全 文 ：第4期
药用植物珠子参新鲜块根 DNA提取方法研究 *
杨维泽 1，史云东 2，许宗亮 1，杨绍兵 1，张金渝 1△
（1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明 650231；2.玉溪师范学院化学与环境科学系，云南玉溪 653100）
摘要：目的 为获取珠子参高质量、高产量的总 DNA，满足 SSR-PCR标记实验。方法 采用经典 CTAB法、改
良 CTAB法、高盐低 PH法和 SDS法对珠子参总 DNA提取方法进行比较研究，用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA质量。结果 4种方法中产量最高的为经典 CTAB法，产率为 149.533ng/g，纯度最高的为改良 CTAB
法，OD260/OD280为 1.796。结论 4种方法提取的 DNA质量均满足 SSR-PCR标记实验，扩增效果改良 CTAB法和
SDS法效果最佳。
关键词：珠子参；DNA提取；SSR扩增
中图分类号：R284.2文献标志码：A 文章编号：1000-2723（2014）04-0025-04
*基金项目：国家自然科学基金项目（81260610）；国家农业部公益性行业专项（201303117）
收稿日期：2014-04-17
作者简介：杨维泽（1982-），男，云南禄劝人，助理研究员，主要从事药用植物资源研究。
△通信作者：张金渝，E-mail：jyzhang2008@163.com
JournalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine
云南中医学院学报第37卷第4期
2014年8月
Vol. 37 No. 4
8. 2014
珠子参（Panax japonicus C .A .Mey . var .major
（Burk .）C.Y.Wu et K.M.Feng）为五加科（Araliaceae）
人参属（Panax）植物，是名贵中药材珠子参的基源植
物之一，具有补肺养阴，祛瘀止痛，止血等功效，用于
气阴两虚，烦热口渴，虚劳咳嗽，跌扑损伤，关节痹
痛，咳血，吐血，衄血，崩漏，外伤出血等症[1]。主产于
云南、贵州、四川、陕西、湖北和甘肃等地，属于名贵
且常用的中药材之一，是白族、纳西族、傈僳族、藏
族、彝族等少数民族的传统用药[2]。研究表明，珠子参
药材中主要含有较高的皂苷类成分[3-8]，挥发油[9]，脂溶
性化学成分[10]，微量元素[11-13]，糖蛋白[14]，氨基酸[13，15]等
化学成分；随着科学研究的深入，人们对珠子参确切
疗效的发现，珠子参药材的用量在逐年增加，价格也
在快速上涨，而珠子参药材来源仅限于野生采挖，赵
仁[2]等的研究认为珠子参野生资源已经处于高度濒
危状态，开展人工栽培是保护珠子参野生资源的有
效途径，开展分子标记实验有助于掌握珠子参的遗
传基础，有助于开展人工育种工作。
提取高质量的基因组 DNA是有效开展分子生
物学研究的前提[16]，珠子参块根中富含皂苷类成分、
挥发油、脂溶性化学成分、糖蛋白等，较难获得高质
量的总 DNA。为了提取到高质量的珠子参 DNA，本
研究采用经典 CTAB法、改良 CTAB法、高盐低 PH
法和 SDS法对珠子参总 DNA的提取进行比较，确
定高质量高产率的珠子参 DNA，为今后珠子参遗传
多样性分析、遗传图谱的构建及基因定位等研究奠
定基础。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
供试材料于 2010年 7月，来自于取自大理州
鹤庆县草海镇马厂自然村的野生植株的块根，材料
选取时选取植株较大，植株完整的材料，以保证所
用实验材料均来自同一植株，消除不同植株间的差
异，选定植株，挖出块根、洗净、水气晾干后，放入冰
壶中带回实验室，放入-70℃冰箱保存备用。
1.2 所需试剂及仪器
所需试剂为 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化
铵）、3%SDS（十二烷基苯磺酸钠）、EDAT-Na2（乙二
胺四乙酸二钠）、Tris碱（三羟甲基氨基甲烷）、HCl
（盐酸）、KAc（醋酸钾）、异戊醇和氯仿溶液（24 ∶1）
等。所需仪器为 Eppendorf 台式高速冷冻离心机
（5430R）、水浴锅、冰箱、摇床、凝胶电泳仪、西盟凝
胶成像仪（Bio -Best 200E）、Eppendorf 移液器和
Bio-Rad iCycler PCR仪、灭菌锅等。
1.3 方法
