全 文 ：中国农学通报 2012,28(16):202-207
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
太行菊[Opisthopappus taihangensis (Ling) Shih]是
菊科太行菊属(Opisthopappus Shih)的多年生宿根草本
植物，为中国特有，仅分布于太行山南部的河南省、河
北省和山西省交界处的局部山区。太行菊生境独特，
多生于海拔1000 m左右的山坡上、悬崖峭壁石缝中以
及峭壁下疏林内的岩石缝隙和土层瘠薄处。太行菊含
有菊糖，完全代替了淀粉作为多聚糖贮存，而且所含有
的倍半萜内酯类具有强心、抗癌、驱虫、镇痛等作用[1]。
太行菊也具有很高的观赏价值[2]，洁白的花朵在金秋
十月绽放于峭壁之上，被誉为“绝壁奇花”。此外，太
行菊是农业栽培植物菊花的野生近缘种，是菊花杂交
基金项目：国家自然科学基金“太行花种群历史动态及其亚种分化研究”(31170351)。
第一作者简介：何敏杰，女，1985年出生，河南兰考人，在读硕士，主要从事太行菊群体遗传研究。通信地址：450002河南省郑州市农业路 63号，
E-mail：heminjie1010@163.com。
通讯作者：王红卫，男，1969年出生，河南平舆人，副教授，博士，主要从事分子群体遗传学研究。通信地址：450002河南省郑州市农业路63号河南农
业大学植物保护学院，Tel：0371-63558170，E-mail：whwcas@yahoo.cn。
收稿日期：2012-01-17，修回日期：2012-04-05。
太行菊DNA提取和 ISSR标记的筛选与优化
何敏杰 1，程月琴 1，王红卫 1，郭长宁 1，叶永忠 1，孟 丽 2
（1河南农业大学，郑州 450002；2河南科技学院，河南新乡 453003）
摘 要：为了探索太行菊DNA的适宜提取方法，获得适用于太行菊的 ISSR标记，以太行菊为试验材料，
采用常规CTAB法、改良CTAB法和SDS法提取太行菊总DNA，利用提取的太行菊DNA对 ISSR引物进
行了筛选和优化。结果表明，改良CTAB法提取的DNA产率高且稳定，无明显降解，杂质少。以改良
CTAB法提取的DNA为模板，应用 ISSR引物对总DNA进行扩增，进而从测试的50条 ISSR引物中选出
了扩增效率高，条带丰富的15条引物。通过设置温度梯度对每条引物的反应条件进行了优化。最后，
使用引物UBC848对部分群体样品进行检测，得到了效果稳定、重复性好的扩增结果。上述结果表明，
通过温度梯度筛选出的 ISSR引物适用于太行菊的群体遗传学研究。
关键词：太行菊；DNA提取；ISSR；条件优化
中图分类号：S58，S682 文献标志码：A 论文编号：2012-0154
DNA Extract, Screening and Optimization of ISSR Markers for Opisthopappus taihangensis
He Minjie1, Cheng Yueqin1, Wang Hongwei1, Guo Changning1, Ye Yongzhong1, Meng Li2
(1Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;
2Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang Henan 453003)
Abstract: To find a DNA extract method suitable to Opisthopappus taihangensis and obtain a few ISSR
markers for O. taihangensis, the total DNA was isolated from the O. taihangensis by the common CTAB method,
improved CTAB method and SDS method, then O. taihangensis DNA as template, ISSR primers were screened
and the PCR conditions were optimized. The results showed the improved CTAB method got a high production
rate of the extracts, and that was pure with little degradation. These productions were good templates for ISSR
molecular markers. Then, out of 50 ISSR primers, 15 ISSR primers were screened which could generate clear,
stable bands. By setting gradient temperatures for each primer, reaction conditions were optimized. Eventually,
population samples were detected by primer UBC848, clear and stable bands were gotten. These results showed
the selected ISSR primers were suitable for the study on population genetics of O. taihangensis.
