全 文 ：书网络出版时间:2015 －11 －18 10:12:34 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /KCMS/detail /34． 1065． Ｒ． 20151118． 1012． 002． html
◇基础医学研究◇
苹果皮提取物及有效成分 C3G对小鼠乳腺恶性肿瘤生长的影响
郭 强1，汪心怡2，朱其苹1，范楚苓1，朱 佩1，任海风1，李菲菲1，汪思应1
2015 － 09 － 08 接收
基金项目:国家自然科学基金(编号:81302319) ;安徽省自然科学基
金(编号:1308085MH121) ;安徽省留学回国人员科研项
目(编号:2009 － 2011)
作者单位:安徽医科大学1 基础医学院病理生理学教研室、2临床医
学院，合肥 230032
作者简介:郭 强，女，硕士研究生;
汪思应，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail:sywang@
ahmu． edu． cn
摘要 目的 探讨苹果皮提取物及其有效成分矢车菊-3-葡
萄糖苷(C3G)对乳腺恶性肿瘤生长的影响。方法 建立
E0771 小鼠乳腺癌移植瘤模型，观察饮用苹果皮汁对小鼠乳
腺恶性肿瘤生长的影响。免疫组化法分析饮用苹果皮汁与
饮用普通无菌水组小鼠恶性肿瘤组织中 CD31 表达差异。
HPLC法分析苹果皮提取物中的化学成分。3D Matrigel胶血
管形成实验探讨苹果皮成分 C3G对小鼠乳腺恶性肿瘤血管
形成的影响。MTT法和 Transwell实验观察 C3G对血管内皮
细胞 SVEC增殖和迁移能力的影响。结果 饮用含有 1%和
2%浓度的苹果皮汁无菌水对乳腺恶性肿瘤生长起到抑制作
用。免疫组化法染色显示饮用苹果皮汁肿瘤中 CD31 表达
低于未饮用苹果皮汁组。HPLC 法分析显示 C3G 是苹果皮
提取物的有效成分之一。3D Matrige 胶实验显示 C3G 抑制
小鼠乳腺癌细胞 E0771 血管生成。C3G 血管形成抑制小鼠
内皮细胞 SVEC的迁移能力。结论 苹果皮提取物及其有
效成分 C3G抑制小鼠乳腺癌生长，该作用可能通过抑制血
管生成而实现。
关键词 乳腺癌;苹果皮;矢车菊-3-葡萄糖苷
中图分类号 Ｒ 363． 2
文献标志码 A 文章编号 1000 － 1492(2015)12 － 1711 － 05
苹果含有丰富的植物纤维、维生素、蛋白质和多
酚类物质。流行病学调查［1］显示，多食用苹果可以
降低一些慢性疾病的发生率，其中包括恶性肿瘤。
对苹果皮成分进行分析显示，其含有多种强抗氧化
的化学物质［2］，其抗氧化物质含量约占整个果实的
1 /2［3］。体外实验［4 － 5］表明，苹果皮可以抑制人前列
腺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞的增
殖、迁移和侵袭。矢车菊-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-
glucoside，C3G)是广泛存在于瓜果蔬菜中的花青素
类，但在不同的水果中其含量也是千差万别［6］，
HPLC分析得出 C3G 是苹果皮中的重要成分，具有
明显的抗氧化作用，当机体由于氧化应激引起多种
疾病时，C3G 可以在其中起到保护作用［7］，前期研
究［8］证实酒精刺激乳腺癌引起氧化应激，C3G 可以
抑制这一反应从而保护机体。另外，C3G 还被报
道［9］可以抑制胰腺癌、肺癌细胞的生长，促进人胃
腺癌细胞的凋亡。C3G 还可以抑制小鼠血管平滑
肌细胞的增殖［10］。在乳腺癌中，C3G也可以抑制肿
瘤生长，但其机制尚不清楚。推测 C3G可能与乳腺
肿瘤血管生成存在一定关系。肿瘤的血管生成与血
管转移密切相关［11］。CD31 又称血小板 －内皮细胞
黏附因子，是内皮细胞的主要标志物，用于识别良恶
性血管源性肿瘤及肿瘤间质中血管生成状况。肿瘤
血管中血管内皮细胞是血管生成的关键步骤，该研
究主要观察苹果皮汁与乳腺恶性肿瘤之间的关系及
其提取物 C3G在乳腺癌中发挥作用的机制，为乳腺
癌治疗提供依据。
1 材料与方法
1． 1 主要材料 市售成熟红富士苹果 30 kg。小鼠
髓样乳腺癌细胞 E0771(简称为 E0771)由 C57BL /6
小鼠自发乳腺癌取肿瘤组织原代培养所得。小鼠血
管内皮细胞 SVEC 细胞购自 ATCC。雌性 C57BL /6
小鼠 21 只，5 周龄，SPF级，平均体重 18 g，随机分成
3 组，分别购置饲养于安徽医科大学实验动物中心。
1． 2 试剂与仪器 C3G 由导师汪思应教授从合作
实验室美国肯塔基大学医学部引进;CD31 抗体、
DMSO(美国 Sigma 公司，货号 131M-9) ;Matrige 胶
(美国 BD公司) ;MTT 试剂盒(南京凯基生物技术
有限公司) ;倒置显微镜 TMT2-21(美国奥林巴斯公
司)、120C(日本尼康公司) ;高速营养机(Philips
HＲ1861，日本菲利普公司) ;HPLC 仪 (Hypersil
BDS，美国 Thermo 公司) ;CO2 细胞培养箱(371 型，
