全 文 ：第 35 卷　第 5 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol. 35 No . 5
2007 年 5 月 Journal of No rthwest A &F Univer sity(Na t. Sci. Ed.) May 2007
山杏种皮黑色素提取工艺研究*
姚增玉 ,赵　忠 ,史清华 ,李科友 ,朱海兰 ,马希汉 ,马玉花
(西北农林科技大学林学院 ,陕西 杨凌 712100)
[ 摘　要] 　研究了提取溶剂及其浓度 、提取温度和有无氮气保护及提取时间对山杏种皮黑色素提取效果的影
响 ,并对提取的山杏种皮黑色素与人工合成的多巴黑色素的理化性质进行了比较。结果表明 ,该黑色素适宜于用 0. 5
mo l /L NaOH 在 60 ℃下提取 2 次 ,每次 12 h , 提取宜在氮气下进行 ,以防止黑色素的过度氧化。在该工艺条件下 , 经
过酸水解和进一步有机溶剂洗涤及反复沉淀纯化以后 , 可从 5 g 山杏种皮中得到黑色素 237 mg ,得率为 4. 73%;山杏
种皮黑色素中总多酚含量较高 ,约为 262 mg /g 。山杏种皮黑色素与合成多巴黑色素的理化性质非常相似 , 不溶于水
和常见的有机溶剂 , 在 1 mol /L KOH 溶液中完全溶解 , pH 小于 3 时发生沉淀 , 可被 KMnO4 、K 2Cr2O7 、NaClO 和
H2O2 氧化漂白 ,多酚定性反应呈阳性;在紫外 -可见光区没有吸收峰 , 红外光谱中在 3 400 cm - 1附近和 1 650～ 1 620
cm - 1各有一个强的吸收带 。
[ 关键词] 　山杏;种皮;黑色素;提取工艺;理化性质
[ 中图分类号] 　S662. 209. 9 [文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2007)05-0120-07
Isolation of melanin from testae of Prunus ameniaca Linn.
YAO Zeng-yu ,ZHAO Zhong , SHI Qing-hua , LI Ke-you , ZHU Hai-lan ,
MA Xi-han ,MA Yu-hua
(Col leg e o f Forest r y , Northwest A &F Univer sity ,Yang lin g , Shaanxi 712100 , Ch ina)
Abstract:Melanin w as ex t racted f rom testae o f Prunus ameniaca f irst and the ef fective ex traction of
melanin w as explored. The result show ed the melanin w as sui table to be ex t racted tw ice w ith 0. 5 mo l /L
NaOH at 60 ℃ fo r 12 h , and the operation should be carried out unde r nit rogen to avoid excessive oxida-
tion. Af ter acid hydro lysis , further purification w ith o rganic solvents and repeated precipitation , 4. 73%
y ield of melanin w as obtained. T he melanin f rom testae of Prunus ameniaca contained highe r total phenolic
content , about 262 mg gallic acid equivalents per g ramme. The phy sicochemical properties o f the melanin
f rom testae o f Prunus ameniaca showed a st rong similarity to the se of synthet ic DOPA melanin. They w ere
insoluble in bo th w ater and common org anic solvents but dissolved only in alkali ,while precipi tated in alka-
line FeCl3 and when pH is below 3 , and w ere bleached in KM nO 4 , K2C r2O7 ,NaClO and H 2O 2 , and produced
a blue colo r w ith FeSO4 / fer ricyanide. In the ult raviolet and visible range o f w aveleng ths the melanin ab-
sorption spectrum represents the decreasing line. The inf rared spect ra had the same st rong abso rption
peaks as the bro ad band at 3 400 cm
- 1
and at 1650 - 1620 cm
- 1 , respectively.
