全 文 ：矢车菊-3-葡萄糖苷对环氧丙酰胺诱导的MDA-MB-231
细胞氧化应激的保护作用
宋 柬 1，2 张 莉 1 赵 婧 1 胡小松 1 陈 芳 1*
（1中国农业大学食品科学与营养工程学院 国家果蔬加工工程技术研究中心 北京 100083
2山东省疾病预防控制中心食品与营养所 济南 250014）
摘要 从干预细胞氧化应激的角度，采用比色法、荧光检测及免疫分析的方法，考察不同浓度的矢车菊-3-葡萄
糖苷对环氧丙酰胺引起的人类乳癌细胞 MDA-MB-231 毒性的影响。 试验结果表明，与环氧丙酰胺单独处理的
细胞相比，矢车菊-3-葡萄糖苷预处理后能明显提高细胞存活率，显著降低细胞内活性氧和丙二醛的生成量，而
且抑制细胞内还原型谷胱甘肽含量的下降，提高 γ-GCS 蛋白表达量。 矢车菊-3-葡萄糖苷能够保护 MDA-MB-
231 细胞免受环氧丙酰胺引起的氧化应激。
关键词 矢车菊-3-葡萄糖苷； 环氧丙酰胺； 细胞损伤； 活性氧； 谷胱甘肽
文章编号 1009-7848（2014）07-0021-06
丙烯酰胺（acrylamide，AA）是具有神经毒性、
生殖毒性和潜在致癌性的 1 种化合物。 2002 年，
瑞典科学家首次发现在食品热加工过程中能产生
AA，并普遍存在于各类食品中 [1]。 AA 在体内与氧
自由基环氧化生成环氧丙酰胺（glycidamide，GA）。
GA是 1 种活性环氧化合物， 能够与 DNA 形成加
合物，产生的毒性比 AA的毒性要高[2]。花青素是 1
种广泛存在于水果蔬菜中的天然抗氧化物， 矢车
菊-3-葡萄糖苷 （Cy-3-glu） 是众多花青素中的 1
种糖苷形式，尤其在浆果中含量丰富。 研究表明，
Cy-3-glu 能够保护细胞免受氧化应激（oxidative
stress）所引起的多种疾病[3]。 虽然已有对 AA 毒性
抑制的体内体外试验的报道 [4-6]，但是从果蔬中广
泛存在的活性成分 Cy-3-glu入手， 干预 GA 的毒
性尚缺乏系统性的研究。
本文以体外培养的人体乳腺癌 MDA-MB-
231 细胞为研究对象，通过测定细胞存活率、还原
型谷胱甘肽（GSH）、细胞内活性氧（ROS）的生成量
及丙二醛的含量， 谷氨酰半胱氨酸合成酶 （γ-
GCS） 蛋白表达量， 探讨不同浓度的 Cy-3-glu 对
GA诱导的氧化应激是否具有保护作用，旨在为开
发食源性成分，降低 AA及 GA 对人体的毒性提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人体乳腺癌 MDA-MB-231 细胞，由中国农业
大学扈洪波教授惠赠。
Cy-3-glu， 瑞典 Polyphenols 公司；GA、 探针
2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、电泳所
用试剂，美国 Sigma 公司；细胞用培养基（DMEM）
与胎牛血清 （FBS）， 美国 Hyclone 公司；RIPA 试
剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBS溶液、100 U/ml
青霉素与 100 μg/ml 链霉素， 北京索来宝公司；微
量还原型 GSH 测定试剂盒，南京建成生物工程研
究所；蛋白酶抑制剂，美国 Calbiochem 公司；柯达
医用 X射线胶片，天津世纪博奥公司；兔源多克隆
抗体 γ-GCS、β-actin 和辣根过氧化物酶（HRP）标
记山羊抗兔 IgG 抗体，美国 Bioworld 公司；ECL 化
学发光试剂、硝酸纤维素（NC）膜，美国 Millipore
公司。
收稿日期： 2013-07-09
基金项目： 国家自然科学基金项目（81102152）；国家“973
计划”项目（2012CB720805）；新世纪优秀人才
支持计划项目（NCET-12-0520）
作者简介： 宋柬，女，1980 年出生，博士
通讯作者： 陈芳
Vol． 14 No． 7
Jul. 2 0 1 4Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 14 卷 第 7 期
2 0 1 4 年 7 月
中 国 食 品 学 报 2014 年第 7 期
1.2 仪器与设备
流式细胞仪 FACSCalibur， 美国 BD 公司 ；
Multiskan* EX酶标仪， 美国 Thermo Scientific 公
司；M200 PRO 荧光酶标仪，澳大利亚 Tecan Infi-