Key words: Opisthopappus taihangensis; DNA extraction; ISSR; condition optimization
何敏杰等：太行菊DNA提取和 ISSR标记的筛选与优化
育种较为理想的遗传材料[3]。由于植被破坏而导致的
生境改变,加上人为采摘严重，其分布范围持续缩减，
植株数量日益减少，被河南省列为珍稀保护植物 [4]。
为了制定适宜的保护策略，确定适当的保护单元，急需
对太行菊遗传多样性和遗传结构进行研究，而高质量
的太行菊DNA和适宜的分子标记是进行群体遗传研
究的前提。
自从微量叶片提取DNA[5]的方法开发以来，CTAB
法被广泛地应用到植物DNA的提取。Tian等[6]采用优
化的 CTAB法从 Pinus kwangtungensis松针中提取出
适用于线粒体序列分析的DNA样品，Wang等[7]通过改
进的CTAB法提取出高质量的太行花叶片总DNA，适
用于核基因组的 ISSR标记，而Zhang等[8]则通过CTAB
法提取了瑶山苣苔的叶片总DNA，以此为模板对核基
因组 SSR引物成功进行了扩增检测。基于不同植物
种类中含有的次生物质的差异，在使用CTAB法提取
DNA时都要经过优化和改进。笔者旨在通过比较常
规CTAB法、改良CTAB法和SDS法提取太行菊DNA
的效果，探索适宜太行菊DNA提取的方法。在此基础
上筛选出适合于太行菊的 ISSR分子标记，为进一步开
展太行菊的保护遗传学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
试验于 2011年在河南农业大学植物保护学院植
物科学实验室进行。
1.2 试验材料
叶片材料采集于太行山区太行菊的自然群体。为
了便于保存，采集的新鲜叶片使用硅胶快速干燥，叶片
干燥的程度达到用手指捻时发出噼啪声。叶片完全干
燥后常温保存，不定时查看，一旦发现硅胶由蓝色变为
紫红色，及时更换。
1.3 试验方法
1.3.1 太行菊总DNA提取方法筛选及优化
（1）常规CTAB法。除硅胶干燥太行菊叶称取量
为 0.12 g，DNA用 100 μL 0.1×TE溶解外，其他步骤参
见邹喻苹等[9]的方法。
（2）SDS法。除硅胶干燥太行菊叶称取量为
0.12 g、DNA用 100 μL 0.1×TE溶解外，其他步骤参见
陈德福和陈喜文[10]的方法。
（3）优化CTAB方法。
①粉碎样品。称量 0.12 g左右的样品，加PVP干
粉0.03 g，充分研磨，迅速转移到2 mL的离心管中。
②清洗除杂。加CTAB提取液 800 μL，β-巯基乙
醇10 μL，冰浴15 min，10000 r/min离心10 min，弃上清
液。沉淀物重复清洗除杂1次。
③溶出DNA。加入850 μL的CTAB提取液，混匀
沉积物，在 65℃的水浴锅中热浴 50 min，其中每隔
10 min左右，轻微摇动离心管，加速DNA的溶出。热
浴后取出，加入 110 μL 5 mol/L的KAc，冰浴 30 min，
10000 r/min离心10 min。
④抽提。用移液枪吸取上清液于另一只 2 mL离
心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，上下颠倒离
心管混匀20 min。4℃下，10000 r/min离心10 min。
⑤再抽提。取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇
(24:1)，颠倒离心管混匀15 min。4℃下，10000 r/min离
心10 min。
⑥沉淀DNA。取上清液于1.5 mL的离心管中，加
入等体积 -20℃预冷的异丙醇，室温静至 30 min，使
DNA充分凝聚沉淀。
⑦洗涤 DNA。静止后，4℃下 8000 r/min离心
10 min。弃去上清，加入75%乙醇500 μL，轻轻颠倒离
心管 10 min，4℃下 10000 r/min 离心 10 min，弃去上
清。用75%乙醇500 μL重复洗涤1次。
⑧DNA风干溶解。将含有DNA的1.5 mL离心管
打开口，风干后加入0.1×TE 100 μL，溶解，混匀后即为
母液，贮存待用。
1.3.2 DNA检测 采用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的
DNA。取2 μL DNA母液加1 μL 6×Loading buffer，混匀
后点样。0.8%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，5 V/cm