查阅文献，根据珠子参块根富含皂苷类成分、
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挥发油、脂溶性化学成分、糖蛋白等的特点，确定了
4种提取方法，每种方法 3个重复。
1.3.1 经典 CTAB法[17]
每个重复取 0.5g珠子参块根放入研钵充分研
磨、加入 1 200μL 65℃预热的 2%CTAB提取缓冲液
混匀，转移至另 1.5mL的 Eppendorf离心管后置于
65℃的水浴锅水浴 30min，每个 10min轻轻颠倒混
匀；取出放入离心机 12 000rpm离心 10min，转移上
清液至另一个 1.5mL Eppendorf离心管，加入等体
积氯仿/异戊醇（24∶1）溶液，轻轻反复多次混合，使
管内溶液呈乳浊状，12 000rpm离心 10min；转移上
清液至另 1.5mL的 Eppendorf离心管，加入等体积
的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃下放置至有白色
絮状沉淀出现，取出离心管放入离心机，10 000rpm
离心 10min，弃上清液，用 400μL 75%的乙醇洗 2
次，7 000rpm离心 3min弃上清液，然后再用 400μL
无水乙醇洗，7 000rpm离心 3min弃上清液，然后置
于空气中干燥；待沉淀物干燥后溶于 100μL的 TE
溶解，待溶解后放入-20℃的冰箱保存备用。
1.3.2 改良 CTAB法
每个重复取新鲜珠子参 0.5g 分别放入研磨中
加入少许石英砂和 PVP，加入 1.2mL的 Buffer去多
糖和 24μL β-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研
磨好的珠子参粉末装入 1.5mL Eppendorf 离心管
中；10 000rpm离心 10min弃上清液；1.5mL 离心管
中加入 600μL 65℃预热的 CTAB 提取缓冲液同时
加入 24μL β-巯基乙醇，用毛细玻璃管搅拌充分；
迅速将 1.5mL离心管置于 65℃水浴中保温 60min，
每隔 15min轻轻颠倒混匀；待冷至室温后，取出
1.5mL 离心管，每管加入 240μL KAc，放入-20℃冰
箱 1h；然后 10 000rpm离心 10min；小心将上清液相
转移至另一只干净的 1.5mL离心管中，加入等体积
的氯仿/异戊醇（24∶1）溶液，放入垂直振荡器中充分
混匀 10min，放入离心机 10 000rpm离心 10min；转
移上清液至另一 1.5mL离心管中，加入-20℃冰箱
预冷的异丙醇 640μL，放入-20℃冰箱冷冻 1h；取出
后在 10 000rpm离心 10min沉淀 DNA，清洗方法和
保存方法同经典 CTAB法。
1.3.3 SDS法[17]（略有改动）
每个重复取新鲜珠子参 0.5g 放入研磨中加入
1 200μL 3%SDS提取缓冲液，并加入 240μL β-巯
基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉
末装入 1.5mL 离心管中；65℃水浴保温 60min，每
15min轻摇一次；待冷却后加入 230μL 5mol/L KAc，
混合后冰浴 60min；取出后 10 000rpm离心 10min，
将上清液转移至另一只 1.5mL离心管中，加入等体
积的氯仿/异戊醇（24∶1）溶液，然后放入垂直振荡器
中充分混匀 10min；取出后 10 000rpm离心 10min；
转移上清液至另一干净的 1.5mL 离心管中，加
入-20℃冰箱预冷的异丙醇 600μL溶液混匀，放入-
20℃冰箱冷冻 60min；取出后在 10 000rpm 离心
10min 沉淀 DNA；清洗方法和保存方法同经典
CTAB法。
1.3.4 高盐低 pH法[18]（略有改动）
每个重复取新鲜珠子参 0.5g放入研磨中加入
1200μL高盐低 PH值提取缓冲液，充分研磨成粉
末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入 1.5mL离心管
中；65℃水浴保温 60min，每 15min 轻摇一次；取出
后放入离心机 10 000rpm离心 10min，将上清液转
移至另一只 1.5mL 离心管中，加入 600μL KAc
溶液，然后混匀，放入-20℃冰箱冷冻 60min；取
出 10 000rpm离心 10min；转移上清液至另一干
净的 1.5mL 离心管中，加入 600μL 预冷的异丙
醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻 60min；取出后
在 10 000rpm离心 10min沉淀 DNA；弃上清液，用
75%的乙醇洗 2次，离心机 7 000rpm离心 3min沉
淀 DNA，清洗方法和保存方法同经典 CTAB法。
1.4 DNA质量检测
取 5uL DNA 溶液用蒸馏水稀释 200 倍后，在
UV-759 紫外分光光度计上测量 DNA 浓度以及
OD260/OD280的比值。取 2μL DNA样品在 3%的琼
脂糖凝胶上电泳，核酸染料染色，西盟凝胶成像仪
（Bio-Best 200E）观察、拍照。
1.5 SSR标记分析
为验证 4种提取方法提取的 DNA样品在 SSR
标记实验中的适应性，将上述提取的 DNA样品，由
上海生工合成，自于西洋参前引物为 5′ATTG－
GAAGGCAGGCAGCCCC 3′ 和 后 引 物 为 3′
GGTCGCGGCCGAGGTACTTT 5′，PCR 反应体系
（25μL） 包括 PCR 缓冲液 10 ×的 buffer 缓冲液
2.5μL，25mmol·L-1的 MgCl2（2μL），0.1U的 TaqDNA
聚合酶（2μL），0.1Umol·L -1 的 dNTPs（2μL），上下
游引物各 0.1Umol·L-1 的 1μL，20ng 左右的珠子
参 DNA模板 1μL，无菌扩增水 13.5uL，在 Bio-Rad
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第4期
iCycler PCR仪，扩增体系为：94℃预变性 5min，94℃
变性 45 s，55℃退火 30s，72℃延伸 90s，36 个循环，
72℃延伸 7min，扩增 36个循环。扩增后产物 25μL加
2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀，用6.0%的非变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳，分离扩增产物，检测所设计引物可用
性和多态性。电泳液为 1×的 TBE缓冲液，电压 200 V，
电泳时间 2.5 h，参照李晓辉[19]等硝酸银法显色，检测扩
增产物，用扫描仪扫描图板、拍照、保存图片。
2 结果与分析
2.1 DNA的纯度与质量
2.1.1 紫外分光光度检测
4种提取方法提取的 DNA 在 UV-759 紫外分
光光度计下，在 OD260、OD280检测的结果见表 1。
高纯度的 DNA的 OD260/OD280应 1.8，高于 1.8则
可能有 RNA污染，低于 1.8可能有蛋白质污染[20]，
由表 1可以看出，改良 CTAB法提取的 DNA质量
最好，其 OD260/OD280 在 1.796，最为接近纯的
DNA的 1.8，其次为高盐低 PH值法，最差的为 SDS
法，说明在提取过程中改良 CTAB法在提取过程中
蛋白质和多糖去除得最彻底，SDS 法杂质最多；从
DNA的产量来看，CTAB法提取 DNA产量最高，其
次为改良 CTAB法，最低的为 SDS法。
2.1.2 琼脂糖凝胶检测
3%的琼脂糖凝胶电泳结果见图 1。从 DNA电
泳结果显示，采用 CTAB法提取的基因组 DNA条
带最明亮，但有拖尾现象，SDS法提取的条带最不
清晰，效果最好的为改良 CTAB和高盐低 PH值法。
说明改良 CTAB法和高盐低 PH值法适合提取富含
多糖和蛋白质的珠子参块根材料。
2.2 SSR标记分析
SSR-PCR扩增产物在 6%的非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳结果见图 2，由图 2可以看出，4种提取方
法所提取的新鲜珠子参材料的 DNA均能满足 SSR
标记实验，从效果来看改良 CTAB法、SDS法 2种提
取方法所提取的材料的扩增条带清晰，且杂带较
少，其次为 CTAB法提取的材料目标条带清晰，但
杂带相对较多，高盐低 PH值法扩增的效果也较好，
说明，4种提取方法所提取的珠子参 DNA质量都能
满足 SSR标记实验，也同时说明了 SSR标记实验对
植物 DNA的质量要求不是很高。
3 讨论
分子标记实验能否成功，前提是 DNA质量的
好坏，因此制备 DNA是非常重要的一个基础环节。
DNA中多糖、多酚、色素，都会严重影响 DNA聚合酶
的活性，导致 DNA的不可溶解，不利于 PCR扩增[21]。
4种提取方法中，CTAB法提取的产量最高，但质量