Key words:P runus ameniaca;testae;melanin;iso lation;phy sico chem ical property
　　黑色素(Melanin)普遍存在于生物界 ,是一类 结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总
* [ 收稿日期] 　2006-11-30
[ 基金项目] 　国家林业局“948”项目(2004-4-52)
[ 作者简介] 　姚增玉(1974 -),男 ,陕西定边人 ,在读博士 ,主要从事森林培育研究。
[ 通讯作者] 　赵　忠(1958 -),男 ,甘肃宁县人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事森林培育研究。
称[ 1] ,可为生物体提供结构性强度或保护生物免受
紫外线 、电离辐射 、重金属污染 、低温和高温等环境
胁迫的伤害[ 2] 。黑色素不仅是一类光保护剂 、抗辐
射剂 、螯合剂 、生物抗氧化剂[ 3] 和免疫促进剂[ 4] ,而
且还是一类生物半导体材料[ 5] 。近年来的研究还发
现 ,黑色素具有抗蛇毒[ 6] 、抗癌[ 7] 、抑制艾滋病毒复
制[ 8] 、治疗帕金森症[ 9] 等作用 。因此 ,黑色素在医
药 、化妆品 、食品 、电子等领域有着广泛的应用前景。
目前 ,黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氧化
进行化学合成[ 10] , 也可以从动植物材料中提
取[ 8 , 11] ,还可以利用微生物合成[ 12-13] 。相比而言 ,植
物黑色素安全性较高 ,应用范围更广 ,但生产中仍缺
乏黑色素含量高且具有开发利用价值的原料 。
山杏(Prunus ameniaca Linn. )是我国北方重
要的经济树种和水土保持树种 ,杏仁在各国面包 、糖
果 、饮料等的生产中广泛应用 ,其种皮是杏仁深加工
过程中产生的下脚料。据笔者初步测定 ,其种皮约
占杏仁质量的 5%。国外已有利用此下脚料提取天
然酚类化合物的报道[ 14-18] ,但还未见从中提取黑色
素的研究报道。以山杏种皮为原料提取黑色素可以
变废为宝 ,提高杏仁深加工企业的经济效益 。各种
生物来源的黑色素性质差异很大 ,因此提取方法也
不尽相同 。本研究以山杏种皮为原料 ,以期确定从
中提取黑色素的最佳工艺条件 。
1　材料与方法
1. 1　材　料
去壳杏仁购自陕西省麟游县。带回实验室用热
烫法剥取种皮 ,种皮用自来水冲洗干净 ,摊放在室内
自然干燥后揉碎 ,室温下保存备用。Fo lin-Ciocalteu
试剂和作为标准品的合成多巴(Dihydroxypheny-
lalanine ,DOPA)黑色素购自 Sigma公司(美国),其
他试剂均为分析纯。试验中所用的去离子水在使用
前煮沸 1 ～ 2 h 。
1. 2　山杏种皮中黑色素的提取
1. 2. 1　黑色素提取工艺流程　称取 5. 0 g 山杏种
皮 ,放入 150 mL 锥形瓶中 ,加入 100 mL 去离子水
煮沸 15 min后过滤 ,以除去水溶性杂质和排除材料
中的氧气。向滤渣中加入 75 mL 提取溶剂 ,经过一
段时间提取后 ,用棉布进行粗滤 ,滤液 15 000 g 离
心 30 min ,上清液用 2 mol /L HC1 溶液调 pH =
2. 5 ,使黑色素沉淀 ,室温静置 2 h ,离心分离 ,其沉淀
即为山杏种皮黑色素粗提物。
1. 2. 2　黑色素提取工艺条件优化试验　根据预试
验确定提取溶剂 、温度 、有无氮气保护和提取时间为
影响山杏种皮黑色素提取效果的关键因素。采用单
因素和双因素试验相结合以优化黑色素提取工艺 。
(1)提取溶剂浓度的确定 。以 0. 5 ～ 2. 0 mo l /L
NaOH 水溶液为提取溶剂 ,在 60 ℃下提取 6 h 。
(2)提取温度和氮气保护的确定。以 0. 5 mol /L
NaOH 水溶液为溶剂 ,在空气中或氮气保护下于室
温(25 ～ 30 ℃)和 40 , 60 , 80 , 100 ℃下分别提取 6
h。
(3)提取时间的确定 。以 0. 5 mo l /L NaOH 水
溶液为提取溶剂 ,在氮气保护下提取 6 ～ 36 h 。
1. 3　山杏种皮黑色素的纯化
经过上述提取工艺得到的山杏种皮黑色素粗提