美国 Thermo公司)。
1． 3 细胞培养
1． 3． 1 E0771 细胞和 SVEC细胞培养 E0771 细胞
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和 SVEC细胞均为 DMEM 培养基与胎牛血清 FBS
按照 9 ∶ 1 配成 DMEM 完全培养基，加入青霉素 －
链霉素合剂，抗生素终浓度为:青霉素 1 × 105 U /L，
链霉素 0. 1 g /L，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，
待细胞 80%融合时，传代培养行后续实验。
1． 3． 2 C3G处理组 E0771 细胞的建立 取对数生
长期的细胞 E0771 接种于 60 mm细胞皿中，细胞贴
壁后分别用 10、20 nmol /L的 C3G 处理细胞 26 h，对
照组加入 C3G同一溶剂，全程需避光培养。
1． 4 含 1%、2%苹果皮汁无菌水制取 普通红富
士苹果削皮后，弃果肉，取果皮，使用高速营养榨汁
机榨汁，收集苹果皮汁，用纱布过滤后，再使用 0． 2
μm滤器过滤成无菌无渣苹果皮汁。1%、2%苹果
皮汁浓度分别为 100 ml无菌水中加 1 g、2 g 无菌无
渣苹果皮汁。
1． 5 小鼠乳腺癌模型建立 取指数生长期的
E0771 细胞，常规消化计数，用 PBS 重悬所需细胞，
将细胞接种于 C57BL /6 小鼠第二对右侧乳腺处，接
种量为每只 3. 5 × 105 个细胞(100 μl) ，整个操作过
程中 E0771 细胞置于冰上保存。
1． 6 HPLC 法分析苹果皮汁成分 收集苹果皮汁
1 kg /L为样品，样品溶解于含有甲酸的乙腈水中。
标准品为 50 mmol /L C3G，同样溶解于含有甲酸的
乙腈水中。检测条件如下:色谱柱:Thermo Hypersil
BDS C18(100 mm ×3 mm i． d，3 μm) ;流动相:乙腈
－ 0. 2%磷酸溶液(14 ∶ 86) ;流速:0. 5 ml /min;检
测波长:250 nm;时间:20. 5 min。
1． 7 3D Matrigel 胶血管形成实验 将 Matrigel 基
质胶置于 4 ℃冰箱过夜融化，将实验中所需 EP 管
和移液枪头，24 孔板均提前置于 4 ℃预冷，取生长
对数期的 E0771 细胞和 C3G 处理后 E0771 细胞，
PBS清洗，胰酶消化，计数，保证 10 μl DMEM 培养
基中含有 3 000 个细胞。取 10 μl 培养基与 200 μl
Matrigel胶混合，将混合液接种于 24 孔板中，置于
37 ℃孵箱 20 min，Matrigel胶凝固后，上层加 500 μl
DMEM培养基防止干燥。约 10 d 后显微镜下观察
细胞形态，计数统计。
1． 8 免疫组化实验 解剖小鼠，取肿瘤固定后，脱
水，制成蜡块，标本蜡块连续切片，确保切片厚度≤2
μm，常规二甲苯脱蜡，使用 H2O2 去离子水消除内源
性过氧化物酶活性，PBS 冲洗 2 次，一抗 4 ℃孵育过
夜，孵育结束后使用 PBS 清洗 3 次，室温使用一抗对
应二抗孵育 15 ～ 20 min，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，
辣根酶标记链霉素卵白素工作液滴加至标本，室温孵
育 15 min，PBS清洗 3次，每次 5 min，DAB显色，使用
苏木精染色，然后盐酸乙醇分化，乙醇溶液按梯度脱
水，二甲苯透明后封片，至显微镜下拍照观察。
1． 9 MTT 实验 取对数生长期细胞 E0771、
SVEC，消化，计数，分 3 组(对照组和 10、20 nmol /L
C3G处理组) ，每组设立 6 个复孔，每孔接种相同数
目细胞，接种于 96 孔板。待细胞贴壁后，取 0 h 96
孔板，避光加入 MTT，37 ℃孵育，随后取出 96 孔板，
弃上清液，每孔加入 DMSO 溶解结晶，混匀，490 nm
酶标仪检测光密度值 (optical density，OD)值。同上
收取 24 h及 48 h的细胞培养板。
1． 10 Transwell 迁移实验 将 Transwell 小室置于
24 孔板中 ，在其小室的上下均加入适量的纯 DMEM
培养基水化小室，水化后，在小室下层加入含 6%血
清的 DMEM完全培养基。处理细胞，取对数生长期
细胞 SVEC，消化、离心，取含血清 2%的 DMEM 完
全培养基重悬细胞，计数加入小室上层。置 37 ℃细
胞培养箱中培养，约 6 h后细胞可由上层小室穿过。
随后收板弃小室上下层培养基，棉签擦拭上层小室
细胞，并用 PBS 清洗 2 次，将小室置于固定液中固
定已迁移过的细胞，随后 0． 1%结晶紫染色。染色
结束后，清洗多余染色液，室温干燥，显微镜拍照。
每孔随机取 5 个视野，计数细胞数目，取平均值。
1． 11 动物实验 建立 E0771 小鼠乳腺癌移植瘤模
型后，平均分为 3组，饮用水分别为普通无菌水、浓度
为 1%的苹果皮汁无菌水、浓度为 2%的苹果皮汁无
