全 文 ：DOI:10.3724/ SP.J.1096.2011.00397
在线超声提取 96-孔盘技术高通量快速测定
全叶马兰中果聚糖成分
田尚衣1 , 2 　万泓志1 　黄国辉2 　杨允菲＊1 　张义飞1 　邵帅1
1(东北师范大学草地科学研究所 , 植被生态科学教育部重点实验室 ,长春 130024)
2(东北师范大学生命科学学院生物基础实验教学中心 , 长春 130024)
摘　要　采用在线动态超声提取装置对全叶马兰果聚糖成分进行提取 , 用效应面方法优化了在线提取条件。
提取溶剂为纯水 ,待测样品为 5 mg , 提取条件为超声功率是 496 W , 溶剂流速 0.63 mL/ min , 溶剂体积 4.69
mL;用 96-孔盘联合酚硫酸程序对果聚糖进行高通量快速检测 , 果聚糖的加标回收率为 98.3%～ 105.7%, 相
对标准偏差为 2.9%～ 4.1%,全叶马兰果聚糖含量为 17.60%。 15 min 内可分析 24 个样品。试剂用量较常
规比色分析减少了 95%。本方法快速 、准确 , 特别适合天然植物资源生态学研究中数以百计的大样本统计调
查。
关键词　全叶马兰;果聚糖;高通量分析;在线动态超声提取;96-孔盘;苯酚
　2010-11-11收稿;2011-01-09接受
本文系国家自然科学基金项目(No.30770397)和东北师范大学生物学基地项目(No.J0830627)资助
＊ E-mai l:yangyf@nenu.edu.cn
1　引　言
全叶马兰(Kalimeris integ rifo lia)是菊科植物 ,其根部含有大量的果聚糖是重要的天然植物多糖 ,
具有抑制病原体在结肠内滋生[ 1] 、增加钙的吸收[ 2] 、防便秘[ 3] 和降低结肠癌风险[ 1] 等特殊功效 。
近年来 ,在线动态超声辅助提取日益受到重视[ 4] 。以往超声辅助提取多见于静态形式 ,动态超声辅
助提取植物多糖并不多见 。96-孔盘测试技术基于光度法[ 5] , 其多通道光路垂直照射 ,可在 6 ～ 10 s内
完成 96个样品的测试 。本研究采用在线超声提取与96-孔盘酚硫酸光度法联用进行全叶马兰中果聚糖
的高通量快速测定。应用效应面方法(RSM)优化了在线动态超声提取条件[ 6] ,比较了在线提取与离线
提取对果聚糖提取产率的影响;化学比色法与 96-孔盘比色法对果聚糖分析准确度及分析效率的影响。本
方法具有实验步骤少 、数据准确及分析效率高等优点。适用于植物多糖研究及柱色谱分离多糖的检测 。
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
PCR-680(美国 BIO-RAD公司);JY92-Ⅱ型超声波发生器机(宁波新芝科器研究所);BS-100A 自动部分
收集器(上海沪西分析仪器有限公司);BT01-100/YZ1515恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司)。
菊粉(Lnulun)标样(德国 Marck公司);浓 H2SO 4 和苯酚(分析纯)。果聚糖标准贮备液(1.00 g/
L)的制备:准确称取菊粉 0.0500 g ,用少量超纯水在 60 ℃水浴下充分溶解并定容至50 mL;5%(m/V)
苯酚 。
全叶马兰采集于松嫩草地 ,处于萌发期(4月)。新鲜植物样品于 105 ℃杀青 15 min后 ,80 ℃烘至
恒重 。取根部粉碎 ,过 40目筛 ,存放于干燥器中。
2.2　实验方法
2.2.1　在线动态超声提取程序　准确称取 0.00480 ～ 0.00500 g 样品装入样品腔内 ,按图 1所示连接
在线提取装置。操作流程为:调节蠕动泵的流速及超声发生器的功率 ,将样品腔放置在超声探头下 1
cm 处固定好 ,连接在线提取装置并检查是否有漏液处 ,同时启动蠕动泵 、超声发生器和时间计数器 ,根
据时间计数器准确定量接收样品中果聚糖提取液 4.7 mL 。
2.2.2　效应面方法(RSM)优化在线动态超声提取条件　RSM 用于果聚糖提取过程参数的优化 ,根据
三因素 、三水平的 Box-Behnken 实验设计 ,产生 17次组合实验(表 1)。根据预实验 ,固定提取样品用量
第 39 卷
2011 年 3 月　　　　　　　　 　　　
分析化学(FENXI H UAXUE)　研究简报
Chinese Journal of Analy tical Chemistry
　　　　　　　　 　　　 第 3 期
397～ 400
　图 1　在线动态超声提取系统
Fig.1　On-line dynamic sonica tion-assisted ex traction sy stem
(0.0050 g),规定在线超声提取过程中 3个重
要参数的优化范围:超声功率(180 , 360 和
540 W),提取溶剂体积(1 , 3 和5 mL)和溶剂
的流速(1 , 1.5和 3 mL/min)。每个自变量在