nite公司；超声波破碎仪，宁波新芝公司；电泳及
转膜装置，美国 Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养与作用条件 MDA-MB-231 细
胞，培养在 5% CO2，37 ℃的恒温培养箱中，培养
液为 10%的 FBS、100 U/ml 的青霉素和 100 μg/ml
链霉素的 DMEM。
细胞在 6 孔板里贴壁后，密度长到 50%~60%
时弃去培养液，分别加入含有不同浓度 0，10，25，
50，100 μmol/L Cy-3-glu 的无血清 DMEM 中孵育
4 h，弃去培养基，加入含有 2.5 mmol/L GA 的无血
清 DMEM 进行处理。 20 h 后测定细胞存活率、丙
二醛含量和 γ-GCS 免疫印迹，4 h 后测定 GSH 含
量，2 h后进行 ROS试验。 以未经任何处理的细胞
作为对照。
1.3.2 细胞存活率测定 采用结晶紫法测定细胞
存活率，根据文献[7]方法略有改善，贴壁细胞依次
用 PBS 溶液清洗，1%戊二醛溶液固定 15 min，0.
02%结晶紫水溶液染色 30 min，80%乙醇溶液溶解
6 h 以上，转移至 96 孔板（200 μL ／孔），在酶标仪
上测定各孔在 595 nm波长处的最大吸收峰。根据
与对照细胞的比值计算细胞的存活率。
1.3.3 活性氧测定 ROS根据文献[8]方法处理细
胞， 细胞收集后用 PBS溶液清洗两次， 在 0.5 mL
PBS 溶液中加入终浓度为 10 μmol/L 的 DCFH-
DA，37 ℃ 孵育 30 min，在激发波长 485 nm，发射
波长 530 nm 处，使用流式细胞仪检测 DCF 荧光，
从而测定 10 000 个细胞内 ROS 水平， 利用软件
CellQuest Pro 对所得数据进行分析。
1.3.4 丙二醛测定 细胞产生的氧自由基能够攻
击细胞膜中的多不饱和脂肪酸， 引发脂质过氧化
作用，并因此形成脂质过氧化物，如醛基（丙二醛）
等。 丙二醛与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，
在 532 nm 波长处有最大吸收峰。 细胞完全裂解
后， 根据微量丙二醛试剂盒说明书测定丙二醛的
含量。
1.3.5 还原型谷胱甘肽测定 GSH 是 1 种低分子
清除剂，可清除体内的氧自由基，维持细胞正常生
长及免疫等多种生理功能。 GSH可与二硫代二硝
基苯甲酸（DTNB）反应，生成 1 种黄色化合物，在
405 nm波长处用酶标仪测定细胞内 GSH 的含量。
细胞完全裂解后， 根据微量还原型谷胱甘肽试剂
盒说明书，由标准曲线法测定。
1.3.6 Western Blot 分析 6 孔板每个培养孔中
加入 100 μL 的细胞裂解液 （RIPA∶PMSF=100∶1
（体积比）），冰浴超声至细胞充分裂解，4 ℃温度下
12 000 r/min离心 30 min，取上清液。 按照 BCA方
法测定总蛋白质量浓度， 将各个样品的浓度调整
成同一质量浓度。
每个蛋白样品质量浓度大约 1.5~2.5 μg/μL，
进行 SDS-PAGE 后，湿法转膜 2 h，5%脱脂奶粉溶
液室温封闭 1 h，一抗（1∶500（体积比））4 ℃孵育过
夜，再二抗〔1∶20 000（体积比）〕室温孵育 1 h，暗室
中压片，显影定影。
1.3.7 数据分析 所有试验进行 3~6 次重复。 数
值采用软件 Origin 8.5 的单因素 ANOVA 分析的
平均值±标准差表示。 再进行 t 检验的统计学分
析。 在 P<0.05水平上是显著性差异。
2 结果与分析
2.1 不同浓度 Cy-3-glu 对 GA 作用的细胞存活
率的保护作用
由图 1 可知，Cy-3-glu 预处理的细胞和 GA
单独处理的细胞的存活率都比对照细胞的低；而
用 Cy-3-glu 预处理的比 GA 单独处理的细胞存
活率明显有所提高 （P<0.05），10~50 μmol/L Cy-
3-glu作用呈现浓度效应，随浓度增加细胞存活率
降低，而用 100 μmol/L Cy-3-glu 预处理的细胞存
活率有所上升。 可能 Cy-3-glu在一定浓度范围内
可使细胞存活率逐渐降低，超出这个范围，反而提
高细胞的存活率。总的结果表明，Cy-3-glu能够抑
制 GA作用的细胞存活率的降低，减少细胞毒性。
2.2 不同浓度 Cy-3-glu 对 GA 诱导的细胞内
ROS产生的抑制作用