物在 10倍体积的 7 mo l /L HCl溶液中于 100 ℃水
解 2 h ,以除去与之结合的糖类 、蛋白质等[ 19] 。冷却
后 10 000 g 离心分离黑色素颗粒 ,再分别用有机溶
剂(乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮)反复处理洗涤 ,以除去脂
肪 、单宁 、花青素和木质素等杂质[ 8] 。具体做法为:
将山杏种皮黑色素与溶剂按质量体积比 1∶100混
合后振荡 30 min ,然后离心分离 ,每种溶剂重复洗
涤至上清液无色为止。黑色素固体颗粒用 0. 5
mol /L NaOH 水溶液超声辅助溶解并离心 ,上清液
用 2 mol /L HC1 溶液调 pH 至 2. 5 ,使之沉淀 ,离
心 ,所得沉淀再用质量分数 0. 2%氨水溶解 ,离心取
上清液 ,酸化使之沉淀 ,再用质量分数 0. 2%氨水溶
解 ,离心 ,酸化上清液使黑色素沉淀 ,如此反复 4次 ,
以除去低分子质量的多酚 ,提高山杏种皮黑色素的
均一性 。将得到的凝胶状黑色素放入 - 5 ℃的冰箱
中使之冻结 ,然后室温下解冻 ,所得到的颗粒状山杏
种皮黑色素用去离子水洗涤至离心上清液 C1-定性
检测为阴性 ,最后真空干燥。
山杏种皮黑色素溶液参照 Sava 等[ 4] 的方法配
制。将 22 mg 纯化干燥后的黑色素用 10 mL 质量
分数 0. 2%的氨水 ,在氮气保护下超声辅助溶解 ,用
旋转蒸发仪减压抽去氨气 ,直至 pH 值达 7. 5 ,最后
用去离子水稀释至所需浓度。
1. 4　山杏种皮黑色素中总多酚含量的测定
总多酚含量的测定采用 Fo lin-Ciocalteu 法[ 20]
并略有改进 ,其值用没食子酸含量表示(mg /g)。将
1 mL 山杏种皮黑色素溶液 、没食子酸标准溶液或去
离子水(作为空白对照)分别加入 20 mL 试管中 ,然
后加入 5 mL 0. 1 mo l /L Folin-Ciocalteu 试剂摇匀 ,
并在室温下静置 5 ～ 8 min。再加入 4 mL Na2CO3
溶液(75 g /L),摇匀后室温下静置 2 h ,最后 3 000 g
121第 5 期 姚增玉等:山杏种皮黑色素提取工艺研究
离心 10 min ,测定 760 nm 处的吸光度 。
1. 5　山杏种皮黑色素与多巴黑色素理化性质的比较
1. 5. 1　黑色素的光谱分析　紫外 - 可见光光谱用
mini-1240 紫外 - 可见光分光光度仪(日本岛津公
司)分析 ,黑色素溶液浓度为 27 mg /L 。红外吸收光
谱分析采用 KBr 压片法 ,用 Thermo A vatar 330 型
傅里叶红外光谱仪(美国 Nicolet公司)记录。
1. 5. 2　黑色素的定性分析　山杏种皮黑色素定性
鉴定参照前人通用的方法[ 21-23] 。即以在水和常见的
有机溶剂中的溶解性 ,可被 KMnO4 、K2 Cr2O 7 、Na-
ClO 和 H 2O 2等强氧化剂漂白 ,多酚反应呈阳性等
黑色素普遍具有的性质对山杏种皮黑色素进行定性
鉴定 , 并以合成的多巴黑色素作为对照。
1. 6　统计分析
试验采用完全随机设计 ,每一个处理独立重复
3次 。所有试验数据均采用 SAS v 8. 1软件 (美国)
进行分析 。山杏种皮黑色素得率 / %=(黑色素干质
量 /山杏种皮干质量)×100%。
2　结果与分析
2. 1　山杏种皮黑色素提取条件的优化试验
2. 1. 1　提取溶剂浓度对提取效果的影响　黑色素
在生物体内一般与蛋白质 、糖类等其他成分相结合 ,
因此从植物材料中提取黑色素是一个化学过程 。提
取黑色素一般采用碱溶液作为提取溶剂 ,多采用氨
水或 NaOH[ 8 , 24-25] 。经预试验可知 ,山杏种皮黑色
素的提取用氨水作为提取溶剂 ,提取率较低 ,且加热
提取时容易挥发 ,若采用密闭加压提取 ,则操作复
杂 ,因此本研究以不同浓度的 NaOH 溶液为提取溶
剂进行对比研究。由图 1 可见 ,N aOH 浓度对黑色
素得率有极显著影响(P <0. 01),从山杏种皮中提
取黑色素适宜的 NaOH 浓度为 0. 5 mo l /L 。
2. 1. 2　提取温度与氮气保护对提取效果的影响　
由表 1 可知 ,温度对黑色素得率 、纯黑色素干质量 /
　　
粗提物湿质量的比率和总多酚含量均有极显著影响