菌水，隔天记录肿瘤体积，计算公式为:肿瘤体积
(mm3)=1 /2 × a × b2(a 为肿瘤最长径 mm，b 为肿瘤
最短径 mm) ，绘制肿瘤生长曲线，3 周后 3 组小鼠经
颈椎脱臼处死，解剖取肿瘤组织、肺组织。
1． 12 统计学处理 采用 SPSS 13. 0 软件进行分
析，所得数据用 珋x ± s 表示。各实验均重复 3 次，进
行 t检验。
2 结果
2． 1 饮用苹果皮汁对小鼠乳腺肿瘤生长的影响 按
动物实验方法，将实验分为 3 组，绘制肿瘤生长曲线
显示，饮用 1%苹果皮汁小鼠肿瘤体积低于饮用普通
无菌水组，饮用 2%苹果皮汁小鼠肿瘤体积也明显低
于饮用普通无菌水组(P ＜ 0. 05)。说明饮用苹果皮
汁可以抑制小鼠乳腺恶性肿瘤的生长。见图 1。
2． 2 免疫组化 CD31 染色结果 通过免疫组化法
·2171· 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)
染色，400 倍镜下观察显示，饮用含有 1%苹果皮汁
无菌水小鼠肿瘤中其 CD31 表达明显低于饮用普通
无菌水组小鼠。说明苹果皮汁有可能通过抑制肿瘤
血管形成来发挥作用。见图 2。
2． 3 HPLC分析结果 HPLC 分析显示 C3G 是苹
果皮提取物的有效成分。见图 3。
图 1 饮用含有 1%和 2%苹果皮汁无菌水对
小鼠乳腺恶性肿瘤体积的影响
与普通无菌水组比较:* P ＜ 0. 05
图 2 免疫组化法分析肿瘤组
织中 CD31 表达 SP × 400
A:普通无菌水组;B:含有
1%苹果皮汁无菌水组;C:含有
2%苹果皮法无菌水组
图 3 HPLC法分析苹果皮中的有效成分
2． 4 3D Matrige 胶血管形成实验结果 使用不同
浓度 C3G(0、10、20 nmol /L)处理小鼠乳腺癌细胞，
MTT实验显示经 10、20 nmol /L C3G处理后，随时间
增加，与对照组比较差异无统计学意义，说明 C3G
对 E0771 细胞增殖无明显影响，见图 4。当使用
C3G后，E0771 细胞其血管生成个数明显低于对照
组，说明 C3G可能通过抑制血管生成影响乳腺肿瘤
的生长，见图 5。
图 4 小剂量 C3G对小鼠乳腺癌细胞 E0771 存活能力的影响
图 5 3D Matrige 胶血管形成实验观察 C3G对
小鼠乳腺癌细胞 E0771 血管形成的影响
与 E0771 + C3G组比较:* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
2． 5 Transwell实验结果 为了更进一步验证 C3G
与血管生长之间的关系，用 C3G处理小鼠血管内皮
细胞与对照组进行 MTT 实验，经 C3G 处理后的细
胞增殖能力与对照组并无明显差别。见图 6。随后
进行体外 Transwell试验，在小室中同样接种 1 × 105
个细胞，6 h后显微镜下观察，使用 C3G处理后的小
鼠内皮细胞其穿过细胞数明显低于对照组，迁移能
力下降，说明 C3G可以抑制其迁移能力。见图 7。
3 讨论
苹果是生活经常食用水果之一，众所周知对健
·3171·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)
图 6 小剂量 C3G对小鼠血管内皮细胞 SVEC存活能力的影响
图 7 Transwell实验检测 C3G对小鼠血管内皮细胞
SVEC迁移能力的影响 × 40
A:对照组;B:10 nmol /L C3G 组;C:20 nmol /L C3G 组;与 20
nmol /L C3G组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0. 01
康有益，苹果多酚中的黄酮醇被认为在抑制癌症中
发挥着关键作用［5］。研究［6，12］表明，苹果皮多酚含
量是果肉的 3 ～ 4 倍，比例约占整个果实的一半。体
外实验［3 － 4］显示，苹果皮可以抑制人前列腺癌细胞、
乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞的增殖、迁移和
侵袭。本研究结果显示，当患有乳腺癌的小鼠日常
无菌水更换为含有 1%和 2%浓度的苹果皮汁无菌
水后，随着时间的增加，其肿瘤体积以及生长速度均
低于饮用普通无菌水组。说明日常饮用苹果皮汁可
以减缓乳腺癌的发展。
研究［3 － 4］显示苹果皮抑制肿瘤生长机制主要是
苹果皮成分可以抑制肿瘤的增殖并且促进凋亡。氧
化应激与肿瘤有着密切的关系，研究［13］表明肿瘤患
者体内氧化应激失调，处于低抗氧化状态，氧化应激
水平增高，苹果皮中含有大量的黄酮醇，黄酮醇具有
强大的抗氧化功能，但因为血管生成是肿瘤发生发
展的重要步骤之一，所以该研究探讨饮用苹果皮汁
对其肿瘤血管形成是否有一定影响，免疫组化结果
显示，饮用苹果皮汁其 CD31 表达明显低于对照组。
与此同时，HPLC法分析苹果皮成分，结果显示
C3G是苹果皮有效成分之一。C3G 可以抑制胃癌、
肺癌、胰腺癌［14］等肿瘤细胞的增殖。另有研究［15］
表明，C3G 与糖尿病小鼠中血管形成也有密切关