由图 2 可知，细胞产生的荧光强度跟 ROS 的
生成量成正比。 Cy-3-glu预处理的细胞产生的荧
光向左偏移，荧光强度减少，说明细胞 ROS 的生
成量减少。结果表明，Cy-3-glu能够抑制 GA诱导
22
第 14 卷 第 7 期
的细胞 ROS 生成量的增加，保护细胞免受氧化 损伤。
100
80
60
40
20
0
C 0 10 25 50 100
细
胞
存
活
率
/%
Cy-3-glu/μmol·L-1
图 1 Cy-3-glu 对 GA 作用的细胞存活率的影响
Fig.1 Effect of Cy-3-glu on GA-induced cell viability of MDA-MB-231 cells
1000
0
SS
C-
H
1.001
0 1000FSC-H
（a）
200
160
120
80
40
0
荧
光
强
度
100 101 102 103 104
（b）
200
160
120
80
40
0
100 101 102 103 104
（c）
FL2-HFL2-H
注：A：单细胞群的散射光信号；B：GA 单独处理的细胞释放的荧光；C：用 Cy-3-glu 预处理的细胞跟 GA 单独处理的细胞释放
荧光的叠加峰图； 图 2C 中曲线表示每个峰的几何均值分别为 40.95，62.65，47.76，43.32，51.44，49.98；对应的为对照细胞，2.5
mmol/L GA 单独处理，10，25，50，100 μmol/L Cy-3-glu 预处理的细胞。
图 2 Cy-3-glu 对 GA 作用的细胞活性氧的影响
Fig.2 Effect of Cy-3-glu on GA-induced ROS formation in MDA-MB-231 cells
2.3 不同浓度 Cy-3-glu 对 GA 诱导的细胞内生
成丙二醛的影响
由图 3 可知， 单独用 GA 处理的细胞生成的
丙二醛的量约为对照细胞的 2.5 倍。 经 Cy-3-glu
预处理的细胞比 GA 单独处理的细胞的丙二醛的
生成量明显减少（P<0.05），并且随着 Cy-3-glu 浓
度的升高， 丙二醛的生成量逐渐减少。 用 100
μmol/L Cy-3-glu 预处理细胞的丙二醛生成恢复
到对照细胞的水平。结果表明，Cy-3-glu 能够抑制
GA作用细胞丙二醛生成量的增加，使其免受脂质
过氧化作用而导致的损伤。
2.4 不同浓度 Cy-3-glu 对 GA 作用的还原型谷
胱甘肽的影响
由图 4 可知，Cy-3-glu 预处理的和 GA 单独
处理的细胞 GSH 含量都比对照细胞的低， 而经
Cy-3-glu 预处理的比 GA 单独处理的 GSH 含量
明显提高（P<0.05），虽然不同浓度的 Cy-3-glu 之
间没有显著性差异。结果表明，Cy-3-glu 能够避免
荧
光
强
度
矢车菊-3-葡萄糖苷对环氧丙酰胺诱导的MDA-MB-231细胞氧化应激的保护作用 23
中 国 食 品 学 报 2014 年第 7 期
GA 作用的细胞 GSH 含量的降低， 从而提高细胞 的解毒作用。
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
M
DA
/n
m
ol·
（ m
g
pr
o）
-1
C 0 10 25 50 100
Cy-3-glu/μmol·L-1
图 3 Cy-3-glu 对 GA 作用的细胞内丙二醛含量的影响
Fig.3 Effect of Cy-3-glu on GA-induced MDA generation
in MDA-MB-231 cells
100
80
60
40
20
0
GS
H
/%
C 0 10 25 50 100
Cy-3-glu/μmol·L-1
图 4 Cy-3-glu 对 GA 作用的细胞内还原型 GSH 的影响
Fig.4 Effect of Cy-3-glu on GA-induced GSH delption
in MDA-MB-231 cells
2.5 不同浓度 Cy-3-glu 对 GA 诱导的细胞内
γ-GCS蛋白表达的影响
由图 5可知， 经 GA单独处理细胞产生的 γ-
GCS 蛋白表达量明显低于对照细胞， 而 10~100
μmol/L Cy-3-glu 预处理的细胞 γ-GCS 蛋白表达
量比 GA单独处理的显著提高。从 Western blot 的
试验结果看，Cy-3-glu 能够明显抑制 GA 作用的
细胞 γ-GCS 蛋白表达量的降低，从而维持细胞抗