相较于改良 CTAB 法和高盐低 PH 值法的纯度较
低，改良的 CTAB法中加入了 PVP和 β-疏基乙醇，
王卓伟[22]等曾经报道 PVP在桑叶 DNA提取过程中
有去除多糖的作用，是一种吸附剂和澄清剂，能有
效吸附多糖；β-疏基乙醇是一种还原剂和抗氧化
剂，能除去色素，防止酚类氧化，保证了 DNA质量，
从而使 SSR标记实验能顺利进行。
根据实验材料珠子参的特性，富含皂苷类成
分、挥发油、脂溶性化学成分、糖蛋白，设计 DNA提
取方法时要选择能有效去除多糖、蛋白和固醇类的
注：M为 Marker，A、B、C、D分别为经典 CTAB法、改良
CTAB法、SDS法和高盐低 PH法。
图 1 4种提取方法总 DNA的凝胶电泳图
注：M为 Marker，A、B、C、D分别为经典 CTAB法、改良
CTAB法、SDS法和高盐低 PH法。
图 2 4种提取方法 PCR产物聚丙烯酰胺电泳图
表 1 4种方法提取总 DNA的纯度和产量
149.533
136.467
方法 OD260 OD280 OD260/OD280
CTAB 0.075 0.042 1.762
高盐低 PH值 0.068 0.038 1.778
140.600改良 CTAB 0.070 0.039 1.796
SDS 0.062 0.036 1.730 123.733
DNA产量/（ng/g）
杨维泽等：药用植物珠子参新鲜块根DNA提取方法研究
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2014年 云南中医学院学报 第37卷
Comparision among Four Methods of DNA Extraction from Chinese
Herbal Medicine which Panacis majoris
YANG Wei-ze1，SHI Yun-dong2，XU Zong-liang1，YANG Shao-bing1，ZHANG Jin-yu1
（1. Institute of Medicinal Plant，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650231，China；
2. College of resources and Environment which Yuxi Nomal School，Yuxi 653100，China）
ABSTRACT：Objective To get the high quality and high yield of total DNA from Panacis majoris. Methods Used the methods
CTAB，improved CTAB，SDS and high salt low PH extraction the total DNA，The quality of the DNA was examined with
spectrophotometer and agarose gel electrophocesis. Results The results showed that the highest yield was CTAB，productive rate is
149. 533ng/g，the best quality is improved CTAB，OD260/OD280 IS 1. 796. Conclusion The total DNA from the four extraction
methods，all can used the SSR marker，the best effect was improved CTAB and the SDS.
KEY WORDS：Panacis majoris；DNA extraction；SSR amplification
方法，本次实验所选用的 4种方法，均具有较好的
取多糖、去蛋白等的作用，从实验结果来看，改良
后的 CTAB法的提取质量最高，产率也较高，CTAB
法的产量次之，但质量相对较差，因此在选择提取
方法时可以根据自己的实验目的进行选择，选择产
率高的提取方法，还是质量高的方法，在珠子参
DNA 提取上，建议要求高质量的 DNA 选择改良
CTAB 法，要求高产率但质量要求不高，则选择经
典 CTAB法。
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（编辑：杨阳）
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