系。本课题组前期实验［10］显示，C3G同样具有潜在
强大抗氧化功能，并且可以抑制酒精诱导乳腺癌导
致的迁移和侵袭［16］。3D Matrige胶血管形成实验探
讨 C3G 对乳腺癌细胞是否有一定作用，高浓度的
3D Matrigel胶适用于体内血管生成和肿瘤细胞迁移
及肿瘤模型的建立。3D Matrigel胶血管形成实验是
模拟肿瘤细胞在三维基质内生长，以观察肿瘤细胞
血管形成能力。本研究显示，经过 C3G处理的肿瘤
细胞血管形成能力明显低于对照组，说明 C3G 不但
具有抗氧化作用，还可以抑制肿瘤血管的形成。
通过体内外实验表明低浓度的苹果皮汁对乳腺
癌生长起到抑制作用，其机制可能是通过抑制血管
生成来实现。提取苹果皮中的 C3G，抑制肿瘤细胞
增殖及血管形成，为乳腺癌的治疗可能提供新的研
究方向。
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Effect of apple peel extract and its active components C3G on
mouse’s malignant breast tumour growth
Guo Qiang1，Wang Xinyi2，Zhu Qiping1，et al
(1Dept of Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，2Dept of Clinical
Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032)
Abstract Objective To investigate the effect of the apple peel extract and its active ingredients cyanidin-3-gluco-
side(C3G)on malignant breast tumour growth in vivo． Methods C57BL /6 mouse breast cancer model was built to
observe the effect of drinking apple peel juice on mouse breast tumour growth． IHC was used to analyze the differ-
ential expression of CD31 in the apple peel extract treated group and the control group． HPLC was used to analyze
the chemical composition of apple peels extract． The effect of apple peel component C3G on blood vessels formation
of mouse breast cancer cell line E0771 was investigated through 3D Matrigel． The effect of C3G on proliferation and
migration of SVEC were determined via MTT and Transwell． Ｒesults 1% and 2% concentration of apple peel
juice inhibited the tumour growth in mouse breast cancer model． The expression of CD31 in apple peel extract trea-
ted group was lower than that of control group indicated by IHC staining． C3G was one of the effective components
of the apple peel extract through HPLC analysis． C3G inhibited the blood vessels formation of mouse breast cancer
cell line E0771 indicated by 3D Matrigel． The migration of SVEC cells was inhibited by C3G． Conclusion The
apple peel extract and its effective component C3G inhibit the tumour growth of mouse breast cancer，which is pos-
sibly achieved by inhibiting its angiogenesis．
Key words breast cancer;apple peel;cyanidin-3-glucoside
·5171·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)