的电压下电泳30 min左右。待染料到达胶面的2/3时
取出，放入EB溶液中染色 10 min，然后在紫外成像系
统UVP上拍照分析。用DNA Marker 2000作对照，根
据DNA条带的相对亮度来估测太行菊DNA样品的
浓度。
1.3.3 引物筛选及扩增条件优化 叶绿体DNA具有较
高的进化保守性，据此特性设计出的一些特异性引物
广泛适用于种子植物的群体遗传学研究[11]。因此，笔
者选用叶绿体通用引物Trnlc-Trnld对提取的太行菊总
DNA的适用性进行检测。
（1）反应体系20 μL。DNA模板20~50 ng，叶绿体
DNA引物Trnlc 1 μL (5 μmol/L)、Trnld 1 μL (5 μmol/L)、
Taq mix 10 μL、ddH2O 7 μL。
（2）扩增程序。94℃预变性 4 min，94℃变性 40 s，
50℃退火40 s，72℃延伸90 s，37个循环，最后72℃延伸
10 min，4℃保存。
（3）扩增产物检测。取 PCR 产物 5 μL，DNA
Marker 2.5 μL，于 1%琼脂糖凝胶（含 0.5 μg/mL EB）电
泳，紫外成像系统UVP上观察照相。
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选用上述适用性检测时，能扩增出清晰条带的太
行菊样品为模板筛选 ISSR引物，引物参照加拿大哥伦
比亚大学UBC公司公布的 ISSR序列，由上海生工有
限公司合成。参照上海生工合成 ISSR引物时给定的
Tm值进行全部 ISSR引物的扩增预筛选。20 μL扩增
体系包含模板DNA 20~50 ng，引物1 μL (5 μmol/L)，2×
Taq Mix 10 μL（北京美莱博 MTO-1009），ddH2O
8 μL。扩增程序为 94℃预变性 4 min，94℃变性 40 s，
Tm数值（上海生工合成 ISSR引物时给定的解链温度）
退火 40 s，72℃延伸 90 s，37个循环，最后 72℃终延伸
10 min，4℃保存。扩增产物检测时取PCR产物15 μL，
DNA Marker 3 μL作为参照，于 1.0%琼脂糖凝胶（含
0.5 μg/mL EB）电泳。
根据扩增条带的清晰度和数量，初步选定 ISSR引
物，然后根据初选引物的 Tm值设置退火温度梯度
(44~56℃)，确定每一引物的适宜退火温度。
1.3.4 部分群体样品的PCR扩增 使用筛选出的 ISSR
引物及优化的扩增条件，对太行菊部分样品进行PCR
扩增。取 PCR扩增产物 15 μL，100 bp DNA Marker
5 μL作参照，于 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成
像系统上照相分析。
2 结果与分析
2.1 太行菊DNA的提取和适用性检测
2.1.1 太行菊 DNA方法比较 常规 CTAB法提取的
DNA难以溶解完全，轻微褐化，溶解液中存在不溶物；
SDS法提取的DNA溶解后较为粘稠，用枪头不易吸
取，可能有多糖及酚类残留（无法得到正常的检测图
像）；改良CTAB法提取出的DNA溶液清亮，易溶解，
无粘稠感。
从琼脂糖凝胶电泳结果（图 1）可以看出，优化
CTAB方法提取的DNA条带清晰，降解轻微；点样孔
内大都无亮点，蛋白去除比较完全。
2.1.2 太行菊DNA适用性检测 以优化CTAB法提取
的太行菊总DNA为模板，使用种子植物通用叶绿体引
物Trnlc-Trnld进行 PCR扩增，得到了扩增效率高、特
异性强的产物（图 2）。这说明优化CTAB法提取的总
DNA完整性高，质量好，能满足后续试验的要求。
2.2 ISSR引物的筛选和优化
根据引物筛选的方法和步骤，选用叶绿体引物扩
增效果好的DNA工作液为模板，从50条 ISSR引物中
选出了扩增效果稳定、谱带清晰的 15条引物。随后，
设置 5个温度梯度 (43.9℃、46.4℃、50.7℃、53.5℃、
55.7℃)对引物的适宜退火温度进行了检测（图 3），最
后确定出每条引物的最佳退火温度。例如，引物
UBC848在 43.9℃和 46.4℃下都扩增出了 3条谱带，
50.7℃和 53.5℃时分别产生了 4条和 5条清晰谱带，而
在55.7℃下只扩增出1条清晰带，因此最后确定53.5℃
为该引物的适宜退火温度（图3）。筛选出的15条引物
在适宜退火温度下都扩增出多条产物带，条带大小集
中分布于 200~2000 bp，经重复检验，这些条带清晰而
M：分子标记；1~14：太行菊样品