氧化酶的正常作用。
3 讨论与结论
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，
ROS的产生和抗氧化防御之间严重失衡， 从而导
致组织损伤的一种反应。 引起氧化应激最重要的
物质-ROS 的增多会引起细胞损伤 [8]，本研究表明
GA的加入介导了细胞的氧化应激，导致细胞的损
害，这与 Baum 等[2]的研究结果一致。 Cy-3-glu 能
够保护细胞免受 GA 引起的氧化损伤， 对于乙醇
诱导的细胞损伤也具有保护作用 [9]。 其他植物多
酚 ，如姜黄素 [10]、羟基酪醇 [11]皆能保护 AA 所致
HepG2 的细胞毒性， 抑制 AA 引起的 ROS 生成。
ROS能与脂质中的不饱和脂肪酸反应， 最终导致
细胞膜结构的改变。 ROS 不但通过生物膜中多不
饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤， 而且还能通
过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤 [5，8]。 丙
二醛的量可以反映细胞内脂质过氧化程度， 间接
反映出细胞损伤的程度。 本文表明 Cy-3-glu 能够
抑制细胞内脂质过氧化而引起的细胞损伤 ，在
Zhang 等 [5]的研究中，大蒜素作为 1 种食物多酚，
能抑制 AA 介导的细胞丙二醛生成量的增加，从
而保护细胞免受氧化损伤。
还原型 GSH 是机体内最重要的非酶型抗氧
化物，具有清除自由基，解毒，维持细胞正常生长
发育及细胞免疫等多种重要生理功能，GSH 量的
多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素 [12]。
γ-GCS 是 GSH 从头合成的合成酶，也是合成中第
1 个关键的限速酶，可以催化谷氨酸、半胱氨酸、
甘氨酸合成 GSH，从而补充体内消耗的 GSH。 催
化活性受产物 GSH 的反馈抑制，使得细胞内 GSH
含量维持在一定水平[13]。 本文表明 Cy-3-glu 能够
抑制 GA 介导的细胞内还原型 GSH 含量和 γ-
γ-GCS
β-actin
C 0 10 25 50 100
Cy-3-glu/μmol·L-1
图 5 Cy-3-glu 对 GA 作用的细胞内 γ-GCS 蛋白
表达量的影响
Fig.5 Effect of Cy-3-glu on GA-induced γ-GCS
protein expression in MDA-MB-231 cells
24
第 14 卷 第 7 期
GCS 蛋白表达量的降低， 从而增加 GSH 的合成，
降低 GA 对细胞的损害， 并且清除细胞内的活性
氧自由基，提高细胞的解毒水平，维持细胞的正常
生理作用。 Zhang 等[11]发现羟基酪醇能够降低AA
引起的 HepG2 细胞内 GSH 的消耗， 提高 γ-GCS
的胞内表达。Rodriguez等[14]也报道了类似的结果，
可可多酚提取物与原花青素 B2能够明显抑制 AA
作用 Caco2 细胞内 GSH 水平和 γ-GCS 蛋白表达
的减少。
Cy-3-glu作为 1种在水果蔬菜中大量存在的
天然抗氧化成分，对于清除体内自由基，维持细胞
活力具有重要的作用。AA是广泛存在热加工食品
中的 1 种潜在致癌物， 对人类健康存在威胁，而
GA是其体内重要的致毒代谢物，能够引起细胞进
一步的毒害。本文从抑制细胞毒性，减少活性氧引
起的氧化损伤， 提高细胞内酶与非酶抗氧化物水
平等方面，论证了 Cy-3-glu 能够降低 GA 引起的
MDA-MB-231细胞氧化应激。 对于应用食源性成
分降低 AA 危害和保护公众健康具有重要的理论
价值与现实意义。
参 考 文 献
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中 国 食 品 学 报 2014 年第 7 期
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Protective Role of Cyanidin 3-Glucoside on Glycidamide -induced Cell Damage
in MDA-MB-231 Cells
Song Jian Zhang Li Zhao Jing Hu Xiaosong Chen Fang*