低 、中 、高实验水平分别以-1 , 0 , +1 编码。
Box-Behnken的实验设计及结果见表 1。每个
实验重复 3 次 ,但 5个中心点除外 。通常 ,一
个二次多项式方程的通式可由式(1)表示:
Y =β0 +∑
i
βiX i +∑
i
βiiX 2i +∑
i≠j
β ijXiXj (1)
式中 ,Y 是因变量(果聚糖产率), X i 和X j是自变量(过程参数), β0 是截距系数 , βl 是线性系数 , βii是
二次项系数 , βij是相互作用系数[ 7] 。
在模型中 ,用最小二乘法计算每个变量的系数;用 F 检验判断每个变量及模型的显著性(P <0.
05),方差分析评价各因子相互作用影响的显著性;统计模型的准确度由确定系数 R2 描述 。所有计算
程序由软件 Design Exper t So f tw are 7.1.3进行综合分析 ,建立数学模型并作出相应的三维变量曲面
图 ,对过程参数与果聚糖提取产率进行直观的量化分析 。
表 1　BBD 实验设计
Table 1　Box-Behnken experimenta l de sign
序号
No.
提取条件 Ext raction condi tion s
功率(X 1)
Pow er(W)
体积(X2)
Volume(mL)
流速(X 3)
Flow rate(mL/min)
提取率
Ex tract ion rate(%)
序号
No.
提取条件 Ex t raction condit ions
功率(X 1)
Pow er(W)
体积(X 2)
Volume(mL)
流速(X 3)
Flow rate(mL/min)
提取率
Ext raction
rate(%)
1 -1(180) -1(1) 0(1) 7.91 9 0(360) -1(1) -1(0.5) 8.51
2 +1(540) -1(1) 0(1) 10.18 10 0(360) +1(5) -1(0.5) 15.87
3 -1(180) +1(5) 0(1) 12.41 11 0(360) -1(1) +1(1.5) 11.12
4 +1(540) +1(5) 0(1) 16.84 12 0(360) +1(5) +1(1.5) 11.53
5 -1(180) 0(3) -1(0.5) 8.27 13 0(360) 0(3) 0(1) 15.58
6 +1(540) 0(3) -1(0.5) 15.63 14 0(360) 0(3) 0(1) 15.63
7 -1(180) 0(3) +1(1.5) 12.46 15 0(360) 0(3) 0(1) 14.69
8 +1(540) 0(3) +1(1.5) 10.54 16 0(360) 0(3) 0(1) 15.29
17 0(360) 0(3) 0(1) 14.98
　
2.2.3　96-孔盘酚硫酸比色定量分析方法
参考文献[ 8]的酚硫酸方法并进行改进 ,在 96-孔盘的每个孔中 ,平行3次加入标准溶液系列 5个浓
度点即 20 , 40 , 60 , 80和 100 mg/L 、空白试剂和样品溶液各 20 L ,加入 125 L 浓 H 2SO4 ,放入烘箱
中80 ℃加热 10 min取出 ,立即垂直快速加入 60 L 5%(m/V)苯酚溶液 ,放入 PCR-680 紫外-可见读
数器上测量 490 nm处的吸光值 。计算样品中果聚糖的含量 。
2.2.4　加热水提方法　准确称取 0.0490 ～ 0.0500 g 样品于 10 mL 比色管中 ,加入 8 mL 超纯水 ,置于
60 ℃水浴浸提 40 min , 然后加超纯水定容至 10 mL。其它比色测量步骤同上。
3　结果与讨论
3.1　在线动态超声提取实验条件的优化
应用效应面方法 ,根据 BBD设计了17次组合实验 , 得到在线动态超声提取的二次多项式回归方程:
Y = 15.42+1.51X1 +2.35X2 -0.34X3 1.84X21 -1.78X22 -1.90X23 +0.55X1X2 -2.32X1X3 -1.71X2X3 (2)
式中 ,Y 是果聚糖的提取产率 ,X 1 、X2 和 、X3 分别是在线动态超声提取系统中的超声功率 、溶剂体积和
溶剂流速。在线超声提取实验模型中 ,模型显著性的方差分析结果见表 2。F 值检验显示 ,模型方程是
极显著的(P<0.0001),说明模型的拟合程度很好;确定系数 R2 =0.9838 ,表明拟合模型中 98.38%的
变化在研究值范围内 ,仅有 1.62%的数据不能由模型解释。同时 ,校正系数 R2A dj =96.29%、相对标准
偏差 RSD=4.50%,表明此模型有较高的精密度和可靠性。说明应用该模型进行在线动态提取所得预
测果聚糖产率接近实际产率 ,优化的过程参数合理 。
398　　 分 析 化 学 第 39卷
由软件(Design Expert sof tw are7.1.3)绘制的 3-D效应曲面(图 2)解释了参数间的相互作用及获