图1 优化CTAB法提取的太行菊总DNA检测结果
M：分子标记；1~16：太行菊样品
图2 太行菊总DNA的叶绿体引物(Trnlc-Trnld)扩增结果
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
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何敏杰等：太行菊DNA提取和 ISSR标记的筛选与优化
稳定。
笔者的研究表明，大多数 ISSR引物的适宜退火温
度低于其 Tm（表 1）。在筛选出的的 15个 ISSR引物
中，有 13 个引物的适宜退火温度低于 Tm，只有
UBC825和UBC826的适宜退火温度比其Tm高。适
宜退火温度和Tm的差值在不同的引物中差别很大，
差值最大者为UBC841，退火温度低于Tm 10℃；差值
最小者有UBC845和UBC850，退火温度与Tm相差不
到1℃。ISSR引物扩增条带数在4~6，其中扩增出5条
的引物有 9个，占总数的 60%，产物为 4条谱带的有 4
个，只有2个引物扩增出了6条谱带。
2.3 部分群体样品的PCR扩增检测结果
随机使用筛选出的引物UBC848和优化退火温度
对太行菊部分群体样本进行了检测（图4）。所测试的
16个样品，除 8号和 11号样品由于模板的问题（质量
或浓度）没有得到理想结果外，其他个体的扩增条带数
在 4~9条不等，14个样品共检测到 15个清晰谱带，各
条带分子量在 200~2000 bp，经重复试验，这些条带清
晰稳定，重复性好。上述结果表明，筛选出的 ISSR引
物适合于太行菊的群体遗传性研究。
3 结论
（1）改良 CTAB法为太行菊DNA提取的适宜方
法，由此法提取的太行菊总DNA产物中蛋白、脂类和
多糖等杂质含量少，产物易溶解，溶解后的溶液清亮无
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
900 bp
800 bp
600 bp
500 bp
300 bp
ISSR引物UBC826 ISSR引物UBC848 ISSR引物UBC850
1~5：温度梯度43.9℃、46.4℃、50.7℃、53.5℃、55.7℃；M：分子标记
图3 部分 ISSR引物温度梯度扩增结果
引物名称
UBC807
UBC825
UBC826
UBC827
UBC830
UBC834
UBC841
UBC842
UBC844
UBC845
UBC847
UBC848
UBC850
UBC857
UBC884
引物长度/bp
17
17
17
17
17
18
18
18
18
18
18
18
18
18
17
引物序列(5—3)
(AG)8T
(AC)8T
(TC)8C
(TC)8G
(TG)8G
(AG)8YT
(GA)8YC
(GA)8YG
(CT)8RC
(CT)8RG
(CA)8RC
(CA)8RG
(GT)8YC
(AC)8YG
HBH(AG)7
解链温度/℃
52.18
52.18
54.59
54.59
54.59
53.88
56.16
56.16
56.16
56.16
56.16
56.16
56.16
56.16
52.98
退火温度/℃
53.5
50.7
55.7
50.7
50.7
50.7
46.4
50.7
50.7
55.7
53.5
53.5
55.7
50.7
50.7
扩增条带数/条
4
5
5
5
5
5
5
6
4
5
4
5
5
4
6
表1 ISSR引物序列、退火温度及扩增条带数
注：Y=(T,C)，R=(A,G)，H=(A,G,T)，B=(C,G,T)。
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颜色，无粘稠感。同时提取的DNA降解少，这种高质
量的DNA适宜于后续的分子操作，如酶切、PCR扩
增等。
（2）筛选出15条适宜于太行菊的 ISSR引物，并且
对这些引物的退火温度进行了优化。利用适宜的退火
温度15条引物在太行菊总DNA样品中扩增出重复性
好，清晰而丰富的DNA条带，为太行菊群体遗传学研
究打下坚实的基础。
（3）改良CTAB法提取的太行菊总DNA中有较完
整的细胞质（叶绿体）DNA，因此也适宜于细胞质遗传
标记的检测和分析。
4 讨论
4.1 太行菊总DNA提取
DNA提取方法主要有十二烷基磺酸钠(SDS)法、
十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法、酚氯仿法、PVP法、
硅土法等。针对植物组织而言，CTAB法更为常用，在