(P<0. 01)。在本试验所设定的条件下 ,黑色素得
率与温度呈正相关 ,在室温下黑色素几乎不能被提
取出来 ,因此未作进一步分析 。由表 1还可以看出 ,
在温度高于 60 ℃后 ,纯黑色素 /粗提物的比率明显
下降 ,即有较多的杂质被提取出来 ,给进一步纯化带
来不便 。氮气保护对得率 、纯黑色素 /粗提物的比率
(与空气相比)均无显著影响。植物黑色素是一类由
酚类单体组成的大分子物质 ,具有还原性 ,易于被氧
化。前人的研究表明 ,在氧化过程中 ,酚羟基转变为
醌基[ 26] 。因此 ,本试验用测定总多酚含量的方法来
衡量不同提取条件下所得黑色素的氧化程度 。由表
1可以看出 , 40 ℃下有无氮气保护对总多酚含量的
影响无显著差异 ,但 60 ～ 100 ℃时氮气保护可有效
减轻山杏种皮黑色素的氧化程度(P <0. 01)。黑色
素的氧化程度越低 ,抗氧化能力越强[ 3] 。因此 ,综合
考虑得率 、粗提物中杂质含量和氧化程度 3 个方面
认为 ,从山杏种皮中提取黑色素以 60 ℃为宜 ,为了
防止黑色素的氧化 ,应在氮气保护下进行 。
图 1　NaOH 浓度对山杏种皮黑色素得率的影响
Fig. 1　Effect of NaOH concentration on the yield of
melanin from testae o f Prunus ameniaca Linn.
表 1　提取温度与氮气保护对山杏种皮黑色素提取效果的影响
Table 1　Effect of temperature and nitrog en protection on ex tr ac tion of melanin fr om testae of Prunus ameniaca L inn.
提取温度 /℃
T emperatu re
得率 /% Yield 黑色素 /粗提物
Melanin Pu re /crude
总多酚含量 /(mg g - 1)
T otal phenolic conten t
空气
Air
氮气保护
Nit rogen
空气
Air
氮气保护
Nit rogen
空气
Air
氮气保护
Nit rogen
40 1. 44±0. 26 1. 53±0. 27 0. 008±0. 002 0. 009±0. 002 261. 56±4. 66 263. 45±5. 10
60 3. 46±0. 20 3. 75±0. 19 0. 017±0. 001 0. 017±0. 001 229. 04±3. 89 252. 17±7. 87
80 3. 98±0. 31 4. 26±0. 25 0. 015±0. 001 0. 014±0. 001 220. 16±5. 97 251. 79±7. 12
100 4. 61±0. 34 4. 72±0. 34 0. 012±0. 001 0. 012±0. 001 209. 56±5. 49 250. 85±8. 68
　　注:数值为平均值±标准差(n = 3) 。
Note:Valu es are mean±S .D. (n = 3).
122 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 35 卷
2. 1. 3　提取时间对提取效果的影响　图 2 为不同
提取时间下山杏种皮黑色素的得率和总多酚含量。
从图 2可见 ,提取时间对黑色素得率有极显著影响
(P<0. 01)。就得率而言 ,提取时间以 24 h为宜 ,但
反应 12 h 后 ,总多酚含量略有降低 。综合考虑应采
用多次提取的方法 ,即提取 12 h 后更换提取溶剂 ,
再提取 12 h。
2. 1. 4　提取条件优化后的提取效果　以 0. 5 mol /L
NaOH 为提取溶剂 ,在 60 ℃氮气保护下提取 2次 ,
每次 12 h ,从 5 g 山杏种皮中提取得到(237±33)
mg 黑色素 ,得率为(4. 73±0. 66)%,所得山杏种皮
黑色素总多酚含量为(262±1. 28)mg /g 。
图 2　提取时间对山杏种皮黑色素提取效果的影响
──.得率;┄┄.总多酚含量
Fig. 2　Effect of reaction time on ex tr action of melanin
from testae o f Prunus ameniaca Linn.