得最大提取产率各参数的最佳水平 。图 2表明 , 当一个参数保持在中间水平(0)时 ,另两个参数对提取
率的影响 。由此得出最优化的超声功率为 496 W , 溶剂提取体积为 4.69 mL , 溶剂提取流速为
0.63 mL/min。最大的预测提取率为 17.77%。在优化的条件下 , 6 次平行实验的平均提取率为
17.60%。此结果与预测值基本一致 ,证明此优化提取模型是有效的 。
表 2　模型拟合统计分析
Table 2　F it statistics analy sis fo r model
项目
Item
标准偏差
SD
平均值
Mean
相对标准偏差
RSD(%) 确定系数R 2 校正系数R2Adj
模型准确度
Adeq.p recision
测定值 Value 0.58 12.79 4.50 0.9838 0.9629 18.770
图 2　提取变量对果聚糖产率影响的效应曲面的 3D 图
Fig.2　Response surface plots (3-D)show ing the effects of v ariable s(X 1:ult rasonic power;X 2 :flow ra te o f
so lvent;X 3:vo lume of solvent)on the re sponse Y (fructans y ield)
3.2　优化 96-孔盘酚硫酸比色定量分析方法
文献[ 8]提出的酚硫酸比色方法适用于常量化学分析 。因此 ,在应用酚硫酸程序于 96-孔盘时 ,考
察了温度 ,浓 H 2SO 4的体积和 5%(m/V)苯酚溶液体积对吸光值的影响 。
分别考察了 5个温度(50 、60 、80 、100和 110 ℃)时的吸光值。其它实验条件是 20 L 100 g/L 标
准溶液 ,150 L 浓 H 2SO4 及 50 L 5%(m/V)苯酚 。将 96-孔盘放入烘箱中实施不同温度。实验表明 ,
80 ℃时吸光值最大 ,故实验温度选为 80 ℃。
考察 50 , 75 , 100 , 125 , 150和175 L 浓H 2SO 4 时的吸光值影响。温度为80 ℃,其它实验条件同
上。实验表明 ,浓 H 2SO4 的体积为 125 L 时 ,吸光值最大 。
考察 20 , 40 , 60 , 80和 100 L 5%(m/V)苯酚时的吸光值 。浓 H 2SO 4 取 125 L ,其它实验条件
同上 。实验表明 ,5%(m/V)苯酚的体积为 60 L 时 ,吸光值最大 。在 490 nm 波长处测定果聚糖标准系
列溶液的吸光值 A ,得回归方程 A=0.0205+8.7913C ,相关系数 r=0.9994。在 20 ～ 100 mg/L 范围内线性
关系良好。
3.3　96-孔盘酚硫酸方法有效性的认证
在加标回收实验中 ,将 3个浓度水平的标准溶液(以蒸馏水为对照)平行测定 6次 ,按表 3所示加到
对照品及 0.0500 g 样品粉末中 ,充分混匀放置 24 h ,样品粉末用氮气流干燥 。根据空白信号的信噪比
(S/N =3)计算得出果聚糖的检出限为 10 mg/L ,回收率为 98.3%～ 105.7%,相对标准偏差为 2.9%～
4.1%。结果表明 ,本方法重现性较好 ,精密度较高 。
3.4　全叶马兰样品分析
从表 3可知 ,全叶马兰根部样品可溶性果聚糖含量为 17.60%(n=6),与预测结果 17.77%非常接
近。由此可见 ,全叶马兰可以作为果聚糖生产的优良植物资源。分析结果表明 ,在线提取与离线提取对
果聚糖提取率基本一致 ,但在线提取节省试剂和时间 ,减少对提取物的污染;化学比色法的重现性略好
于 96-孔盘比色法 ,但 96-孔盘的分析效率远远高于化学比色法 ,试剂用量节省了 95%。
399第 3 期 田尚衣等:在线超声提取 96-孔盘技术高通量快速测定全叶马兰中果聚糖成分 　　
表 3　方法的加标回收率及相对标准偏差
Table 3　Recovery and RSD(%)o f method(n=6)
样品果聚糖含量
Fructans conten t f rom
samples(%)
加入标准品糖浓度
C oncent rat ion of standard s
added(m g/ g)
实测糖含量
Sugar conten t
measured(%)
回收率
Recovery(%)
相对标准偏差
RSD(%)
17.60
10 22.88 105.7 3.5
20 27.53 99.2 4.1
30 32.34 98.3 2.9
　
References
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Dynamic Ultrasound-assisted Extraction and High-throughput
for Analysis of Fructans from Kalimeris Integri f olia
by 96-Well Format