常规CTAB法的基础上，针对不同材料特点及试验方
法进行改进的报道很多。借鉴前人的结果，应用于太
行菊总DNA提取的改良CTAB法主要有以下几方面
的改进：（1）水浴充分裂解细胞前，加CTAB提取液冰
浴30 min，使得部分细胞破裂，且细胞内多糖、蛋白、酚
类等次生物质经冰浴后沉到离心管的底部，有利于提
纯；（2）加入 5 mol/L KAc冰浴 30 min的步骤，有效的
去除了蛋白质[9]和多糖[12]；（3）提取过程适当加大β-巯
基乙醇、PVP等防氧化剂用量，有效地防止组织褐化现
象发生[13]，PVP同时能有效去除多糖[14]，且β-巯基乙醇
和PVP配合使用，能够有效地防止多酚污染[15]；（4）在
加入预冷异丙醇沉淀DNA过程中，由-20℃下 30 min
改为室温30 min，提高了沉淀温度，减少了部分杂质的
沉淀；另外，在沉淀结束后离心过程中，离心力由
12000 r/min改为 8000 r/min，降低离心速度，也能防止
酚类、多糖、单宁等次生代谢物质与DNA一起沉淀。
上述改进步骤显著减少了杂质的沉淀，虽然也降低了
太行菊DNA的产率，但其效率并没有低于其他2种方
法。常规CTAB法所提DNA不能完全溶解，一部分
DNA会包裹在沉淀中，SDS法提取的DNA与多糖、单
宁等结合成粘稠的胶状物，这些因素都降低了DNA可
利用率。因此，采用改良 CTAB法提取的太行菊总
DNA降解小、质量高，经叶绿体引物和 ISSR引物检测
适宜进行后续的群体遗传学研究。
4.2 ISSR引物的筛选和退火温度的优化
ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat) 是
Zietkeiwitcz等[9]于1994年在微卫星基础上发展起来的
一种分子标记。其基本原理是：用锚定的微卫星DNA
为引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2~4个随机
核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退
火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间
DNA片段进行 PCR扩增。与RAPD相比，ISSR技术
采用了较长的引物，具有更强的专一性，与模板结合的
强度提高，降低了杂带的干扰，提高了试验的可重复
性，结果更可靠，同时具备RAPD的优点。与RFLP、
AFLP相比，ISSR所需DNA模板的量少；等位变异特
别丰富，多态性高，试验成本低；稳定性，安全性较高，
操作简单。与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信
息，开发成本更低。另外，ISSR引物可在不同的物种
间通用。因此，ISSR分子标记在群体遗传和种质资源
的研究中得到广泛应用[7,16-17]。通过研究，笔者筛选出
适宜于太行菊群体遗传研究的15条 ISSR引物。
Taq mix开发和应用减少了 PCR试验操作步骤，
大大降低了分子群体遗传试验的工作量，使工作效率
得到明显提高。在使用Taq mix进行 PCR扩增时，由
于DNA聚合酶含量、镁离子浓度、底物含量均为恒定
1500 bp
1000 bp
700 bp
500 bp
100 bp
200 bp
300 bp
M：分子标记；1~16：太行菊样品
图4 ISSR引物UBC848对部分太行菊样品的扩增结果
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何敏杰等：太行菊DNA提取和 ISSR标记的筛选与优化
值，适宜退火温度就成为能否得到理想扩增效果的决
定因素。笔者以 ISSR引物的Tm值为基础，设置跨度
为12℃的温度梯度区间，在保证其他所有条件都一致
的前提下，检测每一梯度温度的扩增效果，最后确定适
宜的退火温度。由此得到的退火温度在群体测试中获
得了扩增效率高、重复性好的良好结果，适宜于进行后
续的群体遗传学研究。
尽管在个体检测时，笔者所筛选出 ISSR引物在适
宜退火温度下只有 4~6条谱带，但这并不影响这些引
物在群体遗传研究中的应用。例如，个体水平上，
UBC848在最适宜的退火温度下只获得了5条PCR扩
增条带，但当使用群体样品时却检测到总数为15的清
晰条带，并且在所测试的 16个样品中，个体的扩增条
带数在 4~9条不等，这些数据可以满足后续相关的群
体遗传分析。
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