞灭菌的
时间缩短 1 倍，但成活率仍能够达到 93% 以上。
山杏茎尖培养芽的分化多以 MS 培养基为基本培养
基［5］。本试验得到的最佳植物生长调节剂浓度较
其他学者［7-9］研究略高。有研究表明，夏季气温较
高，各类菌的活跃程度较高，污染率也高［10］。但
山杏的新梢萌发快，只定于 3 － 5 月份采样处理，
时间短且任务重。虽本次试验的采样时间在 7 月
份，但试验结果表明，经处理后的山杏茎尖的成活
率、萌发率较高，生长状况良好。因此，为山杏外
植体的培养延长了采样时间，更能够应用于实际
生产。
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(责任编辑:张瑞麟)