T IAN Shang-Yi1 , 2 , WAN H ong-Zhi1 , HUANG Guo-H ui2 , YANG Yun-Fei＊1 , ZH ANG Yi-Fei1 , SH AO Shuai1
1(I nstituteo f Grassland S cience , Northeast Normal University , Key Laboratory of Vegetation Ecology ,
Ministry o f Education , Changchun 130024)
2(Central Laboratory of General Biology , School of Li f e Sciences , Northeast Normal University , Changchun 130024)
Abstract　An on-line method w as developed fo r the ex t raction and determina tion of f ructans in plant
samples.Fructans w as ex t racted w ith w ate r by ult rasound assisted , and direct ly introduced into a
well of 96-well fo rmat w hich w as reacted w i th concentrated sulphuric acid and 5% pheno l fo r fast
quanti fying f ructans.Response surface methodolog y (RSM)along wi th Box-Behnken design (BBD)
was applied to optimize the crit ical variables of the ext raction condit ions of dynamic ult rasound-
assisted ex t raction (DUAE)system for f ructans yield f rom Kalimeris integri f ol ia.Three factor s
such as ult rasonic pow er , f low rate of solventand volume of solvent w ere investig ated.The optimum
extract ion conditions w ere ult rasonic pow er 496 W , f low rate o f solvent 0.63 mL/min , and volume of
solv ent 4.69 mL .Under the se condi tions , the maximum fructans yield w as 17.60%.In addition , the
single-factor-test w as employed to optimize the majo r experimental paramete rs for the phenol-sulphu-
ric acid procedure on 96-well microplate.The calibration curves o f the propo sed method under the
optimised conditions corresponded very clo sely to a linear relationship(R ≥0.99)ove r the concentra-
tion range f rom 20 to 100 mg/L for inulin.RSD of the me thod w ere 2.9%-4.1%, re spectively.In
this study , only smal l amount of sample , i.e.5 mg , can meet the demand of the ex t ract ion.All of the
analysis steps we re completed in less than 15 min , and 96 samples could be analy sed in 1 h using a 96-
well format.
Keywords 　 K alimeris integri folia;Fructans;High-throughput analy sis;Dynamic ult rasoun-
dassisted ex t raction;96-Well fo rmat;Phenol
(Received 11 November 2010;accepted 9 January 2011)
400　　 分 析 化 学 第 39卷