（College of Food Science and Nutritional Engineering， National Engineering Research Center for Fruit and Vegetable
Processing， China Agricultural University， Beijing 100083）
Abstract Acrylamide （AA） formed in carbohydrates-enriched foods during heating processing. AA has been catego-
rized as a possible carcinogen. Glycidamide （GA）， a reactive epoxide， is the metabolite of AA in body and more toxic
than AA itself. Cyanidin 3-glucoside （Cy-3-glu） is one of the natural antioxidants widely found in plants. In the present
study， we investigated whether Cy-3-glu can decrease the GA-reduced cytotoxicity of human breast cancer MDA-MB-
231 cells. Colorimetry assays， fluorescence detection and immunoblot analysis were performed. Results showed that Cy-3-
glu significantly enhanced cell viability and reduced the generation of reactive oxygen species （ROS） and malondialdehyde
（MDA） Moreover， the pretreatment with Cy-3-glu suppressed glutathione （GSH） delption and increased gamma-glutamyl-
cysteine synthetase （γ-GCS） protein expression by GA. Cy-3-glu could present the protection against cell damage in-
duced by GA in MDA-MB-231 cells.
Key words cyanidin 3-glucoside； glycidamide； cell damage； reactive oxygen species； glutathione
英媒：肠道菌群的组成不仅由饮食决定
肠道菌群的组成，原来不仅仅取决于你吃的东西。发表在 7月 29日英国《自然·通讯》上的
一项研究显示，是饮食与性别以及两者的相互作用影响了肠道菌群的组成。 由此科学家建议，
任何试图通过改变肠道菌群治疗胃肠道疾病的手段，应考虑加入“性别”这一因素。
肠道菌群即人体肠道的正常微生物，其中超过 99%都是细菌。这些微生物群落特别的丰富
且多样化，并且对宿主的发育、营养吸收和免疫功能都有促进。 已知饮食会改变肠道菌群的组
成，这意味着饮食治疗可能会缓解由微生物组成改变而导致的疾病。 不过，饮食治疗的作用是
普遍的还是取决于宿主的基因型，这点尚不清楚。
美国得克萨斯大学奥斯丁分校丹尼尔·伯尼克与他的研究团队，此次研究了性别和饮食在
脊椎动物肠道菌群组成上的影响。 他们分别使用了野生鱼类（棘鱼和河鲈）、人工养殖棘鱼、实
验室小鼠和人类的数据。 在每一个例子中， 饮食对于雌性和雄性肠道菌群的影响都是不一样
的。
尽管该结果背后的机理还需要被确认，但是研究人员认为，这可能和不同性别在激素或者
免疫功能上的区别有关。他们同时提出，今后进行肠道菌群的研究应该考虑加入“性别”这一因
素，任何试图通过改变肠道菌群治疗胃肠道疾病的医学手段，也应该考虑到患者的性别因素。
而在本月初的一项同领域调查研究显示，人体肠道内的菌群保持了要么极多、要么几乎没
有的状态，中间状态只能持续相对短暂的时间，而肠道菌群的不寻常表现，也与人体的衰老、超
重这些生理健康因素有着一定的相关性。 （消息来源：科技日报）
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