──. Yield;┄┄. Total pheonolic con tent
2. 2　山杏种皮黑色素的理化性质
2. 2. 1　紫外- 可见光光谱　由图 3可以看出 ,山杏
种皮黑色素的紫外 -可见光光谱(200 ～ 800 nm)和
标准品的合成多巴黑色素非常相似 ,二者的曲线均
随波长的增大而吸光度减小 ,在紫外区和可见光短
波区很宽的波长范围内有较强的吸收 ,在整个扫描
范围内没有明显的吸收峰。但与合成黑色素相比 ,
山杏种皮黑色素在 270 ～ 280 nm 处有一较弱的肩
峰 ,这一肩峰是由水解残留蛋白质中的芳族氨基酸
残基对光的吸收所引起的[ 27-28] 。将吸光度取对数对
波长回归作图可得到一条斜率为负值的直线 ,山杏
种皮黑色素的回归直线斜率为 - 0. 003 9 ,合成多巴
黑色素为 - 0. 003 3。据报道 ,直线的斜率还与黑色
素的氧化程度有关 , 新鲜配制的多巴黑色素和
Tuber melanosporum 黑 色 素 的 斜 率 分 别 为
- 0. 001 8和 - 0. 001 3 ,其碱溶液在室温下放置 48
h 后 , 由于氧化 , 其斜率分别变为 - 0. 003 3 和
- 0. 002 2[ 19] 。
图 3　山杏种皮黑色素和合成多巴黑色素的紫外 -可见光谱
──.山杏种皮黑色素;┄┄.多巴黑色素
Fig. 3　UV-Vis spect ra of melanin fr om testae of
Prunus ameniaca Linn. and DOPA melanin
───. Melanin from tes tae of Prunus ameniaca Lin n. ;
┄┄. DOPA melanin
2. 2. 2　红外光谱　红外光谱是研究天然黑色素和
人工合成黑色素的重要方法之一 ,可以给出黑色素
结构中主要官能团的信息[ 21 , 29-33] 。图 4为山杏种皮
黑色素和对照品人工合成多巴黑色素的红外光谱。
从图 4 可以看出 ,二者的红外光谱均有黑色素所具
有的 2个特征性吸收带:(1)在 3 400 cm -1附近都存
在强而宽的共振吸收带 ,是由 OH 和 NH 2 的伸缩振
动产生的;(2)在 1 650 ～ 1 620 cm - 1有一强的吸收
带 ,是由芳香 C ═C 、酰胺 I 中的 C ═O 和(或)
COO
-的振动引起的 。由于黑色素是一类大分子物
质 ,来源不同的黑色素组成的单体也不同 ,因此其红
外光谱也存在一定差异 。人工合成多巴黑色素在
1 720 ～ 1 710 cm - 1处有一弱的吸收带 ,这是由许多
含 C ═O 的官能团伸缩振动引起的[ 30 , 34-35] 。山杏
种皮黑色素该吸收带的缺失可能是由于含C ═O 的
官能团参与氢键形成 ,并部分形成离子化羧基造成
的[ 34 , 36] 。山杏种皮黑色素在 1 510 cm - 1附近还有
一弱的吸收带 ,为酰胺 II带[ 2] 。
2. 2. 3　与合成多巴黑色素的性质比较　山杏种皮
黑色素与合成多巴黑色素的性质比较结果见表 2。
由表 2可知 ,二者的性质非常相似 ,不同之处在于漂
白所需时间不同 ,合成多巴黑色素比山杏种皮黑色
素更易被双氧水漂白 , 但后者则对 NaClO 较为敏
感。多巴黑色素 、儿茶酚黑色素和 DHN(1 , 8-di-
hydro xy-naphthalene)黑色素等不同类型的黑色素
漂白时间不同 ,这一现象早在 20世纪 70 年代就有
报道[ 37] 。Harki等[ 19] 指出 ,这种反应速率的不同非
常重要 ,其反映了各种黑色素结构上的差异。
123第 5 期 姚增玉等:山杏种皮黑色素提取工艺研究
图 4　人工合成多巴黑色素(A)与山杏种皮黑色素(B)的红外光谱
Fig. 4　Infr ared spectra o f synthetic DOPA melanin(A) and the melanin ex tracted f rom
testae of Prunus ameniaca L inn. (B)
表 2　山杏种皮黑色素与作为标准品的人工合成多巴黑色素的比较试验
Table 2　Diagno stic te sts fo r melanin from testae of Prunus ameniaca Linn. and standard synthetic DOPA melanin
试验项目
Test i tems
山杏种皮黑色素
Melanin f rom
testae of
Prunus
ameniaca Linn.
合成黑色素
Syn th et ic
melanin
试验项目
Test it ems
山杏种皮黑色素
Melanin f rom
testae of
Prunus
ameniaca Linn.
合成黑色素
Synthetic
m elanin
溶于水
Solubi lit y in H 2O
N N
KMnO 4 漂白
Bleached b y KMnO 4
P P
溶于一般有机溶剂
Solubilit y in common organic solvents
N N
NaClO 漂白
Bleached by NaClO
P (2 h) P (3 h)
溶于 1 mol /L KOH
Solubili ty in 1 m ol /L KOH
P P
H2O2 漂白
Bleached by H2O 2
P (36 h) P (2 h)
溶于二甲基亚砜
S olubili ty in dimethylsulfoxide
P P
K 2C r2O 7 漂白
Bleached by K 2Cr2O 7
P P
酸性溶液中沉淀
Precipi tat ion b y H Cl
P(at pH 3) P(at pH 3) 多酚定性反应
Reaction for polyphenols with FeCl3
P P
　　注:N.反应呈阴性;P.反应呈阳性。
Note:N. negative response;P. posit ive response.
3　结论与讨论
植物黑色素的提取和纯化 ,主要依赖于其溶于
碱而在酸中沉淀并抗强酸水解的性质 ,因此 ,一般用
碱溶液提取黑色素。不同来源的黑色素性质有所不
同 ,适宜的提取条件也有养异 ,目前一般采用氨水或
氢氧化钠水溶液来提取 。近年来 ,已从茶叶[ 4 , 24] 、桂
花种子[ 25] 、七叶树[ 8] 以及其他植物材料中提取出了
黑色素。本研究首次从山杏种皮中提取得到了黑色
素 ,该黑色素适宜于用 0. 5 mol /L NaOH 在 60 ℃
下提取 2次 ,每次 12 h ,提取宜在氮气保护下进行 ,
以防止黑色素的过度氧化 。植物材料中黑色素的含
量一般很低 ,只有 2 ～ 3 g /kg ,少数材料可达 60 ～ 80
g /kg[ 8] 。山杏种皮中黑色素含量较高 ,本研究中 ,经
过酸水解和进一步有机溶剂洗涤和反复沉淀纯化以
后 ,黑色素得率约为 4. 73%。
山杏种皮黑色素的理化性质与人工合成多巴黑
色素以及其他天然黑色素[ 21-23 , 31 , 38] 非常相似 ,不溶
于水和常见的有机溶剂 ,溶于碱溶液 , pH 小于 3时
或遇FeCl3后产生沉淀 ,可被H2O 2 、KMnO 4 、K2Cr2O7
或NaClO 等强氧化剂漂白 ,遇FeSO4 /K3Fe(CN)6产
生蓝色 。
124 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 35 卷
天然动植物黑色素具有广谱的生物活性 ,这些
活性都是基于其抗氧化性质的[ 39-40] 。黑色素的这些
性质在医疗保健[ 41] 和功能食品生产方面具有重要
意义[ 42] 。前人研究发现 ,黑色素的抗氧化活性依赖
于其氧化还原状态 ,可以表现出各种不同氧化还原
状态是黑色素的基本性质之一[ 41 , 43] ,这是由黑色素
的酚 -醌结构引起的[ 3 , 41] 。本研究提取得到的山杏
种皮黑色素中总多酚含量较高 ,约为 262 mg /g ,因
此具有广泛的应用前景。
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